Молекулярно генетические механизмы регуляции пролиферации клетки. Возможные механизмы регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза у клеток нейробластомы. Регуляция регенерации тканей

Клеточный цикл – это период жизни клетки от одного деления до другого или от деления до смерти. Клеточный цикл состоит из интерфазы (период вне деления) и самого клеточного деления.

В конце G1 периода принято различать специальный момент, называемый R‑точкой (точка рестрикции, R‑пункт), после которого клетка обязательно в течение нескольких часов (обычно 1–2) вступает в S период. Период времени между R‑точкой и началом S периода можно рассматривать в качестве подготовительного для перехода в S период.

Самый главный процесс, который идет в S периоде, – это удвоение или редупликация ДНК. Все остальные реакции, происходящие в это время в клетке, направлены на обеспечение синтеза ДНК. К таким вспомогательным процессам можно отнести синтез гистоновых белков, синтез ферментов, регулирующих и обеспечивающих синтез нуклеотидов и образование новых нитей ДНК.

Прохождение клетки по всем периодам клеточного цикла строго контролируется. При движении клеток по клеточному циклу в них появляются и исчезают, активируются и ингибируются специальные регуляторные молекулы, которые обеспечивают: 1) прохождение клетки по определенному периоду клеточного цикла и 2 переход из одного периода в другой. Причем прохождение по каждому периоду, а также переход из одного периода в другой контролируется различными веществами. Сейчас мы попробуем выяснить, что же это за вещества и что они делают.

Общая ситуация выгладит так. В клетке постоянно присутствуют специальные белки-ферменты, которые путем фосфорилирования других белков (по остаткам серина, тирозина или треонина в полипептидной цепи), регулируют активность генов, ответственных за прохождение клетки по тому или иному периоду клеточного цикла. Эти белки-ферменты называются циклин-зависимыми протеинкиназами (cdc). Имеется несколько их разновидностей, но они все обладают сходными свойствами. Хотя количество этих циклин-зависимых протеинкиназ может варьировать в различных периодах клеточного цикла, они присутствуют в клетке постоянно, независимо от периода клеточного цикла, то есть они имеются в избытке. Другими словами, их синтез или количество не лимитирует или не регулирует прохождение клеток по клеточному циклу. Однако при патологии, если синтез их нарушен, снижено их количество или имеются мутантные формы с измененными свойствами, то это, конечно же, может повлиять на течение клеточного цикла.

Почему же такие циклин-зависимые протеинкиназы сами не могут регулировать прохождение клеток по периодам клеточного цикла. Оказывается, что они находятся в клетках в неактивном состоянии, а для того чтобы они активировались и начали работать, необходимы специальные активаторы. Ими являются циклины. Их также много разных типов, но они присутствуют в клетках не постоянно: то появляются, то исчезают. В разные фазы клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь с Cdk образуют различные Cdk‑циклиновые комплексы. Эти комплексы регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются G1-, G1/S-, S- и М-Cdk (рис. из моих рис. циклины). Так, например, прохождение клетки по G1 периоду клеточного цикла обеспечивает комплекс циклин-зависимой протеинкиназы‑2 (cdk2) и циклина D1, циклин-зависимой протеинкиназы‑5 (cdk5) и циклина D3. Прохождение через специальную точку рестрикции (R‑пункт) периода G1 контролирует комплекс cdc2 и циклина С. Переход клетки из G1 периода клеточного цикла в S период контролирует комплекс cdk2 и циклина Е. Для перехода клетки из S периода в G2 период необходим комплекс cdk2 и циклин А. Циклин-зависимая протеинкиназа‑2 (cdc2) и циклин В участвуют в переходе клетки из G2 периода в митоз (М период). Циклин H в соединении с cdk7 необходим для фосфорилирования и активации cdc2 в комплексе с циклином В.


Циклины – новый класс белков, открытый Тимом Хантом, которые играют ключевую роль в управлении делением клеток. Название «циклины» появилось из-за того, что концентрация белков этого класса изменяется периодически в соответствии со стадиями клеточного цикла (например, падает перед началом деления клетки).

Первый циклин был обнаружен Хантом в начале 1980-х годов, во время опытов с икрой лягушек и морских ежей. Позднее циклины были найдены и в других живых существах.

Оказалось, что эти белки мало изменились в ходе эволюции, как и механизм управления клеточным циклом, который дошел от простых дрожжевых клеток до человека в «законсервированном» виде.

Тимоти Хант (R. Timothy Hunt) вместе с соотечественником-англичанином Полом Нерсом (Paul M. Nurse) и американцем Лиландом Хартуэллом (Leland H. Hartwell) в 2001 году получили нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие генетических и молекулярных механизмов регуляции клеточного цикла – процесса, который имеет важнейшее значение для роста, развития и самого существования живых организмов

Контрольные точки клеточного цикла

1. Точка выхода из G1‑фазы, называемая Старт – у млекопитающих и точкой рестрикции у дрожжей. После перехода через точку рестрикции R в конце G1 наступление S становится необратимым, т.е. запускаются процессы ведущие к следующему делению клетки.
2. Точка S – проверка точности репликации.

3. Точка G2/M‑перехода – проверка завершения репликации.
4. Переход от метафазы к анафазе митоза.

Регуляция репликации

Перед началом репликации Sc ORC‑комплекс (origin recognition complex) садится на ori – точку начала репликации. Cdc6 представлен во всем клеточном цикле, но его концентрация возрастает вначале G1, где он связывается c ОRC комплексом, к которому затем присоединяются Mcm белки с образованием pre-replicative complex (pre-RC). После сборки pre-RC клетка готова к репликации.

Для инициации репликации S-Cdk соединяется с протеинкиназой (?), которая фосфорилирует pre-RC. При этом Cdc6 диссоциирует от ОRC после начала репликации и фосфорилируется, после чего убиквитинируется SCF и деградирует. Изменения в pre-RC препятствуют повторному запуску репликации. S-Cdk так же фосфорилирует некоторые Mcm белковые комплексы, что запускает их экспорт из ядра. Последующая дефосфориляция белков вновь запустит процесс образования pre-RC.

Циклины – активаторы Cdk. Циклины, так же как и Cdk вовлечены в различные, помимо контроля клеточного цикла, процессы. Циклины разделяются на 4 класса в зависимости от времени действия в клеточном цикле: G1/S, S, M и G1 циклины.
G1/S циклины (Cln1 и Cln2 у S. cerevisiae, циклин E у позвоночных) достигает максимальной концентрации в поздней G1‑фазе и падает в S‑фазе.

G1/S cyclin–Cdk комплекс запускает начало репликации ДНК выключая различные системы подавляющие S-phase Cdk в G1‑фазе G1/S циклины также инициируют дупликацию центросом у позвоночных, образование веретенного тела у дрожжей. Падение уровня G1/S сопровождается увеличением концентрации S циклинов (Clb5, Clb6 у Sc и циклин A у позвоночных), который образует S циклин-Cdk комплекс который напрямую стимулирует ДНК репликацию. Уровень S циклина остается высоким в течении всей S, G2‑фаз и начала митоза, где помогает началу митозу в некоторых клетках.

М-циклины (Clb1,2,3 и 4 у Sc, циклин B у позвоночных) появляется последним. Его концентрация увеличивается, когда клетка переходит к митозу и достигает максимума в метафазе. М-циклин-Cdk‑комплекс включает сборку веретена деления и выравнивание сестринских хроматид. Его разрушение в анафазе приводит к выходу из митоза и цитокиезу. G1 циклины (Cln3 у Sc и циклин D у позвоночных) помогает координировать клеточный рост с входом в новый клеточный цикл. Они необычны, так как их концентрация не меняется от фазы клеточного цикла, а меняется в ответ на внешние регуляторные сигналы роста.

Программируемая клеточная гибель

В 1972 г. Керр с соавт. опубликовали статью, в которой авторы представили морфологические доказательства существования отличающегося от некроза особого вида гибели клеток, которую они назвали «апоптоз». Авторы сообщили, что структурные изменения клеток при апоптозе проходят две стадии:

1-я – образование апоптозных тел,

2-я – их фагоцитоз и разрушение другими клетками.

Причины гибели, процессы морфологического и биохимического характера развития клеточной смерти могут быть различными. Но все же их можно четко разделить на две категории:

1. Некроз (от греч. пеkrosis– омертвление) и

2. Апоптоз (от греч. корней, означающих «отпадение» или «распадение»), который часто называют программируемой клеточной смертью (ПКС) или даже клеточным самоубийством (рис. 354).


Два пути клеточной гибели

а – апоптоз (профаммированная клеточная смерть): / – специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина, 2 – фрагментация ядра, 3 – фрагментация тела клетки на ряд апоптических телец; б – некроз: / – набухание клетки, вакуолярных компонентов, конденсация хроматина (кариорексис), 2 – дальнейшее набухание мембранных органоидов, лизис хроматина ядра (кариолизис), 3 – разрыв мембранных компонентов клетки – лизис клетки

Н. является наиболее частой неспецефической формой гибели клеток. Он может быть вызван тяжелыми повреждениями клетки в результате прямой травмы, радиации, влияния токсических агентов, вследствие гипоксии, лизиса клетки, опосредованного комплементом и т.д.

Некротический процесс проходит ряд стадий:

1) паранекроз – подобные некротическим, но обратимые изменения;

2) некробиоз – необратимые дистрофические изменения, характеризующиеся преобладанием катаболических реакций над анаболическими;

3) смерть клетки, время наступления которой установить трудно;

4) аутолиз – разложение мертвого субстрата под действием гидролитических ферментов погибших клеток и макрофагов. В морфологическом выражении некроз равнозначен аутолизу.

Несмотря на огромное количество работ, согласованного и точного определения понятия «апоптоз» нет.

Алоптоз обычно характеризовали как особую форму гибели клетки, отличную от некроза по морфологическим, биохимическим, молекулярно-генетическим и другим признакам.

А. – это гибель клетки, вызываемая внутренними или внешними сигналами, которые сами по себе не являются токсичными или деструктивными. А. – это активный процесс, требующий затрат энергии, транскрипции генов и синтеза белка denovo.

Обнаружено значительное количество агентов, вызывающих апоптоз этих клеток, помимо облучения и глюкокортикоидов:

Ионофоры Са2+

Аденозин

Циклический АМФ

Трибутилтин

Гипертермия

Изучение кинетики деградации ДНК в лимфоидных клетках invivo и invitro показало:

Первые отчетливые признаки распада появляются, как правило, спустя более 1 ч после воздействия, чаще к концу 2‑го часа.

Межнуклеосомная фрагментация продолжается в течение нескольких часов и заканчивается в основном через 6, реже 12 ч после воздействия.

Сразу же от момента появления деградации при анализе обнаруживается большое количество мелких фрагментов ДНК, причем соотношение между крупными и мелкими фрагментами в ходе апоптоза значительно не меняется.

Применение ингибиторов синтеза АТФ, белка и транскрипции генов замедляет процесс апоптоза. Такой зависимости в случае Н. нет

Как видно из сравнения определений некроза и апоптоза, между двумя видами гибели клетки имеется как сходство, так и существенные различия.

Характеристика Некроз

Апоптоз
функционально необратимым прекращением ее жизнедеятельности;
морфологически нарушением целостности мембран, изменением ядра (пикноз, рексис, лизис), цитоплазмы (отек), разрушением клетки; потерей микроворсинок и межклеточных контактов, конденсацией хроматина и цитоплазмы, уменьшением объема клетки (сморщиванием), образованием пузырьков из плазматической мембраны, фрагментацией клетки и образованием апоптозных телец;
биохимически нарушением выработки энергии, коагуляцией, гидролитическим расщеплением белков, нуклеиновых кислот, липидов; гидролизом белков цитоплазмы и межнуклеосомным распадом ДНК;
генетически – потерей генетической информации; и завершающейся ее аутолизом или гетеролизом с воспалительной реакцией. структурно-функциональной перестройкой генетического аппарата и завершающийся ее поглощением макрофагами и(или) другими клетками без воспалительной реакции.

Клеточная смерть регулируется межклеточными взаимодействиями различным образом. Множество клеток многоклеточного организма нуждается в сигналах с тем, чтобы оставаться живыми. В отсутствие таких сигналов или трофических факторов в клетках развивается программа «самоубийства» или программируемой смерти. Например, клетки культуры нейронов погибают при отсутствии фактора роста нейронов (NGF), клетки простаты гибнут в отсутствие андрогенов семенника, клетки молочной железы – при падении уровня гормона прогестерона и т.д. В то же время клетки могут получать сигналы, которые в клетках-мишенях запускают процессы, приводящие к гибели по типу апоптоза. Так, гидрокортизон вызывает гибель лимфоцитов, а глютамат – нервных клеток в культуре ткани, фактор некроза опухоли (TNF) вызывает гибель самых различных клеток. Тироксин (гормон щитовидной железы) вызывает апоптоз клеток хвоста головастиков. Кроме этого существуют ситуации, когда апоптическая гибель клетки вызывается внешними факторами, например радиацией.

Понятие «апоптоз» было введено при изучении гибели части клеток печени при неполной перевязке портальной вены. При этом наблюдается своеобразная картина клеточной смерти, которая затрагивает лишь отдельные клетки в паренхиме печени.

Процесс начинается с того, что соседние клетки теряют контакты, они как бы сморщиваются (первоначальное название этой формы гибели shrinkagenecrosis– некроз сжатием клетки), в ядрах по их периферии происходит специфическая конденсация хроматина, затем ядро фрагментируется на отдельные части, вслед за этим сама клетка фрагментируется на отдельные тельца, отграниченные плазматической мембраной, – апоптические тельца.

Апоптоз – процесс, приводящий не к лизису, не к растворению клетки, а к ее фрагментации, распаду. Судьба апоптических телец тоже необычна: они фагоцитируются макрофагами или даже нормальными соседними клетками. При этом не развивается воспалительная реакция.

Важно отметить, что во всех случаях апоптоза – во время ли эмбрионального развития, во взрослом ли организме, в норме или при патологических процессах – морфология процесса гибели клеток очень сходна. Это может говорить об общности процессов апоптоза в разных организмах и в разных органах.

Исследования на разных объектах показали, что апоптоз есть результат реализации генетически запрограммированной клеточной гибели. Первые доказательства наличия генетической программы клеточной смерти (ПКС) были получены при изучении развития нематоды Caenorhabditiselegans. Этот червь развивается всего за трое суток, и его малые размеры позволяют проследить за судьбой всех его клеток, начиная с ранних этапов дробления до половозрелого организма.

Оказалось, что при развитии Caenorhabditiselegans образуется всего 1090 клеток, из которых часть нервных клеток в количестве 131 штуки спонтанно погибает путем апоптоза и в организме остается 959 клеток. Были обнаружены мутанты, у которых процесс элиминации 131 клетки был нарушен. Были выявлены два гена сеd‑3 и сеd‑4, продукты которых вызывают апоптоз 131 клетки. Если у мутантных Caenorhabditiselegans эти гены отсутствуют или изменены, то апоптоз не наступает и взрослый организм состоит из 1090 клеток. Был найден и другой ген – сеd‑9, который является супрессором апоптоза: при мутации сеd‑9 все 1090 клеток погибают. Аналог этого гена был обнаружен у человека: ген bcl‑2 также является супрессором апоптоза различных клеток. Оказалось, что оба белка, кодируемые этими генами, – Сеd‑9 и Вс1–2, имеют один трансмембранный домен и локализуются во внешней мембране митохондрий, ядер и эндоплазматического ретикулума.

Система развития апоптоза оказалась очень сходной у нематоды и позвоночных животных, она состоит из трех звеньев: регулятора, адаптера и эффектора. У Caenorhabditiselegans регулятором является Сеd‑9, который блокирует адаптерный белок Сеd‑4, который в свою очередь не активирует эффекторный белок Сеd‑3, протеазу, которая действует на белки цитоскелета и ядра (табл. 16).


Табл. 16. Развитие программируемой клеточной смерти (апоптоза)

Знак ──┤ – торможение процесса‚ знак ─→ – стимуляцию процесса

У позвоночных система ПКС более сложная. Здесь регулятором является белок Вс1–2, который ингибирует адаптерный белок Apaf‑1, стимулирующий каскад активации специальных протеиназ – каспаз.

Ферменты – участники процесса апоптоза

Таким образом,

Раз начавшись в клетке, такая деградация быстро протекает «до конца»;

В апоптоз вступают не все клетки сразу или в короткий промежуток времени, а постепенно;

Разрывы ДНК происходят по линкерной (межнуклеосомной) ДНК;

Деградацию осуществляют эндо-, но не экзонуклеазы, и эти эндонуклеазы активируются или получают доступ к ДНК не в результате непосредственного взаимодействия с агентом, вызывающим апоптоз, а опосредованно, так как от момента контакта клеток с таким агентом до начала развития деградации проходит довольно значительное время, и, следовательно, фрагментация ДНК не является первой характерной «апоптотической» реакцией клетки на молекулярном уровне. В самом деле, если бы деградация запускалась в результате непосредственного взаимодействия эндонуклеаз или хроматина с агентом, то в случае, например, действия ионизирующей радиации апоптоз происходил бы быстро и одновременно почти во всех клетках.

Исходя из этих заключений, расшифровка молекулярного механизма развития апоптоза «сосредоточилась» на идентификации эндонуклеаз(ы), осуществляющих фрагментацию ДНК, и механизмов, активирующих эндонуклеазы.

Эндонуклеазы

1. Деградацию осуществляет ДНКаза I. Процесс активируется Са2+ и Мg2+ и подавляется Zn2+ .

Однако имеются факты, которые свидетельствуют против участия ДНКазы I в процессе фрагментации ДНК. Так известно, что этот фермент отсутствует в ядре, правда, этот аргумент не очень весомый, так как относительно небольшой размер его молекул, 31 кДа, в случае нарушения проницаемости ядерной мембраны делает участие ДНКазы I в деградации ДНК вполне реальным. Другое дело, что при обработке хроматина invitro ДНКаза I вызывает разрывы не только в линкерной части, но и в нуклеосомной ДНК.

2. Другой эндонуклеазой, рассматриваемой в качестве основного фермента деградации ДНК, является эндонуклеаза II [Барри 1993]. Эта нуклеаза при обработке ядер и хроматина осуществляет межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Несмотря на то, что его активность не зависит от ионов двухвалентных металлов, вопрос об участии эндонуклеазы II в деградации ДНК не снят до сих пор, поскольку фермент не только находится в лизосомах, но и выделяется из ядер клеток.

3. эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кДа. Этот фермент был выделен из ядер погибающих путем апоптоза тимоцитов крыс [Гайдо, 1991]. Она отсутствовала в нормальных тимоцитах. Активность фермента проявляется в нейтральной среде и зависит от Са2+ и Мg2+.

4. γ-нуклеаза с молекулярной массой 31 кДа, имеющая «классическую» зависимость от ионов Са, Мg и Zn. Активность этого фермента повышалась в ядрах тимоцитов крыс, обработанных глюкокортикоидами .

5. эндонуклеаза с молекулярной массой 22,7 кДа фермент, активность которого проявляется в ядрах тимоцитов крыс только после действия глюкокортикоидов и подавляется теми же ингибиторами, что и межнуклеосомная деградация ДНК .

Каспазы – цистеиновые протеазы, которые расщепляют белки по аспарагиновой кислоте. В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников – прокаспаз. Существуют инициирующие и эффекторные каспазы. Инициирующие каспазы активируют латентные формы эффекторных каспаз. Субстратами для действия активированных каспаз служат более 60 различных белков. Это, например, киназа фокальных адгезионных структур, инактивация которой приводит к отделению апоптических клеток от соседей; это ламины, которые при действии каспаз разбираются; это цитоскелетные белки (промежуточные филаменты, актин, гельзолин), инактивация которых приводит к изменению формы клетки и к появлению на ее поверхности пузырей, которые дают начало апоптическим тельцам; это активируемая протеаза САD, которая расщепляет ДНК на олигонуклеотидные нуклео-сомные фрагменты; это ферменты репарации ДНК, подавление которых предотвращает восстановление структуры ДНК, и многие другие.

Одним из примеров разворачивания апоптозного ответа может являться реакция клетки на отсутствие сигнала от необходимого трофического фактора, например фактора роста нервов (NGF), или андрогена.

В цитоплазме клеток в присутствии трофических факторов находится в неактивной форме еще один участник реакции – фосфорилированный белок Ваd. В отсутствие трофического фактора этот белок дефосфорилируется и связывается с белком Вс1–2 на внешней митохондриальной мембране и этим ингибирует его антиапоптозные свойства. После этого активируется мембранный проапоптический белок Вах, открывая путь ионам, входящим в митохондрию. В это же время из митохондрий через образовавшиеся в мембране поры в цитоплазму выходит цитохром с, который связывается с адаптерным белком Араf‑1, который в свою очередь активирует прокаспазу 9. Активированная каспаза 9 запускает каскад других прокаспаз, в том числе каспазу 3, которые, будучи протеиназами, начинают переваривать мешенные белки (ламины, белки цитоскелета и др.), что вызывает апоптическую смерть клетки, ее распад на части, на апоптические тельца.

Апоптические тельца, окруженные плазматической мембраной разрушенной клетки, привлекают отдельные макрофаги, которые их поглощают и переваривают с помощью своих лизосом. Макрофаги не реагируют на соседние нормальные клетки, но узнают апоптические. Это связано с тем, что при апоптозе нарушается асимметрия плазматической мембраны и на ее поверхности появляется фосфатидилсерин, негативно заряженный фосфолипид, который в норме располагается в цитозольной части билипидной плазматической мембраны. Таким образом, путем избирательного фагоцитоза ткани как бы очищаются от погибших апоптозных клеток.

Как указывалось выше, апоптоз может быть вызван целым рядом внешних факторов, таких как радиация, действие некоторых токсинов, ингибиторов клеточного метаболизма. Необратимые повреждения ДНК вызывают апоптоз. Это связано с тем, что накапливающийся транскрипционный фактор – белок р53, не только активирует белок р21, который ингибирует зависящую от циклина киназу и останавливает клеточный цикл в G1- или G2‑фазе, но и активирует экспрессию гена bax, продукт которого запускает апоптоз.

Наличие контрольных точек в клеточном цикле необходимо для определения завершения его каждой фазы. Остановка клеточного цикла происходит при повреждении ДНК в G1 периоде, при неполной репликации ДНК в S‑фазе, при повреждении ДНК в G2‑периоде и при нарушении связи веретена деления с хромосомами.

Одним из контрольных пунктов в клеточном цикле является собственно митоз, который не переходит в анафазу при неправильной сборке веретена и при отсутствии полных связей микротрубочек с кинетохорами. В этом случае не происходит активации АРС-комплекса, не происходит деградации когезинов, соединяющих сестринские хрома-тиды, и деградации митотических циклинов, что необходимо для перехода в анафазу.

Повреждения ДНК препятствуют вхождению клеток в S‑период или в митоз. Если эти повреждения не катастрофические и могут быть восстановлены за счет репаративного синтеза ДНК, то блок клеточного цикла снимается, и цикл доходит до своего завершения. Если же повреждения ДНК значительные, то каким-то образом происходят стабилизация и накопление белка р53, концентрация которого в норме очень низкая из-за его нестабильности. Белок р53 является одним из факторов транскрипции, который стимулирует синтез белка р21, являющегося ингибитором комплекса СDК-циклин. Это приводит к тому, что клеточный цикл останавливается на стадии G1или G2. При блоке в G1‑периоде клетка с повреждением ДНК не вступает в S‑фазу, так как это могло бы привести к появлению мутантных клеток, среди которых могут быть и опухолевые клетки. Блокада в G2‑периоде также предотвращает процесс митоза клеток с повреждениями ДНК. Такие клетки, с блокированным клеточным циклом, в дальнейшем погибают путем апоптоза, программированной клеточной гибели (рис. 353).

При мутациях, приводящих к потере генов белка р53, или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна, другая – дает начало злокачественным клеткам.

Избирательные повреждения митохондрий, при которых в цитоплазму высвобождается цитохром с, также являются частой причиной развития апоптоза. Особенно митохондрии и другие клеточные компоненты страдают при образовании токсически активных форм кислорода (АТК), под действием которых во внутренней мембране митохондрий образуются неспецифические каналы с высокой проницаемостью для ионов, в результате чего матрикс митохондрий набухает, а внешняя мембрана разрывается. При этом растворенные в межмембранном пространстве белки вместе с цитохромом с выходят в цитоплазму. Среди освободившихся белков есть факторы, активирующие апоптоз, и прокаспаза 9.

Многие токсины (рицин, дифтерийный токсин и др.), а также антиметаболиты могут вызывать гибель клеток путем апоптоза. При нарушении синтеза белка в эндоплазматическом ретикулуме в развитии апоптоза участвует локализованная там прокаспаза 12, которая активирует ряд других каспаз, и в том числе каспазу 3.

Элиминация – удаление отдельных клеток путем апоптоза, наблюдается и у растений. Здесь апоптоз включает в себя, так же как у животных клеток, фазу индукции, эффекторную фазу и фазу деградации. Морфология гибели клеток растений сходна с изменениями клеток животных: конденсация хроматина и фрагментация ядра, олигонуклеотидная деградация ДНК, сжатие протопласта, его дробление на везикулы, разрыв плазмодесм и т.д. Однако везикулы протопласта разрушаются гидролазами самих везикул, так как у растений нет клеток, аналогичных фагоцитам. Так, ПКС происходит при росте клеток корневого чехлика, при формировании перфораций у листьев, при образовании ксилемы и флоэмы. Опадание листьев связано с избирательной гибелью клеток определенной зоны черенка.

Биологическая роль апоптоза, или программированной смерти клеток, очень велика: это удаление отработавших свое или ненужных на данном этапе развития клеток, а также удаление измененных или патологических клеток, особенно мутантных или зараженных вирусами.

Итак, для того чтобы клетки в многоклеточном организме существовали, нужны сигналы на их выживание – трофические факторы, сигнальные молекулы. Эти сигналы могут быть переданы на расстояние и уловлены соответствующими рецепторными молекулами на клетках-мишенях (гормональная, эндокринная сигнализация), это может быть паракринная связь, когда сигнал передается на соседнюю клетку (например, передача нейромедиатора). При отсутствии таких трофических факторов реализуется программа апоптоза. В то же время апоптоз может вызываться сигнальными молекулами, например при резорбции хвоста головастиков под действием тироксина. Кроме того, действие ряда токсинов, влияющих на отдельные звенья метаболизма клетки, также может стать причиной клеточной гибели посредством апоптоза.

Апоптоз в патогенеза заболеваний

1. В иммунной системе

2. ОНКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

3. ВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ (индуцирующие апоптоз: в. иммунодефицита человека‚ в. анемии циплят; ингибирующие апоптоз: цитомегаловирус‚ в. Эпштейна-Барр‚ в. герпеса)

4. А. и НЕЙРОНЫ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА

ПРИНЦИПЫ КОРРЕКЦИИ АПОПТОЗА КЛЕТКИ

Открытие регулируемого процесса гибели клетки – апоптоза–позволило определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью регуляции или коррекции.

Биохимические процессы развития апоптоза можно гипотетически разделить на несколько этапов:

Действие фактора, вызывающего апоптоз;

Передача сигнала с рецепторной молекулы в клеточное ядро;

Активация апоптозспецифических генов;

Синтез апоптозспецифических белков

Активация эндонуклеаз

Фрагментацию ДНК (рис. 2.4).

В настоящее время считают, что если клетка погибает путем апоптоза, то подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза, то такое вмешательство невозможно. На основе знаний регуляции запрограммированной гибели клетки используется широкий ряд препаратов с целью воздействия на этот процесс в различных типах клеток.

Так, сведения о рецепторопосредованной регуляции апоптоза клеток учитывают при лечении гормонзависимых опухолей.

Андрогенблокирующую терапию назначают при раке предстательной железы.

Рак молочной железы часто подвергается регрессии при использовании антагонистов эстрогеновых рецепторов.

Информация о биохимических сигналпередающих путях регуляции апоптоза позволяет эффективно применять антиоксидантную терапию, препараты, регулирующие концентрацию кальция, активаторы или ингибиторы различных протеинкиназ и т.д. с целью коррекции апоптоза в различных типах клеток.

Осознание роли апоптоза в гибели клеток интенсифицировало поиск фармакологических воздействий, защищающих клетки от апоптоза.

Активно изучаются ингибиторы специфических протеаз в качестве фармакологических агентов. Это, как правило, три- или тетрапептиды, содержащие аспарагиновую кислоту (Асп). Использование таких протеаз в терапевтических целях ограничено их низкой способностью проникать в клетку. Однако, несмотря на это, в экспериментах invivo успешно применяется Z-VAD-FMK – ингибитор ICE‑подобных протеаз широкого спектра действия для снижения зоны инфаркта при моделировании инсульта.

В ближайшие годы можно ожидать появления новых лекарственных средств для лечения и предупреждения различных заболеваний, основу действия которых будет составлять принцип регуляции процессов апоптоза.

Наиболее эффективны для коррекции апоптоза подходы, связанные с регуляцией апоптозспецифических генов. Эти подходы лежат в основе генной терапии – одного из перспективных направлений лечения больных с заболеваниями, вызванными нарушением функционирования отдельных генов.

Принципы генной терапии включают следующие этапы:

Идентификация последовательности ДНК, которая будет подвергаться лечению;

Определение типа клеток, в которых будет проводиться лечение;

Защита ДНК от гидролиза эндонуклеазами;

Транспорт ДНК в клетку (ядро).

Геннотерапевтические подходы позволяют

Усиливать работу отдельных генов (трансформация генов, ингибирующих апоптоз, например гена bcl‑2),

Ослаблять их экспрессию. Для селективного ингибирования экспрессии генов в настоящее время используют технику антисмысловых олигонуклеотидов (антисенсов). Использование антисенсов снижает синтез определенных белков, что влияет на регуляцию процесса апоптоза.

Механизм действия антисенсов активно изучается. В некоторых случаях короткие (13–17 оснований) антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие последовательности, комплементарные нуклеотидным последовательностям матричной РНК (мРНК) отдельных белков, могут эффективно блокировать генетическую информацию на стадии, предшествующей транскрипции (рис. 2.5). Данные олигонуклеотиды, связываясь с ДНК, формируют триплетную спиральную структуру. Такое связывание может быть необратимым или вызывать селективное выщепление триплетного комплекса, что в итоге приводит к ингибированию экспрессии гена и гибели клетки. В других случаях происходит комплементарное связывание антисенса с мРНК, что вызывает нарушение трансляции и снижение концентрации соответствующего белка.


Триплетный комплекс

Рис. Регуляция экспрессии генов антисмысловыми олигонуклеотидами.

В настоящее время убедительно показано, что технология с использованием антисенсов имеет большое значение для регуляции отдельных генов в культуре клеток. Успешное подавление гена bcl‑2 в экспериментах на культурах клеток пробуждает надежду на применение в будущем антисенсов для лечения больных раком. Во многих экспериментах invitro показано, что антисенсы вызывают ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток. Такой результат подтверждает перспективы терапевтического использования данной технологии.

1. Факторы роста (макрофаги, лимфоциты, фибробласты, тромбоциты и др.) –стимуляция пролиферации и ограничение апоптоза.

2. Кейлоны – гликопротеидные тканеспецифические ингибиторы роста.

3. Фибронектин- хемоаттрактант фибробластов.

4. Ламинин -главный адгезивный белок базальных мембран.

5. Синдекан -интегральный протеогликан клеточных мембран, связывает коллаген, фибронектин и тромбоспондин.

6. Тромбоспондин – гликопротеид, образует комплексы с синдеканом, коллагеном и гепарином, играет существенную роль в сборке костной ткани.

Образование и реализация эффектов биологически активных веществ (БАВ) - одно из ключевых звеньев воспаления. БАВ обеспечивают закономерный характер развития воспаления, формирование его общих и местных проявлений, а также исходы воспаления. Именно поэтому БАВ нередко именуют как «медиаторы воспаления».

Медиаторы воспаления - это местные химические сигналы, образую­щиеся, высвобождаемые либо активируемые в очаге воспаления, действую­щие и разрушаемые также в пределах очага. Под медиаторами (посредниками) воспаления понимают биологически активные вещества, ответственные за возникновение или поддержание тех или иных воспалительных явлений, например повышенной сосудистой проницаемости, эмиграции и т. д.

Это те же вещества, которые в условиях нормальной жизнедеятельности организма, образуясь в различных органах и тканях в физиологических концентрациях, ответственны за регуляцию функций на клеточном, тканевом уровне. При воспалении, местно высвобождаясь (вследствие активации клеток и жидких сред) в больших количествах, они приобретают новое качество - медиаторов воспаления. Практически все медиаторы являются и модуляторами воспаления, т. е. способны усиливать или ослаблять выраженность воспалительных явлений. Это обусловлено комплексностью их влияния и взаимодействием их как с клетками-продуцентами этих веществ, так и между собой. Соответственно эффект медиатора может быть добавочным (аддитивным), потенцирующим (синергистическим) и ослабляющим (антагонистическим), а взаимодействие медиаторов возможно на уровне их синтеза, секреции или эффектов.

Медиаторное звено является основным в патогенезе воспаления. Оно координирует взаимодействие множества клеток - эффекторов воспаления, смену клеточных фаз в очаге воспаления. Соответственно патогенез воспаления можно представить себе как цепь множественных межклеточных взаимодействий, регулируемых медиаторами-модуляторами воспаления.

Медиаторы воспаления обусловливают развитие и регуляцию процессов альтерации (включая изменение обмена веществ, физико‑химических параметров, структуры и функции), развитие сосудистых реакций, экссудации жидкости и эмиграции клеток крови, фагоцитоза, пролиферации и репаративных процессов в очаге воспаления.


Большинство медиаторов выполняют свои биологические функции специфически воздействуя на рецепторы клеток-мишеней. Однако некоторые из них имеют прямую ферментативную или токсическую активность (напри­мер, лизосомальные гидролазы и активные кислородные радикалы). Функции каждого медиатора регулируются соответствующими ингибиторами.

Источниками медиаторов воспаления могут служить плазма крови и клетки-участники воспаления. В соответствии с этим выделяют 2 большие группы медиаторов воспаления: гуморальные и клеточные . Гуморальные

медиаторы в основном представлены полипептидами, которые постоянно цир­кулируют в крови в неактивном состоянии и синтезируются преимуществен­но в печени. Эти медиаторы составляют так называемую «сторожевую поли­систему плазмы крови». Клеточные медиаторы могут синтезироваться de novo (например, метаболиты арахидоновой кислоты) или высвобождаться из клеточных депо (например, гистамин). Источниками клеточных медиаторов в очаге воспаления являются, в основном, макрофаги, нейтрофилы и базофилы.

Из гуморальных медиаторов воспаления наиболее важными являютсяпроизводные комплемента. Среди почти 20 различных белков, образующихся при активации комплемента, непосредственное отношение к воспалению имеют его фрагменты С5а, С3а, С3b и комплекс С5b-С9. При этом С5а и в меньшей степени С3а являются медиаторами острого воспаления. СЗb опсонизирует патогенный агент и соответственно способствует иммунной адгезии и фагоцитозу. Комплекс С5b-С9 ответствен за лизис микроорганизмов и патологически измененных клеток. Источником комплемента является плазма крови и в меньшей мере тканевая жидкость. Усиленная поставка плазменного комплемента в ткань является одним из важных назначений экссудации. С5а, образующийся из него в плазме и тканевой жидкости под влиянием карбоксипептидазы N, C5a des Arg и С3а повышают проницаемость посткапиллярных венул. При этом C5a и С3а, будучи анафилатоксинами (т. е. либераторами гистамина из тучных клеток), повышают проницаемость как прямо, так и опосредованно через гистамин Эффект C5a des Arg не связан с гистамином, но является нейтрофилзависимым, т. е. осуществляется за счет факторов проницаемости, вьсвобождаемых из полиморфноядерных гранулоцитов, - лизосомальных ферментов и неферментных катионных белков, активных метаболитов кислорода. Кроме того, C5a и C5a des Arg привлекают нейтрофилы. В отличие от них С3а практически не обладает хемотаксическими свойствами. Активные компоненты комплемента высвобождают не только гистамин и гранулоцитарные продукты, но и интеряейкин-1, простагландины, лейкотриены, фактор, активирующий тромбоциты, и синергистически взаимодействуют с простагландинами и веществом Р.

Кинины - вазоактивные пептиды, образующиеся из кининогенов (альфа2-глобулинов) под влиянием калликреинов в плазме (нонапептид брадикинин) и в тканевой жидкости (декапептид лизилбрадикинин, или каллидин). Пусковым фактором активации калликреин-кининовой системы является активация при повреждении ткани фактора Хагемана (XII фактор свертывания крови), превращающего прекалликреины в калликреины.

Кинины опосредуют расширение артериол и повышение проницаемости венул путем контракции эндотелиальных клеток. Они сокращают гладкую мускулатуру вен и повышают внутрикапиллярное и венозное давление. Кинины угнетают эмиграцию нейтрофилов, модулируют распределение макрофагов, стимулируют миграцию и митогенез Т-лимфоцитов и секрецию лимфокинов. Они также усиливают пролиферацию фибробластов и синтез коллагена и, следовательно, могут иметь значение в репаративных явлениях и в патогенезе хронического воспаления.

Один из наиболее значимых эффектов кининов- активация рефлексов путем раздражения окончаний чувствительных нервов и опосредование, таким образом, воспалительной боли. Кинины вызывают или усиливают высвобождение гистамина из тучных клеток, синтез простагландинов многими типами клеток, поэтому некоторые из их основных эффектов- вазодилятация, сокращение гладкой мускулатуры, боль - связывают с высвобождением других медиаторов, особенно простагландинов.

Активация фактора Хагемана запускает не только процесс кининообразования, но и свертывания крови и фибринолиза. При этом образуются такие медиаторы, как фибринопептиды и продукты деградации фибрина, которые являются мощными хематтрактантами. Кроме того, фибринолиз и образование тромбов в сосудах очага имеют существенное значение как в патологических, так и в защитных явлениях воспаления.

Из клеточных медиаторов первостепенный интерес вызываютэйкозаноиды поскольку скорее всего именно они являются центральным медиаторным звеном воспалительной реакции. В пользу этого свидетельствуют продолжительное поддержание продукции эйкозаноидов в очаге, их тесная связь с ключевым событием воспалительного процесса - лейкоцитарной инфильтрацией, мощный противовоспалительный эффект ингибиторов их синтеза.

Основную роль в продукции эйкозаноидов в очаге воспаления играют лейкоциты, особенно моноциты и макрофаги, хотя они образуются почти всеми типами ядерных клеток при стимуляции последних. Преобладающими эйкозаноидами в очаге воспаления почти всегда оказываются простагландин (ПГ) Е2, лейкотриен (ЛТ) B4 и 5-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (5-ГЭТЕ). Образуются также, хотя и в меньшем количестве, тромбоксан (Ткс) А2, ПГF2альфа, ПГD2, простациклин (ПГ12), ЛТС4, ЛТD4, ЛТЕ4, другие ГЭTЕ.

Главными эффектами эйкозаноидов при воспалении являются влияния на лейкоциты. ПГ, Ткс и особенно ЛТ являются мощными хематтрактантами и играют, таким образом, важную роль в механизмах самоподдержания лейкоцитарной инфильтрации. ПГ сами не повышают сосудистую проницаемость, но, будучи сильными вазодилятаторами, усиливают гиперемию и, следовательно, экссудацию. ЛТС4, JITD4, ЛТЕ4 повышают проницаемость сосудов путем прямой контракции эндотелиальных клеток, а ЛТВ4 - как нейтрофилзависимый медиатор. ПГ и ЛТ имеют значение в генезе воспалительной боли. При этом ПГЕ2, не обладая прямой болевой активностью, повышает чувствительность рецепторов афферентных болевых нервных окончаний к брадикинину и гистамину. ПГЕ2 является сильным жароповышающим агентом, и лихорадка при воспалении может быть отчасти обусловлена его высвобождением. ПГ играют ключевую роль в модуляции воспалительного процесса, осуществляя двунаправленную регуляцию экссудации, эмиграции и дегрануляции лейкоцитов, фагоцитоза. Так, например, ПГЕ способны потенцировать развитие отека, вызванного гистамином или брадикинином, а ПГF2альфа, напротив, ослаблять. Аналогичные отношения между ПГЕ и ПГF2альфа распространяются также на эмиграцию лейкоцитов.

Особо широкий спектр взаимодействий с другими медиаторами воспаления характерен для ЛТ. Они синергистически взаимодействуют в отношении бронхоспазма с гистамином, ацетилхолином, ПГ и Ткс, стимулируют высвобождение ПГ и Ткс. Модуляторная функция эйкозаноидов осуществляется через изменения соотношения циклических нуклеотидов в клетках.

Источникамигистамина являются базофилы и тучные клетки.Серотонин (нейромедиатор) у человека кроме незначительного количества в тучных клетках содержится также в тромбоцитах и энтерохромаффинных клетках. Благодаря быстрому высвобождению при дегрануляции тучных клеток, способности изменять просвет микрососудов и вызывать непосредственную контракцию эндотелиальных клеток венул гистамин и серотонин считаются основными медиаторами первоначальных микроциркуляторных нарушений в очаге острого воспаления и немедленной фазы повышения проницаемости сосудов. Гистамин играет дуалистическую роль как в отношении сосудов, так и клеток. Через Н2-рецепторы он расширяет артериолы, а через H1-рецепторы суживает венулы и, таким образом, повышает внутрикапиллярное давление. Че­рез Hi -рецепторы гистамин стимулирует, а через Нг-рецепторы угнетает эмиграцию и дегрануляцию лейкоцитов. При обычном течении воспаления гистамин действует преимущественно через Нг-рецепторы на нейтрофилах, ограничивая их функциональную активность, и через Hi -рецепторы на моно­цитах, стимулируя их. Таким образом, на­ряду с провоспалительными сосудистыми эффектами он оказывает противовоспали­тельные клеточные. Серотонин также сти­мулирует моноциты в очаге воспаления. Гистамин осуществляет двунаправленную регуляцию пролиферации, дифференцировки и функциональной активности фибробластов и, следовательно, может иметь значение в репаративных явлениях. Моду­ляторные эффекты гистамина также опосредуются циклическими нуклеотидами.

Что касается взаимодействий биогенных аминов в очаге воспаления, то известно, что гистамин через Hi-рецепторы может за­пускать или усиливать синтез простагландинов, а через На -рецепторы - угнетать. Биогенные амины взаимодействуют как меж­ду собой, так и с брадикинином, нуклео­тидами и нуклеозидами, веществом Р в по­вышении проницаемости сосудов. Сосудорас­ширяющее действие гистамина усиливается в комплексе с ацетилхолином, серотонином, брадикинином.

Основным источникомлизосомальных ферментов в очаге воспаления являются фагоциты - гранулоциты и моноциты-макрофаги. Несмотря на огромную важность в патогенезе воспаления фагоцитоза, фагоциты являются прежде всего подвиж­ными носителями медиаторов-модуляторов, секретируемых внеклеточно. Вывобождение лизосомального содержимого осуществляется в ходе их хемотаксической стимуляции, ми­грации, фагоцитоза, повреждения, гибели. Главными компонентами лизосом у челове­ка являются нейтральные протеиназы- эластаза, катепсин G и коллагеназы, содер­жащиеся в первичных, азурофильных, гра­нулах нейтрофилов. В процессах противомикробной защиты, в том числе при воспа­лении, протеиназы относятся к факторам “второй очереди” после кислородзависимых (миелопероксидаза - перекись водорода) и таких кислороднезависимых, как лактоферрин и лизоцим, механизмов. Они обеспе­чивают главным образом лизис уже убитых микроорганизмов. Основные же эффекты протеиназ - медиация и модуляция воспалительных явлений, в том числе повреждения собственных тканей. Медиаторный и модуляторный эффекты протеиназ осуществляются в отношении сосудистой проницаемости, эмиграции, фагоцитоза.

Повышение проницаемости сосудов под влиянием лизосомальных ферментов происходит за счет лизиса субэндотелиального матрикса, истончения и фрагментации эндотелиальных клеток и сопровождается геморрагией и тромбозом. Образуя или расщепляя важнейшие хемотаксические вещества, лизосомальные ферменты являются модуляторами лейкоцитарной инфильтрации. В первую очередь это касается компонентов системы комплемента и калликреин-кининовой.

Лизосомальные ферменты, в зависимости от концентрации, могут и сами усиливать или угнетать миграцию нейтрофилов. В отношении фагоцитоза нейтральные протеиназы также обладают рядом эффектов. В частности, эластаза может об­разовывать опсонин С3b; С3b является также важным для адгезии частиц к поверхности нейтрофила. Следовательно, нейтрофил сам обеспечивает себе механизм усиления фагоцитоза. Как катепсин G, так и эластаза повышают сродство Fc-рецептора мембраны нейтрофила к комплексам иммуноглобулинов и, соответственно, усиливают эффективность поглощения частиц.

Благодаря также способности лизосомальных ферментов активировать системы комплемента, калликреин-кининовую, свертывания и фибринолиза, высвобождать цитокины и лимфокины, воспаление развертывается и самоподдерживается в течение длительного времени.

Важнейшим свойствомнеферментных катионных белков, содержащихся как в азурофильных, так и в специфических гранулах нейтрофилов, являетсяих высокая микробицидность. В этом отношении они находятся в синергистическом взаимодействии с системой миелопероксидаза - перекись водорода. Катионные белки адсорбируются на отрицательно заряженной мембране бактериальной клетки путем электростатического взаимодействия. В результате этого нарушаются проницаемость и структура оболочки и наступает гибель микроорганизма, что является предпосылкой для последующего эффективного лизиса его лизосомальными протеиназами. Высвободившиеся внеклеточно катионные белки опосредуют повышение проницаемости сосудов (главным образом путем индукции дегрануляции тучных клеток и высвобождения гистамина), адгезию и эмиграцию лейкоцитов.

Главным источникомцитокинов (монокинов) при воспалении являются стимулированные моноциты и макрофаги. Кроме того, эти полипептиды продуцируются нейтрофилами, лимфоцитами, эндотелиальными и другими клетками. Наиболее изученными из цитокинов являются интерлейкин-1(ИЛ-1) и фактор некроза опухоли (ФНО). Цитокины повышают сосудистую проницаемость (неитрофилзависимым путем), адгезию и эмиграцию лейко­цитов. Наряду с провоспалительными свойствами цитокины могут иметь значение и в непосредственной защите организма, стимулируя нейтрофилы и моноциты к умерщвлению, поглощению и перевариванию внедрившихся микроорганизмов, а также усиливая фагоцитоз путем опсонизации патогенного агента.

Стимулируя раневое очищение, пролиферацию и дифференцировку клеток, цитокины усиливают репаративные процессы. Наряду с этим они могут опосредовать тканевую деструкцию (деградацию хрящевого матрикса и резорбцию кости) и, таким образом, играть роль в патогенезе заболеваний соединительной ткани, в частности ревматоидного артрита.

Действие цитокинов вызывает также ряд метаболических эффектов, лежащих в основе общих проявлений воспаления - лихорадки, сонливости, анорексии, изменения обмена веществ, стимуляции гепатоцитов к усиленному синтезу белков острой фазы, активации системы крови и т. д.

Цитокины взаимодействуют между собой, с простагландинами, нейропептидами и другими медиаторами.

К медиаторам воспаления относится также рядлимфокинов - полипептидов, продуцируемых стимулированными лимфоцитами. Наиболее изученными из лимфокинов, модулирующих воспалительный ответ, являются фактор, угнетающий макрофаги, макрофагактивирующий фактор, интерлейкин-2. Лимфокины координируют взаимодействие нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов, регулируя таким образом воспалительную реакцию в целом.

Активные метаболиты кислорода, прежде всего свободные радикалы - супероксидный анион радикал, гидроксильный радикал НО, пергидроксил, вследствие наличия на их внешней орбите одного или нескольких непарных электронов обладают повышенной реактивностью с другими молекулами и, следовательно, значительным деструктивным потенциалом, который имеет значение в патогенезе воспаления. Источником свободных радикалов, а также других кислородпроизводных медиаторов и модуляторов воспаления - перекиси водорода (Н 2 0 2), синглетного кислорода (f0 2), гипохлорида (НОС1) служат: дыхательный взрыв фагоцитов при их стимуляции, каскад арахидоновой кислоты в процессе образования эйкозаноидов, ферментные процессы в эндоплазматическом ретикулуме и пероксизомах, митохондриях, цитозоле, а также самоокисление малых молекул, таких, как гидрохиноны, лейкофлавины, катехоламины и др.

Роль активных метаболитов кислорода в воспалении состоит, с одной стороны, в повышении бактерицидной способности фагоцитов и, с другой стороны, - в их медиаторной и модуляторной функциях. Медиаторная роль активных метаболитов кислорода обусловлена их способностью вызывать перекисное окисление липидов, окисление белков, углеводов, повреждение нуклеиновых кислот. Указанные молекулярные изменения лежат в основе вызываемых активными метаболитами кислорода явлений, характерных для воспаления, - повышения проницаемости сосудов (вследствие повреждения эндотелиальных клеток), стимуляции фагоцитов.

Модуляторная ролъ, активных метаболитов кислорода может заключаться как в усилении воспалительных явлений (путем индукции высвобождения ферментов и взаимодействия с ними в повреждении ткани; не только инициации, но и модуляции каскада арахидоновой кислоты), так и в противовоспалительных эффектах (за счет инактивации лизосомальных гидролаз и других медиаторов воспаления).

Важное значение имеют активные метаболиты кислорода в поддержании хронического воспаления.

К медиаторам и модуляторам воспаления относят такженейропептиды - вещества, высвобождаемые С-волокнами в результате активации воспалительным агентом полимодальных ноцицепторов, играющих важную роль в возникновении аксонрефлексов в конечных разветвлениях первичных афферентных (чувствительных) нейронов. Наиболее изученными являются вещество Р, кальцитонин-генсвязанный пептид, нейрокинин А. Нейропептиды повышают проницаемость сосудов, и этаих способность во многом опосредована медиаторами, происходящими из тучных клеток. Между немиелинными нервами и тучными клетками имеются мембранные контакты, которые обеспечивают сообщение центральной нервной системы с очагом воспаления.

Нейропептиды синергистически взаимодействуют в повышении проницаемости сосудов как между собой, так и с гистамином, брадикинином, С5а, фактором, активирующим тромбоциты, лейкотриеном В4; антагонистически - с АТФ и аденозином. Они оказывают также потенцирующее воздействие на привлечение и цитотоксическую функцию нейтрофилов, усиливают адгезию нейтрофилов к эндотелию венул. Кроме того, нейропептиды повышают чувствительность ноцицепторов к действию различных медиаторов, в частности простагландина Е2 и простациклина, участвуя, таким образом, в воссоздании воспалительной боли.

Кроме вышеперечисленных веществ к медиаторам воспаления относятся также ацетилхолив и катехоламины, высвобождающиеся при возбуждении холин- и адренергических структур. Ацетилхолин вызывает расширение сосудов и играет роль в аксонрефлекторном механизме артериальной гиперемии при воспалении. Норадреналин и адреналин тормозят рост сосудистой проницаемости, выступая главным образом как модуляторы воспаления.


Клетка является элементарной единицей всего живого. Вне клетки жизни нет. Размножение клеток происходит только путем деления исходной клетки, которому предшествует воспроизведение ее генетического материала. Активация деления клетки происходит вследствие воздействия на нее внешних или внутренних факторов. Процесс деления клетки с момента ее активации называется пролиферацией. Иными словами, пролиферация – это размножение клеток, т.е. увеличение числа клеток (в культуре или ткани), происходящее путем митотических делений. Время существования клетки как таковой, от деления до деления, обычно называют клеточным циклом.

Во взрослом организме человека клетки различных тканей и органов имеют неодинаковую способность к делению. Кроме того при старении интенсивность пролиферации клеток снижается (т.е. увеличивается интервал между митозами). Встречаются популяции клеток, полностью потерявшие свойство делиться. Это, как правило, клетки, находящиеся на терминальной стадии дифференцировки, например, зрелые нейроны, зернистые лейкоциты крови, кардиомиоциты . В этом отношении исключение составляют иммунные В- и Т-клетки памяти, которые, находясь в конечной стадии дифференцировки, при появлении в организме определенного стимула в виде ранее встречавшегося антигена, способны начать пролиферировать. В организме есть постоянно обновляющиеся ткани – различные типы эпителия, кроветворные ткани. В таких тканях существует пул клеток, которые постоянно делятся, заменяя отработавшие или погибающие типы клеток (например, клетки крипт кишечника , клетки базального слоя покровного эпителия, кроветворные клетки костного мозга). Также в организме существуют клетки, которые не размножаются в обычных условиях, но вновь приобретают это свойство при определенных условиях, в частности при необходимости регенерации тканей и органов.
Процесс пролиферации клеток жестко регулируется как самой клеткой (регуляция клеточного цикла, прекращение или замедление синтеза аутокринных ростовых факторов и их рецепторов), так и ее микроокружением (отсутствие стимулирующих контактов с соседними клетками и матриксом, прекращение секреции и/или синтеза паракринных ростовых факторов). Нарушение регуляции пролиферации приводит к неограниченному делению клетки, что в свою очередь инициирует развитие онкологического процесса в организме.

Активация пролиферации

Основную функцию, связанную с инициацией пролиферации, берет на себя плазматическая мембрана клетки. Именно на ее поверхности происходят события, которые связаны с переходом покоящихся клеток в активированное состояние, предшествующее делению. Плазматическая мембрана клеток за счет располагающихся в ней молекул-рецепторов воспринимает различные внеклеточные митогенные сигналы и обеспечивает транспорт в клетку необходимых веществ, принимающих участие в инициации пролиферативного ответа. Митогенными сигналами могут служить контакты между клетками, между клеткой и матриксом, а также взаимодействие клеток с различными соединениями, стимулирующими их вступление в клеточный цикл, которые получили название факторов роста. Клетка, получившая митогенный сигнал на пролиферацию, запускает процесс деления.

Клеточный цикл


Весь клеточный цикл состоит из 4 этапов: пресинтетического (G1),
синтетического (S), постсинтетического (G2) и собственно митоза (М).
Кроме того, существует так называемый G0-период, характеризующий
состояние покоя клетки. В G1-периоде клетки имеют диплоидное
содержание ДНК на одно ядро. В этот период начинается рост клеток,
главным образом, за счет накопления клеточных белков, что обусловлено
увеличением количества РНК на клетку. Кроме того, начинается подготовка к синтезу ДНК. В следующем S-периоде происходит удвоение количества ДНК и соответственно удваивается число хромосом. Постсинтетическая G2 фаза называется также премитотической. В этой фазе происходит активный синтез мРНК (матричная РНК). Вслед за этой стадией следует собственно деление клетки надвое или митоз.

Деление всех эукариотических клеток связано с конденсацией удвоенных (реплицированных) хромосом. В результате деления эти хромосомы переносятся в дочерние клетки. Такой тип деления эукариотических клеток – митоз (от греч. mitos – нити) – является единственным полноценным способом увеличения числа клеток. Процесс митотического деления подразделяют на несколько этапов: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза.

Регуляция клеточного цикла


Назначение регуляторных механизмов клеточного цикла состоит не в регуляции прохождения клеточного цикла как такового, а в том, чтобы обеспечить, в конечном счете, безошибочность распределения наследственного материала в процессе репродукции клеток. В основе регуляции размножения клеток лежит смена состояний активной пролиферации и пролиферативного покоя . Регуляторные факторы, контролирующие размножение клеток можно условно разделить на две группы: внеклеточные (или экзогенные) или внутриклеточные (или эндогенные). Экзогенные факторы находятся в микроокружении клетки и взаимодействуют с поверхностью клетки. Факторы, которые синтезируются самой клеткой и действуют внутри нее, относятся к
эндогенным факторам. Такое подразделение весьма условно, поскольку некоторые факторы, будучи эндогенными по отношению к продуцирующей их клетке, могут выходить из нее и действовать как экзогенные регуляторы на другие клетки. Если регуляторные факторы взаимодействуют с теми же клетками, которые их продуцируют, то такой тип контроля называется аутокринным. При паракринном контроле синтез регуляторов осуществляется другими клетками.

Экзогенные регуляторы пролиферации

У многоклеточных организмов регуляция пролиферации различных типов клеток происходит вследствие действия не одного какого-либо ростового фактора, а их совокупности. Кроме того, некоторые ростовые факторы, будучи стимуляторами для одних типов клеток, ведут себя как ингибиторы по отношению к другим. Классические ростовые факторы представляют собой полипептиды с молекулярной массой 7-70 кДа. К настоящему моменту известно более сотни таких ростовых факторов. Однако здесь будут рассмотрены только некоторые из них.

Пожалуй, самое большое количество литературы посвящено фактору роста из тромбоцитов (PDGF). Освобождаясь при разрушении сосудистой стенки, PDGF участвует в процессах тромбообразования и заживления ран. PDGF является мощным ростовым фактором для покоящихся фибробластов. Наряду с PDGF, не менее обстоятельно изучен эпидермальный фактор роста (EGF), который также способен стимулировать пролиферацию фибробластов. Но, кроме этого также стимулирующе влияет и на другие типы клеток, в частности на хондроциты .

Большую группу ростовых факторов составляют цитокины (интерлейкины, факторы некроза опухоли, колоние-стимулирующие факторы и т.д.). Все цитокины полифункциональны. Они могут, как усиливать, так и угнетать пролиферативные ответы. Так, например, разные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов, Th1 и Th2, продуцирующие разный спектр цитокинов, по отношению друг к другу являются антагонистами. То есть, Th1 цтокины стимулируют пролиферацию клеток, которые их продуцируют, но в то же время подавляют деление Th2 клеток, и наоборот. Таким образом, в норме в организме сохраняется постоянный баланс этих двух типов Т-лимфоцитов. Взаимодействие факторов роста с их рецепторами на поверхности клетки приводит к запуску целого каскада событий внутри клетки. В результате чего происходит активация факторов транскрипции и экспрессия генов пролиферативного ответа, что в конечном итоге инициирует репликацию ДНК и вступление клетки в митоз.

Эндогенные регуляторы клеточного цикла



В нормальных эукариотических клетках прохождение клеточного цикла жестко регулируется. Причиной онкологических заболеваний является трансформация клеток, как правило, связанная с нарушениями регуляторных механизмов клеточного цикла. Одним из основных результатов дефективности клеточного цикла является генетическая нестабильность, поскольку клетки с ущербным контролем клеточного цикла теряют способность корректно удваивать и распределять между дочерними клетками свой геном. Генетическая нестабильность приводит к приобретению новых особенностей, которые отвечают за прогрессирование опухоли. Циклин-зависимые киназы (CDK) и их регуляторные субъединицы (циклины) являются основными регуляторами клеточного цикла. Прохождение клеточного цикла достигается путем последовательной активации и дезактивации разных комплексов циклин-CDK. Действие комплексов циклин-CDK заключается в фосфорилировании ряда белков-мишеней в соответствии с фазой клеточного цикла, в которой активен тот или иной комплекс циклин-CDK . Так, например, циклин Е-CDK2 активен в поздней G1 фазе и фосфорилирует белки, необходимые для прохождения через позднюю G1 фазу и вход в S фазу. Циклин А-CDK2 активен в S и G2 фазах, он обеспечивает прохождение S фазы и вход в митоз. Циклин А и циклин Е являются центральными регуляторами репликации ДНК. Поэтому неправильная регуляция экспрессии какого-либо из этих циклинов приводит к генетической нестабильности. Было показано, что накопление ядерного циклина А происходит исключительно в тот момент, когда клетка входит в S фазу, т.е. в момент G1/S перехода. С другой стороны, было показано, что уровень циклина Е повышался после прохождения так называемой точки ограничения (R-точки) в поздней G1 фазе, а затем существенно понижался, когда клетка входила в S фазу.

Пути регуляции CDK


Активность циклин-зависимых киназ (CDK) жестко регулируется, по крайней мере, по четырем механизмам:

1) Основной способ регуляции CDK – это связывание с циклином, т.е. в свободном виде киназа не активна, и только комплекс с соответствующим циклином обладает необходимыми активностями.

2) Активность комплекса циклин-CDK также регулируется за счет обратимого фосфорилирования. Для того чтобы приобрести активность, необходимо фосфорилирование CDK, которое осуществляется при участии CDK активирующего комплекса (САК), состоящего из циклина Н, CDK7 и Mat1.

3) С другой стороны, в молекуле CDK, в регионе, ответственном за
связывание субстрата, имеются сайты, фосфорилирование которых приводит к ингибированию активности комплекса циклин-CDK. Эти сайты
фосфорилируются группой киназ, включая Wee1 киназу, и дефосфорилируются фосфатазами Cdc25. Активность этих ферментов (Wee1 и Cdc25) существенно варьирует в ответ на разные внутриклеточные события, такие как повреждения ДНК.

4) В конце концов, некоторые комплексы циклин-CDK могут быть заингибированы вследствие связывания с ингибиторами CDK (CKI). Ингибиторы CDK состоят из двух групп белков INK4 и CIP/KIP. Ингибиторы INK4 (p15, p16, p18, p19) связываются с CDK4 и CDK6 и инактивируют их, предотвращая взаимодействие с циклином D. CIP/KIP ингибиторы (p21, p27, p57) могут связываться с комплексами циклин-CDK, содержащими CDK1, CDK2, CDK4 и CDK6. Примечательно, что при определенных условиях CIP/KIP ингибиторы могут усиливать киназную активность комплексов циклин D-CDK4/6.

Регуляция G1 фазы



В G1 фазе, в так называемой точке рестрикции (ограничения, R-точка), клетка принимает решение, делится ей или нет. Точка рестрикции – это та точка клеточного цикла, после которой клетка становится невосприимчивой к внешним сигналам вплоть до завершения всего клеточного цикла. Точка рестрикции делит G1 фазу на два функционально различных этапа: G1pm (постмитотический этап) и G1ps (пресинтетический этап). В течение G1pm клетка оценивает присутствующие в ее окружении ростовые факторы. Если необходимые ростовые факторы присутствуют в достаточном количестве, то клетка переходит в G1ps. Клетки, перешедшие в G1ps период, продолжают нормальное прохождение всего клеточного цикла даже при отсутствии ростовых факторов. Если отсутствуют необходимые ростовые факторы в G1pm периоде, то клетка переходит в состояние пролиферативного покоя (G0 фаза).

Основным результатом каскада сигнальных событий, происходящих вследствие связывания ростового фактора с рецептором на поверхности клетки, является активация комплекса циклин D-CDK4/6. Активность этого комплекса существенно возрастает уже в раннем G1 периоде. Этот комплекс фосфорилирует мишени, необходимые для прохождения в S фазу. Основным субстратом комплекса циклин D-CDK4/6 является продукт гена ретинобластомы (pRb). Нефосфорилированный pRb связывается и, тем самым, инактивирует транскрипционные факторы группы E2F. Фосфорилирование pRb комплексами циклин D-CDK4/6 приводит к высвобождению E2F, который проникает в ядро и инициирует трансляцию генов белков, необходимых для репликации ДНК, в частности генов циклина Е и циклина А. В конце G1 фазы происходит кратковременное увеличение количества циклина Е, которое предвещает накопление циклина А и переход в S фазу.

Остановку клеточного цикла в G1 фазе могут вызвать следующие факторы: повышение уровня ингибиторов CDK, депривация ростовых факторов, повреждения ДНК, внешние воздействия, онкогенная активация.

Регуляция S фазы



S фаза – это этап клеточного цикла, когда происходит синтез ДНК. Каждая из двух дочерних клеток, которые образуются в конце клеточного цикла, должна получить точную копию ДНК материнской клетки. Каждое основание молекул ДНК, составляющих 46 хромосом человеческой клетки, должно быть скопировано только один раз. Именно поэтому синтез ДНК регулируется крайне жестко.

Было показано, что только ДНК клеток, находящихся в G1 или S фазе, может реплицироваться. Это наводит на мысль, что ДНК должна быть «лицензирована» для репликации и что тот кусочек ДНК, который был удвоен, теряет эту «лицензию». Репликация ДНК начинается в месте связывания белков, называемых ORC (Origin of replicating complex). Несколько компонентов, необходимых для синтеза ДНК, связываются с ORC в поздней М или ранней G1 фазе, формируя пререплекативный комплекс, что собственно и дает «лицензию» ДНК для репликации. На стадии перехода G1/S к пререплекативному комплексу добавляются еще белки, необходимые для репликации ДНК, таким образом, образуется комплекс инициации. Когда начинается процесс репликации и образуется репликативная вилка, многие компоненты отделяются от инициирующего комплекса, а в месте инициации репликации остаются только компоненты пострепликативного комплекса.

Во многих работах было показано, что для нормального функционирования инициирующего комплекса необходима активность циклин А-CDK2. Кроме того, для успешного окончания S фазы также необходима активность комплекса циклин А-CDK2, что, собственно, и является основным регуляторным механизмом, обеспечивающим успешное завершение синтеза ДНК. Остановку в S фазе может индуцировать повреждение ДНК.

Регуляция G2 фазы



G2 фаза – это этап клеточного цикла, который начинается после завершения синтеза ДНК, но до начала конденсации. Основным регулятором прохождения G2 фазы служит комплекс циклин В-CDK2. Арест клеточного цикла в G2 фазе происходит вследствие инактивации комплекса циклин В-CDK2. Регулятором перехода G2/М является комплекс циклин В-CDK1, его фосфорилирование/дефосфорилирование регулирует вход в М фазу. Повреждения ДНК или наличие нереплицированных участков предотвращает переход в М фазу.

Регуляция митоза



Митоз – это собственно деление клетки надвое. Для прохождения раннего митоза необходима активность циклина А. Однако, основным регулирующим циклином, как и в предыдущей стадии, является циклин В в комплексе с CDK1. Активность комплекса циклин В-CDK1 приводит к деградации ядерной оболочки, конденсации хроматина и формированию из конденсированных хромосом метафазной пластинки. Перед тем как клетка переходит из метафазы в анафазу, происходит деградация циклина В. Утрата активности комплекса циклин В-CDK1 индуцирует миграцию хромосом к полюсам и деление клетки надвое. В профазе активированный комплекс циклин В-CDK1 гарантирует, что переход из интерфазы в митоз необратим за счет фосфорилирования членов семейства cdc25. Таким образом, снижается ингибиторное влияние cdc25B и cdc25C на комплекс циклин В-CDK1, что образует так называемую петлю позитивной обратной связи. Следовательно, активный комплекс циклин В-CDK1 приводит к необратимому выходу из интерфазы. В ранней анафазе происходит деградация комплекса циклин В-CDK1, что в последующем приводит к образованию ядерной оболочки и цитокинезу .

Повреждения ДНК



Для того чтобы сохранить и защитить генетическую информацию, эукариотические клетки развили сигнальные или коммуникационные сети, отвечающие за восстановление и контроль повреждений ДНК. Повреждения ДНК могут быть индуцированы многими агентами, включая ионизирующее облучение, свободные радикалы и токсичные вещества. Двуцепочечные разрывы ДНК (DBS) – наиболее часто встречающиеся повреждения ДНК. Подобные повреждения могут также образовываться и при репликации ДНК, а неправильная репарация разрывов может приводить к клеточной гибели, соматическим мутациям и формированию опухолей.

Пути восстановления двуцепочечных разрывов ДНК


Существует, по крайней мере, два пути восстановления двуцепочечных разрывов: гомологичная рекомбинация (HR) и негомологичное концевое сращивание (NHEJ). В случае репарации путем HR используются гомологичные последовательности ДНК в качестве шаблона для репаративного синтеза, тогда как в случае NHEJ часто происходит простое склеивание концов в местах разрывов.
Репарация разрывов ДНК через NHEJ происходит незамедлительно на протяжении всего клеточного цикла. Хотя NHEJ эффективно сращивает концы в области разрывов, этот путь часто приводит к потере генетической информации, поскольку происходит процессинг окончаний в области разрыва нуклеазами. В отличие от NHEJ, HR происходит, главным образом, в поздней S фазе и G2 фазе, поскольку зависит от присутствия сестринских хроматид, обеспечивающих шаблон для репарации. Поскольку восстановление путем HR достигается за счет нового синтеза с использованием в качестве шаблона полноценной гомологичной ДНК, это позволяет клетке восстанавливать ДНК с высокой точностью.

Клеточный ответ на повреждения ДНК и его регуляция



В восстановлении двуцепочечных разрывов ДНК ключевую роль играют белки ATM и NBS1. ATM – это протеин киназа, которая активируется незамедлительно после появления двуцепочечных разрывов ДНК. Помимо этого, для обеспечения эффективного функционирования репарации ДНК и прохождения ключевых точек клеточного цикла высоко упорядоченная структура эукариотического хроматина должна быть соответствующим образом изменена, чтобы обеспечить доступ факторов
репарации к ДНК. Эти изменения называются хроматиновыми перестройками, они осуществляются за счет специфических комплексов, связанных с модификациями гистонов.

Для эффективного восстановления двуцепочечных разрывов клетка активирует множество различных путей. Сигнальный каскад, генерируемый в ответ на разрывы ДНК, состоит из сенсорных, медиаторных и эффекторных белков и регулируется
посттрансляционными модификациями белков, а именно их фосфорилированием и ацетилированием. Клеточный ответ на двуцепочечные разрывы ДНК инициируется распознаванием поврежденного участка молекулы сенсорными белками. ATM и
NBS1 действуют совместно как первичные сенсорные белки. Вследствие распознавания повреждений ДНК сенсорными белками медиаторы, такие как BRCA1, MDC1, 53BP1, приобретают посттрансляционные модификации, которые генерируются сенсорными белками. Эти
модифицированные медиаторные белки затем усиливают сигнал от поврежденной ДНК и передают его на эффекторы, такие как RAD51, Artemis, Chk2, p53.

АТМ является одним из основных белков, вовлеченных в сохранение генетической стабильности, контроль длины теломеры и в активацию контрольных точек клеточного цикла. NBS1 вовлечен в выполнение
тех же функций. Как было сказано выше, эти белки действуют синергично. NBS1 образует комплекс с MRE11 и RAD50 и перетаскивает этот комплекс непосредственно к поврежденному участку ДНК. Кроме того, этот комплекс RAD50/MRE11/NBS1 (RMN) необходим для привлечения АТМ в место двуцепочечного разрыва и для эффективного
фосфорилирования субстратов АТМ.

Несмотря на то, что ATM фосфорилирует многие факторы, вовлеченные в HR путь, роль его в регуляции этого пути пока остается неясной.
Функцией NBS1 в качестве основного фактора в процессе HR является регуляция клеточной локализации комплекса RMN. Главную функцию в
накоплении комплекса RMN в месте двуцепочечного разрыва выполняет домен FHA/BRCT в молекуле NBS1. Этот домен необходим не только для эффективного процесса HR, но также для правильного
использования сестринских хроматид в качестве шаблона. Таким образом, NBS1 может регулировать и сцепление сестринских хроматид, и этап промежуточной диссоциации в течение HR реакции.

Функции АТМ в процессе NHEJ заключаются в фосфорилировании нуклеазы Artemis. NBS1 также принимает активное участие в репарации путем NHEJ. Хотя роль NBS1 в NHEJ пути в клетках млекопитающих не
настолько критична как в клетках грибов, было установлено, что NBS1 необходим для проведения реакций NHEJ вблизи разрывов ДНК. NBS1
вовлечен в Artemis-опосредованный путь NHEJ, вероятно, за
счет активации АТМ. В ответ на повреждение ДНК происходит взаимодействие между комплексом RMN и нуклеазой Artemis. Таким
образом, RMN может принимать участие в двух путях восстановления разрывов ДНК в АТМ-зависимой и АТМ-независимой манере. В большей степени RMN способствует гомологичной репарации, нежели пути
негомологичного сращивания концов.

Клеточные ответы на двуцепочечные разрывы ДНК регулируются за счет посттрансляционной модификации белков, а АТМ и комплекс RMN играют ключевую роль в подобной модификации. Эти белки в
дальнейшем обеспечивают полноценную репарацию поврежденной ДНК и, как следствие, нормальную жизнедеятельность клетки.

Регенерация тканей


Регенерацией называется образование новой ткани на месте
погибшей, отмершей. В здоровом, нормальном организме все время происходит физиологическая регенерация клеток; постоянно слущивается отмерший роговой слой эпидермиса, и взамен него во внутреннем слое кожи размножаются новые клетки. Такое же слущивание покровного эпителия происходит и на слизистых оболочках. В кровеносных сосудах эритроциты обычно живут 60-120 дней. Следовательно, приблизительно в течение 2 месяцев происходит полное их обновление. Так же систематически восполняются по мере их гибели или отмирания и лейкоциты, и другие форменные элементы крови. При различных патологических процессах клетки и ткани разрушаются в большем количестве, чем в норме. Регенерации тканей
принадлежит огромное значение в процессе восстановления поврежденных тканей и органов («восстановительная регенерация»). Иначе говоря, без регенерации было бы невозможно какое-либо заживление.

В регенерации различают такие понятия, как форма регенерации, уровень регенерации, способ регенерации.

Формы регенерации:

1.Физиологическая регенерация - восстановление клеток ткани после их естественной гибели (например, кроветворение);

2. Репаративная регенерация - восстановление тканей и
органов после их повреждения (травмы, воспаления, хирургического воздействия и
так далее).

Уровни регенерации соответствуют уровням организации живой материи:

1. Клеточный (внутриклеточный);

2. Тканевой;

3. Органный.

Способы регенерации:

1. Клеточный способ (размножением (пролиферацией) клеток);

2. Внутриклеточный способ (внутриклеточное
восстановление органелл, гипертрофия, полиплоидия);

3. Заместительный способ (замещение дефекта ткани или
органа соединительной тканью, обычно с образованием рубца, например: образование рубцов в миокарде после инфаркта миокарда).

Факторы, регулирующие регенерацию:

1. Гормоны - биологически активные вещества;

2. Медиаторы - индикаторы метаболических процессов;

3. Кейлоны - это вещества гликопротеидной природы, которые синтезируются соматическими клетками, основная функция - торможение клеточного созревания;

4. Антагонисты кейлонов - факторы роста;

5. Микроокружение любой клетки.

Регуляция регенерации тканей


Регенерация тканей происходит вследствие пролиферации недифференцированных клеток, обладающих способностью не только делится под действием соответствующих стимулов, но также и дифференцироваться в клетки той ткани, регенерация которой
происходит. Эти клетки носят название взрослых стволовых клеток. Многие ткани взрослого организма, такие как ткани гемопоэтической системы, пищеварительный эпителий, мозг, эпидермис, легкие содержат пул таких клеток. Стволовые клетки тканей взрослого индивидуума снабжают организм зрелыми дифференцированными клетками в
течение нормального гомеостаза, а также во время регенерации и восстановления тканей и органов. Две уникальных особенности характеризуют взрослые стволовые клетки: способность генерировать новые (т.е. способность самообновляться) и способность давать дифференцированное потомство, которое утрачивает способность к самообновлению.

Наши знания о механизмах, которые определяют когда, где и почему стволовые клетки будут самообновляться или дифференцироваться, остаются весьма ограниченными, но, тем не менее, недавно было показано, что микроокружение (или ниша) стволовых клеток
обеспечивает необходимые сигналы для дальнейшего поведения этих клеток. Более того, утрата контроля над поведением этих клеток может приводить к трансформации клеток и раку. Дифференцированные
клетки наряду с выполнением своих специфических функций способны синтезировать особые вещества - кейлоны , тормозящие интенсивность размножения клеток-предшественников и стволовых клеток. Если в силу каких-либо причин количество дифференцированных функционирующих клеток уменьшается (например, после травмы), тормозящее действие кейлонов ослабевает и численность популяции
восстанавливается. Кроме кейлонов (местных регуляторов), клеточное размножение контролируется гормонами; одновременно продукты жизнедеятельности клеток регулируют активность желёз внутренней секреции. Если какие-либо клетки под воздействием внешних повреждающих факторов претерпевают мутации, они
элиминируются из тканевой системы вследствие иммунологических реакций.

Заключение


Исследования в области изучения механизмов контроля клеточного цикла и регуляции репарации ДНК широко ведутся во всем мире. Эта тематика является актуальной уже многие десятилетия, поскольку с нарушениями процессов деления клеток связаны многие заболевания, в частности онкологические болезни. Кроме того, процесс старения организма прежде всего связан с процессами старения клеток (это и неспособность клеток к самовоспроизведению и регенерации, неспособность к сохранению и восстановлению в случае "поломок" наследственной информации).

Огромную роль в изучении механизмов регуляции клеточного цикла сыграл британский ученый Paul Maxime Nurse. P. Nurse вместе с Leland H. Harwell и R. Timothy Hunt в 2001г. получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за открытие механизмов регуляции клеточного цикла циклинами и циклин-зависимыми киназами. P. Nurse имеет огромное количество публикаций по тематике регуляции работы отдельных клеток и организма в целом.

Известным ученым в области изучения клеточного цикла и репарации ДНК является профессор Гарвардского университета, генетик, Stephen J. Elledge . S. Elledge изучает регуляцию клеточного цикла и клеточные ответы на повреждения ДНК. Elledge, вслед за нобелевским лауреатом Paul Nurse, открывшим ключевой ген клеточного цикла Cdc2 у грибов, обнаружил гомологичный ген в клетках млекопитающих. Таким образом, ему удалось открыть регуляторные механизмы, лежащие в основе перехода из G1 в S фазу клеточного цикла, и, кроме того, выявить ошибки, происходящие на этом этапе, которые приводят к злокачественной трансформации клеток. Elledge со своим коллегой Wade Harper выделили ген р21 , который является ингибитором Cdc2 . Они показали, что мутации в этом гене наблюдаются практически в половине случаев раковых заболеваний. Также Elledge обнаружил ген р57 , член семейства р21 , который является мутированным в случае заболевания, называемого синдромом Beckwith-Wiedemann , это наследственное заболевание, при котором значительно повышен риск злокачественных новообразований. Другой областью исследования проф. Elledge является изучение вопросов, связанных с распознаванием и репарацией повреждений ДНК. Не так давно ему удалось идентифицировать фермент Chk2, который активирует белок р53 (супрессор опухолевого роста), тем самым, предотвращая деление клеток, имеющих повреждения в молекуле ДНК. В другом своем исследовании Elledge показал, что белок, известный как АТМ, участвует в репарации ДНК. А мутации в гене, кодирующем этот белок, встречаются в 10% случаев рака молочной железы. Кроме этого, Stephen Elledge разрабатывает генетические технологии для создания новых лекарственных препаратов.

Для поддержания и сохранения гомеостаза организма необходимы жесткие системы регуляции процессов, протекающих не только в целом организме, но также и процессов, протекающих на клеточном и молекулярном уровнях. Так, во избежание формирования злокачественных новообразований, в каждой делящейся клетке организма выработались механизмы, контролирующие ее деление. Причем этот контроль осуществляется как внеклеточными, так и внутриклеточными факторами. В процессе старения организма не только снижается пролиферативная активность клеток, но также нарушаются процессы, регулирующие эту активность. Именно поэтому с возрастом повышается риск возникновения онкологических заболеваний. В связи с этим, необходимо детальное изучение механизмов регуляции пролиферации и регенерации, дабы предотвратить и/или предупредить последствия бесконтрольных процессов, протекающих в клетке и в организме, в целом.

Andreas Sturm Claudio Fiocchi and Alan D. Levine

7. CELL BIOLOGY: What a Cell Should Know (But May Not).

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Регуляция пролиферации опухолевых клеток

1.1.1. Основные регуляторные механизмы пролиферативной активности в клетках млекопитающих

1.1.2. Особенности регуляции пролиферативных процессов в опухолевых клетках

1.2. Регуляция апоптоза в опухолевых клетках

1.2.1. Характеристика процесса апоптоза, его основные этапы и механизмы регуляции

1.2.2. Нарушение регуляции апоптоза в опухолевых клетках

1.3. Регуляция пролиферации и апоптоза клеток свободными радикалами

1.3.1. Характеристика основных форм свободных радикалов в живых системах

1.3.2. Свободные радикалы и канцерогенез

1.3.3. Свободно-радикальные механизмы противоопухолевого действия антрациклиновых антибиотиков

1.3.4. Антиоксидантные ферменты как регуляторы концентрации свободных радикалов в клетках

1.3.5. Антиоксидантные ферменты в различных типах опухолевых клеток

1.3.6. Роль свободных радикалов и антиоксидантных ферментов в регуляции пролиферативной активности клеток

1.3.7. Механизмы индукции апоптоза свободными радикалами

1.4. Роль оксида азота в регуляции пролиферативной активности и апоптоза клеток

1.4.1. Характеристика и основные пути образования оксида азота в опухолевых клетках

1.4.2. Участие оксида азота в регуляции пролиферативных процессов

1.4.3. Двойственная роль оксида азота в регуляции апоптоза

1.4.4. Сочетанное действие оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию и индукцию апоптоза опухолевых клеток

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования

2.1. Материал и объекты исследования

2.2. Методы исследования

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

3.1. Исследование влияния активированных кислородных метаболитов и оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток in vitro 95 Влияние активированных кислородных метаболитов на пролиферативную активность опухолевых клеток

Влияние доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток

3.2. Исследование влияния активированных кислородных метаболитов и оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках 106 Исследование влияния активированных кислородных метаболитов на индукцию апоптоза в опухолевых клетках

Исследование влияния доноров оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках

3.3. Исследование кинетики взаимодействия экзогенных свободно-радикальных агентов с опухолевыми клетками 113 Исследование кинетики распада гидроперекиси третичного бутила в клеточных суспензиях

Исследование антирадикальной активности супернатантов опухолевых клеток

3.4. Изучение роли арахидоновой кислоты в регуляции пролиферации опухолевых клеток 119 Включение -арахидоновой кислоты в фосфолипиды при переходе опухолевых клеток от состояния пролиферации в состояние покоя

Влияние свободных радикалов и оксида азота на выход арахидоновой кислоты и её включение в опухолевые клетки и в отдельные фосфолипиды

Регуляция активности ферментов метаболизма фосфолипидов свободными радикалами

3.5. Исследование зависимости активности антиоксидантных ферментов от выраженности пролиферативных процессов в опухолях в эксперименте

Активность антиоксидантных ферментов в карциномах Эрлиха с различной степенью выраженности пролиферативных процессов 147 Активность антиоксидантных ферментов в зависимости от митотического индекса доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы

3.6. Исследование комбинироанного влияния свободных радикалов и оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток 157 Сочетанное действие оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию опухолевых клеток 157 Роль оксида азота в регуляции апоптоза опухолевых клеток, индуцированного свободными радикалами

Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность доксорубицина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами»

Злокачественные новообразования являются одной из главных причин смертности в большинстве промышленно развитых стран. О глобальной величине проблемы онкологической заболеваемости и смертности можно судить на основе экспертных оценок, проводимых Международным агентством по изучению рака. Так, в 2000 г. в мире количество вновь заболевших раком оценивалось более чем в 10 млн. человек, а количество умерших - в 6,2 млн. . Прогнозируется увеличение заболеваемости злокачественными опухолями до 15 млн. к 2020 г., одновременно смертность возрастёт до 9 млн. в год . Важнейшим условием успеха противораковой борьбы является знание механизмов патогенеза злокачественного роста, необходимое для формирования адекватной терапевтической стратегии. Современное понимание этиологии и механизмов возникновения рака, достигнутое благодаря прогрессу в фундаментальной медицине и биологии, даёт представление о ряде принципиальных свойств, которыми обладают злокачественные опухоли. Ключевыми параметрами опухолевого роста являются повышенная способность к пролиферации, утрата способности к полной дифференцировке и апоптотической гибели, инвазивный рост и метастазирование . Благодаря этим свойствам опухолевые клетки имеют преимущество перед клетками нормальных тканей во время роста и выживания в одинаковых условиях. Однако несмотря на огромные усилия, прилагаемые во всём мире, и успехи, достигнутые в области изучения рака, проблема этиопатогенеза злокачественных опухолей остаётся в целом пока нерешённой.

Исследование клеточных и молекулярных механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток является одной из приоритетных направлений современной онкологии и патологической физиологии. В здоровых тканях устанавливается баланс между процессами пролиферации и гибели клеток . В противоположность этому, злокачественный рост основан на автономной и неограниченной пролиферации клеток, составляющих ткань опухоли . Вместе с тем, в трансформированных клетках возникает резистентность к индукции апоптоза, что также является одним из ключевых механизмов их выживания . Клеточные механизмы запуска и активации апоптоза нарушаются в результате генетических мутаций, что приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной смерти и определяет прогрессирование опухолевого процесса, а также может являться одной из причин множественной лекарственной резистентности . Изучение механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток важно не только с точки зрения понимания патогенетических особенностей развития и функционирования опухолей, оно также позволяет определить новые направления терапии злокачественных новообразований. /

В последнее время достигнуты значительные успехи в исследовании роли молекул различных классов в регуляции роста клеток. Регуляторные молекулы, прежде всего гормоны и факторы роста, вступают во взаимодействие с клеточными структурами, также к ростмодулирующим факторам относят и события, происходящие внутри клеток при передаче сигнала с участием медиаторных систем. В понимании механизмов, контролирующих размножение клеток, важную роль играет выяснение природы внутриклеточных сигналов ответственных за переключение метаболизма на новый уровень при смене состояния пролиферации и покоя.

Активированные кислородные метаболиты (АКМ), такие как супероксидный анион-радикал, гидроксильный, алкоксильный и пероксидный радикалы, оксид азота (N0) и др. являются обязательными компонентами нормального функционирования клеток . Они играют важную роль в регуляции активности ферментов, поддержании стабильности мембран, транскрипции некоторых генов, являются необходимыми элементами функционирования ряда медиаторных систем и выступают в качестве посредников в формировании клеточного ответа. Это стимулирует большой интерес к изучению роли свободных радикалов в регуляции пролиферации опухолевых клеток .

Накапливающиеся в литературе данные о молекулярных механизмах действия различных свободно-радикальных молекул свидетельствуют об их участии в регуляции роста и дифференцировки клеток . Известно, что супероксидный радикал и перекись водорода в низких концентрациях стимулируют деление клеток . Оксид азота также участвует в регуляции пролиферации различных клеток, в том числе и опухолевых .

Антиоксидантные ферменты (АОФ), контролируя концентрацию радикалов, могут выступать в качестве регуляторов пролиферации . Подтверждением данного предположения является факт обратной корреляции между скоростью роста гепатомы и содержанием в ней Си, Ъа - супероксиддисмутазы . Таким образом, высокая активность АОФ является не только фактором устойчивости опухолей к свободно-радикальным воздействиям, но и может тормозить неограниченное деление клеток неоплазмы.

В патогенезе онкологических заболеваний исключительно важное значение имеет нарушение программируемой клеточной гибели (апоптоза). Данные многих исследований свидетельствуют о том, что, в силу своей высокой химической активности, АКМ могут повреждать внутриклеточные структуры и быть индукторами и медиаторами апоптоза . Факторы химической и физической природы, которые при действии на клетки вызывают окислительный стресс, также индуцируют апоптоз. К таким факторам относятся ионизирующее излучение и некоторые противоопухолевые препараты (например, антрациклиновые антибиотики и цисплатин), которые, проникая в клетку, приводят к образованию свободных радикалов . Предполагается, что характер действия АКМ на клетки связан с их внутри- и внеклеточным уровнем , однако при этом не выявлено определенных закономерностей, что делает актуальным изучение влияния кислородных радикалов на пролиферацию и на апоптоз опухолевых клеток в зависимости от концентрации.

Оксид азота, являясь регулятором внутри- и межклеточных процессов, принимает непосредственное участие в реализации апоптотической программы. Считается, что оксид азота может усиливать цитотоксичность свободных радикалов, причем ЫО-генерирующие соединения, вступая в реакцию свободно-радикального окисления, могут образовывать еще более токсическое соединение - пероксинитрит, который повреждает ДНК и вызывает ковалентные модификации белков в клетке, инициируя тем самым апоптоз . Однако во многих исследованиях N0 рассматривается, скорее, как антиоксидант, который тормозит развитие радикальных окислительных реакций . При этом нет однозначного ответа на вопрос, является N0 активатором или ингибитором апоптоза.

Ряд принципиальных вопросов, важных для понимания закономерностей взаимодействия свободно-радикальных молекул с опухолевыми клетками и регуляторных механизмов пролиферации опухолевых клеток остаётся неизученным. К ним относится, в частности, выяснение того, какие события являются первоначальными и определяющими во взаимодействии опухолевых клеток с органическими гидропероксидами. В настоящее время только в единичных исследованиях учитывается возможность и важность модуляции активированными кислородными метаболитами различных этапов регуляции клеточного деления: лиганд-рецепторных взаимодействий, функционирования системы «вторичных посредников», активации и/или ингибирования эффекторных молекул клеток. Недостаточно исследованы механизмы влияния АКМ на ключевые компоненты внутриклеточной сигнальной системы опухолевых клеток. Остается не изученным вопрос о совместном влиянии кислородных радикалов и N0 на пролиферативный потенциал опухолевых клеток. Решение этих вопросов могло бы послужить основой для понимания патогенетических механизмов необластомогенеза, а это в свою очередь -разработать более эффективные подходы к комплексной патогенетической терапии злокачественных новообразований.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение роли свободных радикалов, оксида азота и антиоксидантных ферментов в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

4. Изучить роль арахидоновой кислоты в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оценить эффект свободно-радикальных агентов на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток и показать роль ферментов метаболизма фосфолипидов в этом процессе.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование влияния веществ, генерирующих свободные радикалы, и доноров оксида азота в широком спектре концентраций на активность пролиферативных процессов в клетках экспериментальных опухолевых линий и индукцию в них апоптоза. Выявлено, что направленность действия исследованных соединений меняется в зависимости от концентрации, а именно, с уменьшением дозы снижается ингибиующее влияние на пролиферацию и индукцию апоптоза и при достижении концентрации 10"6 М и менее наблюдается стимуляция клеточного размножения.

Впервые исследована кинетика взаимодействия органических пероксидов с опухолевыми клетками и обнаружена экстраклеточная продукция глутатионпероксидазы и низкомолекулярных компонентов, обладающих антирадикальной активностью.

Впервые показана концентрационная зависимость влияния свободных радикалов на освобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран и связь этого процесса с пролиферацией и апоптозом опухолевых клеток. Установлено, что под действием АКМ в высоких концентрациях, ингибирующих пролиферативные процессы и индуцирующих апоптоз, наблюдается значительный выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран и ингибирование ее включения в них. В противоположность этому, АКМ в низких дозах, стимулирующих пролиферацию, приводят к менее выраженному выходу жирной кислоты с сохранением репарации фосфолипидов. При этом показано, что выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опосредован активацией фосфолипазы А.Влияние оксида азота на данные процессы носило ту же направленность, но выражено в меньшей степени.

Получены новые данные о зависимости активности антиоксидантных ферментов от выраженности пролиферативных процессов в клетках экспериментальной опухоли, доброкачественных и злокачественных опухолях молочной железы человека. Быстрорастущие опухоли характеризуются низкой активностью антиоксидантных ферментов, тогда как при уменьшении степени выраженности пролиферативных процессов происходит увеличение активности антиоксидантных ферментов.

Впервые показана способность доноров оксида азота (нитрит натрия, нитропруссид натрия и Ь-аргинин) защищать опухолевые клетки от токсического действия пероксирадикалов и доксорубицина. Экспериментально доказана возможность использования донора N0 -нитрозогуанидина для увеличения противоопухолевой эффективности доксорубицина.

Теорерическая и практическая значимость

Результаты исследования существенно расширяют фундаментальные представления о механизмах регуляции пролиферативной активности и апоптотической гибели опухолевых клеток. Показано, что вещества, генерирующие свободные радикалы, и доноры оксида азота в зависимости от концентрации могут активировать как пролиферативную активность, так и апоптоз опухолевых клеток, что подтверждает существование общей для этих процессов внутриклеточной регуляторной системы, частью которой являются радикалы кислорода и азота.

Полученные результаты формируют новые представления о биохимических закономерностях взаимодействия опухолевых клеток с активированными кислородными метаболитами, доказывая возможность экстраклеточной регуляции уровня свободно-радикального окисления и взаимодействия пероксидов с внутриклеточной сигнальной системой.

Данные о взаимосвязи активности антиоксидантных ферментов с интенсивностью пролиферативных процессов могут послужить основой для выбора дополнительных информативных критериев при оценке биологических характеристик опухолей, в частности, их пролиферативной активности, которые, в свою очередь, можно использовать в качестве факторов прогноза. Полученные данные свидетельствуют о том, что доноры оксида азота могут защищать опухолевые клетки от свободно-радикального повреждения и выступать в качестве факторов развития лекарственной разистентности. Все это должно способствовать при назначении химиотерапии более тщательному отбору препаратов, которые могут стимулировать образование оксида азота и пероксидов в организме пациентов со злокачественными заболеваниями. Кроме того, в работе экспериментально обоснована возможность использования доноров оксида азота для увеличения противоопухолевой эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Положения, выносимые на защиту 1. Супероксидный радикал, органические пероксиды и доноры оксида азота в зависимости от концентрации могут проявлять как цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам и индуцировать их апоптоз, так и стимулировать их пролиферацию.

2. Влияние пероксидов и доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опосредуется взаимодействием с сигнал-передающей системой липидной природы, включающей арахидоновую кислоту.

3. Активность антиоксидантных ферментов снижена в фазу быстрого логарифмического роста экспериментальных опухолей по сравнению с фазой медленного стационарного роста и в злокачественных опухолях молочной железы с наивысшим митотическим индексом.

4. Доноры оксида азота (нитрит натрия, нитропруссид натрия и L-аргинин) снижают ингибирующий эффект пероксирадикалов на пролиферацию опухолевых клеток и тормозят индукцию апоптоза in vitro.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Симпозиуме стран СНГ «Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации» (Москва, 28-29 сентября 1993 г.), на V Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 29-30 ноября 1993 г.), на VI симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 3-6 октября 1994 г.), на Second International Conference on Clinical Chemiluminescence (Berlin, Germany, April 27-30, 1996), на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 19-32 мая 1997 г.), на International Conference "Regulation of biological processes by free radicals: role of antioxidants, free radical scavengers, and chelators" (Москва-Ярославль, 10-13 мая 1998 г.), на региональной научной конференции «Актуальные вопросы кардиологии» (Томск, 14-15 сентября 2000 г.), на 7th ESACP Congress (Caen, France, April 1-5 2001), на 7th International Conference "Eicosanoids & other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases" (Nashville, USA, October 14-17, 2001), на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 16-19 апреля 2002 г.), на 3 съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, 25-28 мая 2004 г.).

Публикации

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 248 страницах и иллюстрирована 29 рисунками и 19 таблицами. Библиография включает 410 литературных источников, из которых 58 отечественных и 352 иностранных.

Похожие диссертационные работы по специальности «Онкология», 14.00.14 шифр ВАК

  • Механизмы регуляции активности естественных супрессорных клеток в норме и при опухолевом росте 2005 год, доктор медицинских наук Бельский, Юрий Павлович

  • Некоторые механизмы влияния опухоли на иммуносупрессорные и противоопухолевые свойства клеток костного мозга в эксперименте 2002 год, кандидат медицинских наук Трофимова, Евгения Сергеевна

  • Ионный механизм регуляции роста популяций нормальных и опухолевых клеток в организме 2011 год, доктор биологических наук Замай, Татьяна Николаевна

  • Роль нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда 2007 год, доктор биологических наук Успенская, Юлия Александровна

  • Свободнорадикальные механизмы в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток 2005 год, кандидат биологических наук Соломка, Виктория Сергеевна

Заключение диссертации по теме «Онкология», Кондакова, Ирина Викторовна

1. Влияние свободных радикалов на пролиферацию опухолевых клеток носит дозозависимый характер. Радикалы кислорода (супероксидный радикал, органические пероксиды) и доноры оксида азота в высоких

3 5 концентрациях (10" -10" М) ингибируют пролиферацию, а в низких (10"б-10"9 М) проявляют ростстимулирующую активность по отношению к асцитным опухолевым клеткам. Исключение составляет нитрозогуанидин, который в спектре исследованных концентраций не активирует пролиферативные процессы в опухолевых клетках.

2. Степень индукции апоптоза опухолевых клеток органическими пероксидами и донорами оксида азота более выражена при увеличении концентрации используемых соединений. Усиление программируемой гибели клеток сопровождается ингибированием их пролиферативной активности.

3. Кинетика взаимодействия экзогенных пероксидов с асцитными опухолевыми клетками характеризуется более медленным распадом по сравнению с нормальными клетками (лимфоцитами и эритроцитами).

4. Опухолевые клетки секретируют экстраклеточно глутатионпероксидазу и низкомолекулярные соединения небелковой природы, обладающие антирадикальной активностью.

5. Состояние пролиферативной активности трансформированных клеток характеризуется усилением метаболизма фосфолипидов, которое выражается в увеличении включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран, главным образом в фосфатидилхолин и кардиолипин, по сравнению с покоящимися клетками.

6. При действии свободных радикалов в концентрациях, стимулирующих пролиферацию, наблюдается трехкратное увеличение выхода арахидоновой кислоты из фосфолипидов опухолевых клеток при сохранении репаративных процессов в мембранах, а при действии токсических доз - семикратное увеличение, которое сопровождается полным ингибированием процессов репарации мембран. Эффект доноров оксида азота носит ту же направленность, но выражен в меньшей степени. Главную роль в выходе арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов играет фосфолипаза А2.

7. В асцитных и солидных опухолях карциномы Эрлиха в фазу быстрого логарифмического роста наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) по сравнению с фазой медленного стационарного роста.

8. В фиброаденомах молочной железы активность антиоксидантных ферментов возрастает при увеличении митотического индекса опухоли. В противоположность этому, в тканях рака молочной железы наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов при наиболее высоких значениях митотического индекса.

9. Доноры оксида азота (нитропруссид натрия, нитрит натрия, Ь-аргинин) уменьшают степень ингибирования пролиферации опухолевых клеток, вызванную веществами, генерирующими пероксирадикалы, и ингибируют апоптоз, индуцированный свободными радикалами.

10. Комбинация доноров оксида азота (нитропруссид натрия, нитрит натрия, Ь-аргинин) в концентрации 10-4-10"5 м и доксорубицина

5 7 приводит к снижению опухолетоксичности антибиотика (10" - 10" М). Нитропруссид натрия, нитрит натрия в концентрации 10~3 М и нитрозогуанидин в концентрации 10"4 М усиливают опухолетоксичное действие доксорубицина.

11. Нитрозогуанидин повышает терапевтическую эффективность доксорубицина в эксперименте, уменьшая размер карциномы Эрлиха в 3 раза и увеличивая уровень индукции апоптоза и некроза опухолевых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе злокачественного роста лежит прогрессирующее и автономное увеличение генетически нестабильной клеточной массы, в которой постоянно происходит отбор клеток с наиболее агрессивным потенциалом. Нарушение регуляции количества клеток в опухолях является результатом дисбаланса процессов пролиферации и апоптоза . Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, стало в последние годы одной из самых актуальных проблем современной онкологии и патологической физиологии. Важность решения этой задачи определяется взаимосвязью нарушений регуляции процессов размножения и гибели клеток с возникновением и развитием злокачественных опухолей, что необходимо для понимания патогенеза рака, а также поиска новых направлений терапии злокачественных новообразований.

В настоящее время механизмы регуляции пролиферативной активности и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами изучены недостаточно. Важной задачей является выявление ведущих механизмов, ответственных за конечные биологические эффекты данного класса молекул. По литературным данным, регуляция свободными радикалами пролиферативной активности и апоптоза - мультифакторный процесс, который осуществляется через их взаимодействие со специфическими сигнал-передающими системами . Важная роль в регуляции роста опухолевых клеток и их гибели принадлежит свободному радикалу N0", который является важнейшим биологическим эффектором . Однако лишь в единичных исследованиях учитывается возможность и важность модуляции свободными радикалами различных этапов регуляции жизнедеятельности клеток, включающих изменение активности ферментов, экспрессию генов и др . До настоящего времени антиоксидантные ферменты практически не рассматривались с позиции их возможной роли в регуляции пролиферативных процессов посредством изменения уровня окислительного метаболизма в клетках.

Вопрос о влиянии низких доз свободных радикалов на мембранные компоненты - фосфолипиды и ферменты их метаболизма остается одним из наименее изученных. Недостаточно раскрыта роль оксида азота и его комбинации с другими свободно-радикальными молекулами в реализации пролиферативных или апоптотических механизмов. Очевидно, существенное, хотя пока недостаточно выясненное влияние имеет N0 на противоопухолевую терапию. Не исследована возможность использования соединений, генерирующих оксид азота, для усиления эффективности тех видов противоопухолевой терапии, механизм действия которых основан на свободно-радикальном повреждении злокачественной ткани, к которым относится химиотерапия антрациклиновыми антибиотиками.

Эти обстоятельства послужили отправным пунктом при постановке цели, которая заключалась в исследовании роли свободных радикалов, оксида азота и антиоксидантных ферментов в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. При этом предполагалось:

1. Изучить влияние активированных кислородных метаболитов, органических пероксидов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток.

2. Исследовать влияние активированных кислородных метаболитов и оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках.

3. Изучить кинетику взаимодействия экзогенных пероксидов с опухолевыми клетками и выяснить роль ферментативных и неферментативных антиоксидантов в этом процессе.

4. Изучить роль арахидоновой кислоты в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оценить эффект свободно-радикальных агентов на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток и показать ферментов метаболизма фосфолипидов в этом процессе.

5. Исследовать зависимость активности антиоксидантных ферментов от скорости пролиферации и структурной организации опухолей в эксперименте.

6. Оценить связь активности антиоксидантных ферментов с пролиферацией клеток доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы.

7. Исследовать совместное влияние свободно-радикальных агентов и NO-генерирующих соединений на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.

8. Исследовать влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.

9. Оценить возможность применения доноров оксида азота для повышения терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Исследование влияния свободных радикалов и доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток проводилось на экспериментальных моделях мастоцитомы Р-815 и асцитной карциномы Эрлиха.

В результате проведенных исследований было установлено, что действие различных кислородных радикалов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха зависело от концентрации и химической структуры используемых соединений. Общая тенденция влияния их на опухолевые клетки заключалась в выраженном цитотоксическом эффекте высоких т с концентраций (10" - 10" М), что выражалось в снижении уровня синтеза ДНК и, соответственно, пролиферативной активности. При снижении концентрации (1(У6 М и ниже) происходило уменьшение цитотоксического действия, непосредственно переходящее в стимуляцию пролиферации опухолевых клеток. Эта закономерность была выявлена в действии супероксидного радикала, 2,2"азо-бис(2-амидинопропана) (АБАП), продуцирующего пероксирадикалы, гидропероксида третичного бутила, пероксида линоленовой кислоты, и доноров оксида азота за исключением нитрозогуанидина, который не оказывал стимулирующего влияния на синтез ДНК в изученном спектре концентраций. Слабое увеличение пролиферативной активности оказало добавление Ь-аргинина в суспензии обеих клеточных культур. Ингибирование ЪЮ-синтазной реакции метиловым эфиром нитроаргинина практически не изменяло скорость синтеза ДНК опухолевых клеток мастоцитомы Р-815, а в клетках карциномы Эрлиха приводило почти к 50% снижению этого процесса. Эти данные свидетельствуют о различном вкладе N0, образующегося в N0-синтазной реакции, в обеспечение рострегуляторных процессов в различных типах опухолевых клеток. Подобная концентрационная зависимость была выявлена и при действии доксорубицина на синтез ДНК п в опухолевых клетках. Были обнаружены концентрации антибиотика (10" М и ниже), стимулирующие пролиферативные процессы в опухолях. Следует отметить существование общего диапазона концентраций для всех соединений, генерирующих свободные радикалы, включая доксорубицин

10" - 10" М), в которых они проявляют ростстимулирующие свойства. Из всех исследованных АКМ наименее токсичным оказался супероксидный анионрадикал, который стимулировал пролиферацию клеток начиная с концентрации 6><10"6 М.

Полученные в настоящей работе данные согласуются с результатами исследования Оо1оЬ У. и соавт. , которые также выявили зависимость пролиферативной активности опухолевых клеток от концентрации АКМ.

Установлено, что липидные гидроперекиси в концентрации 1(Г6 М и ниже стимулируют деление клеток рака толстой кишки. Авторы полагают, что возможным механизмом данного процесса является увеличение экспрессии циклина и циклинзависимой киназы 4, фосфорилирование ретинобластомного белка, что способствует переходу клеток из фаз О0 и От в фазу 8, во время которой происходит синтез ДНК. Повышение концентрации липидных перекисей и времени воздействия приводило к окислительному повреждению ДНК и остановке митоза в фазе О0 /Оь что способствовало прекращению роста клеточной популяции. Эти данные, также как и полученные в настоящей работе результаты, являютя доказательством участия кислородных радикалов в регуляции пролиферативной активности опухолевых клеток.

В настоящее время трудно что-либо сказать о времени, требуемом для индукции деления опухолевых клеток под действием свободных радикалов. Эксперименты по определению времени индукции пролиферации бактериальных штаммов и гепатоцитов показали, что супероксидный радикал начинает индуцировать пролиферативный ответ через 20 минут от начала инкубации. Требуются дополнительные исследования для определения этого параметра в культурах опухолевых клеток и тканей.

Таким образом, можно заключить, что уровень интенсивности окислительного стресса определяет его конечный биологический эффект в диапазоне от разрушающего цитотоксического действия при высоких концентрациях окислительных агентов до регуляции функционального состояния клеток при физиологических концентрациях. В ряду различных физиологических функций свободных радикалов важную роль занимает способность влиять на пролиферативную активность клеток.

Баланс между процессами пролиферации и апоптоза необходим для развития нормальных тканей . Следствием нарушения равновесия между ними является неограниченный злокачественный рост. Поэтому изучение эффектов свободных радикалов на пролиферацию опухолевых клеток целесообразно в комплексе с оценкой их влияния на апоптоз. Исследование воздействия пероксидов на программируемую клеточную гибель клеток карциномы Эрлиха показало, что к наиболее выраженным результатам приводило использование гидропероксида третичного бутила, который индуцировал апоптоз в микромолярных концентрациях, тогда как для АБАП требовалось повышение действующих доз до 10" . Снижение концентрации пероксирадикалов в среде инкубации приводило к ингибированию процесса апоптоза. Возможным механизмом индукции апоптоза прооксидантами, вероятно, является окисление или восстановление 8Н-групп белков - медиаторов программируемой клеточной гибели, таких как факторы транскрипции с-Боб, с-Дт, АР-1 и др. .

В отличие от пероксирадикалов, действие доксорубицина на индукцию апоптоза, носило волнообразный характер и с повышением концентрации не наблюдалось роста программируемой гибели опухолевых клеток. Это дает основание предположить, что в высоких концентрациях основной формой реализации противоопухолевого эффекта антибиотика является индукция некроза опухолевых клеток. Стоит отметить, что наряду с увеличением апоптотической гибели при действии доксорубицина в низких концентрациях увеличивалась и пролиферативная активность опухолевых клеток. Вероятно, это обусловлено существованием универсальных сигнальных путей, которые принимают участие в регуляции обоих процессов . о

Применение доноров оксида азота в концентрации приводило к достоверной активации индукции апоптоза по сравнению с контрольным уровнем. Снижение концентрации исследуемых доноров до 10"5М вызывало ингибирование запуска апоптотической программы. Увеличение числа апоптотически погибших клеток в 1,5 раза выше контрольного наблюдалось под действием Ь-аргинина.

Таким образом, при анализе полученных нами данных была отмечена концентрационная зависимость действия веществ, генерирующих свободные радикалы, включая доноры оксида азота, на пролиферативную активность и индукцию апоптоза опухолевых клеток. Высокие концентрации этих соединений угнетали пролиферативную активность и индуцировали апоптоз опухолевых клеток. Снижение концентрации действующих агентов в среде инкубации приводило к увеличению пролиферации опухолевых клеток и снижению процесса запуска программируемой клеточной смерти. В целом, редокс-потенциал может являться важным фактором влияния на кинетику опухолевого роста, которая определяется митотической и апоптотической активностью клеток.

Феномены стимуляции и ингибирования пролиферации опухолевых клеток под действием соответственно низких и высоких концентраций пероксидных радикалов, доксорубицина и МЭ-генерирующих соединений являются небезинтересными с теоретической и практической точек зрения. С теоретической точки зрения, полученные результаты хорошо согласуются с концепцией Г. Селье и существующими представлениями, основанными на многочисленных данных литературы о том, что малые дозы токсических веществ (слабый химический стресс) оказывают стимулирующее действие, а высокие их дозы оказывают соответственно повреждающее действие, вплоть до гибели клеток . Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение в системе регуляции синтеза оксида азота и активных форм кислорода могут быть далеко небезразличны для пролиферативной активности опухолевых клеток. С практической точки зрения, полученные результаты представляют интерес в связи с тем, что реальные популяции опухолевых клеток в организме онкологических больных гетерогенны и изменчивы по многим фенотипическим признакам. В связи с этим нельзя исключить возможность существования клонов клеток в одном опухолевом узле с различным порогом чувствительности к лучевым и химиотерапевтическим воздействиям. Вследствие этого, специфическая противоопухолевая терапия может, привести к гибели значительной массы опухолевых клеток, но в то же время оказать стимулирующее воздействие на пролиферацию отдельных высокорезистентных клеток, в результате чего может наступить генерализация опухолевого процесса.

Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток - сложный многостадийный процесс, включающий на начальном этапе взаимодействие регуляторной молекулы со специфическими рецепторами. Поскольку в настоящее время не охарактеризован рецепторный аппарат для свободно-радикальных молекул (за исключением оксида азота), то для выяснения механизма, с помощью которого эти вещества могут влиять на сложную регуляторную внутриклеточную систему, представлялось необходимым исследовать параметры взаимодействия пероксирадикалов с плазматической мембраной и их влияние на метаболизм основных липидных компонентов мембран - фосфолипидов.

Результатом взаимодействия гидроперекиси третичного бутила с плазматическими мембранами опухолевых клеток являлось ее разложение с образованием пероксидных радикалов, которые могут дать начало цепи окисления липидов, белков и ДНК . Изучение кинетики разложения ГПТБ в суспензии клеток мастоцитомы Р-815, лимфомы ЕЬ-4 и карциномы Эрлиха показало, что этот процесс в опухолевых клетках протекает значительно медленнее по сравнению с нормальными. Кроме того, была выявлена экстрацеллюлярная продукция белков, обладающих глутатионпероксидазной активностью, и низкомолекулярных соединений с выраженной антирадикальной активностью. Это свидетельствует о существовании экстраклеточного уровня защиты опухолевых клеток от окислительного воздействия, что подтверждается данными ЗапсМгот , показавшими способность клеток лейкемии человека экстраклеточно продуцировать каталазу.

Другим аспектом взаимодействия свободных радикалов с мембранами является влияние на метаболизм фосфолипидов, в состав которых входит арахидоновая кислота. Она является предшественником важного класса физиологически-активных соединений - эйкозаноидов, которые многими исследователями рассматриваются в качестве местных гормонов и влияют на внутриклеточные процессы, в том числе пролиферацию . В настоящей работе показано, что при активации пролиферации трансформированных фибробластов наблюдается усиление метаболизма арахидоновой кислоты, которое выражается в увеличении ее включения в фосфолипиды, главным образом, в фосфатидилхолин и кардиолипин.

Изучение влияния свободных радикалов на выход и включение арахидоновой кислоты в мембраны опухолевых клеток показало, что гидропероксид третичного бутила в низких концентрациях, активирующих пролиферацию опухолевых клеток, усиливал в 3 раза высвобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов не влияя на процесс ее включение в них. При действии токсических доз ГПТБ было обнаружено, что пероксид значительно (в 7 раз) стимулировал выход жирной кислоты из клеточных фосфолипидов и ингибировал репаративные процессы, что может быть важным фактором в нарушении структурно-функциональого состояния мембран. Выход -арахидоновой кислоты был связан с активацией ФЛА, в то время как активности лизофосфолипид липазы, ацилСоА: лизофосфатидилхолин ацилтрансферазы и ацилСоА синтетазы не менялись под действием ГПТБ.

Аналогичным, но менее выраженным действием обладали доноры оксида азота. Инкубация опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 в среде содержащей МаЫСЬ в различных концентрациях приводила к увеличению выхода -арахидоновой кислоты из мембран фосфолипидов на 36% по сравнению с контрольным уровнем. В то же время Ь-аргинин не оказывал активирующего воздействия на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток. Исследование включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран опухолевых клеток о показало, что добавление №N02 в высоких концентрациях (10" М) в среду инкубации опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 приводило к ингибированию этого процесса.

Таким образом, действие ГПТБ и доноров оксида азота в концентрациях, стимулирующих пролиферацию, выражается увеличении выхода жирной кислоты, которая в дальнейшем может использоваться как субстрат для синтеза биологически активных эйкозаноидов . Метаболиты арахидоновой кислоты участвуют в передаче пролиферативного сигнала и увеличение ее содержания под действием свободных радикалов может являться одной из причин приводящей к усиленной пролиферации опухолевых клеток. С другой стороны, чрезмерное повышение уровня свободной арахидоновой кислоты внутри клеток, которое наблюдалось при действии ГПТБ и донора оксида азота в высоких дозах, обладающих токсическим эффектом, приводит к апоптотической гибели клеток неоплазмы. Участие свободной арахидоновой кислоты в индукции апоптоза подтвердается исследованиями, в которых показана ее важная роль в активации каспаз

96, 160] и повышении проницаемости мембран митохондрий для цитохрома С и АП7 .

Параллельно с увеличением концентрации свободной арахидоновой кислоты при действии токсических доз пероксида наблюдалось накопление продукта фосфолипазного гидролиза - лизофосфатидилхолина. Лизофосфатидилхолин также считается цитотоксичным продуктом, который является детергентом, разрушающим стабильность липидного б и слоя . Индукция апоптоза опухолевых клеток может быть следствием увеличения содержания как свободной арахидоновой кислоты, так и лизофосфолипидов под действием высоких концентраций свободных радикалов.

Таким образом, нами установлено, что регуляция как пролиферативной активности опухолевых клеток, так и индукции апоптоза может осуществляться свободными радикалами через влияние на уровень свободной арахидоновой кислоты, которая, вероятно, является одним из компонентов универсального пути передачи внутриклеточного сигнала. Переключение и определение конкретного пути реализации сигнала зависит от концентрации действующего агента.

Для поддержания стационарного уровня свободных радикалов и блокирования цепных реакций в клетках экспрессируются антиоксидантные ферменты, которые могут оказывать существенное влияние на все физиологические процессы, регулируемые этими высокоактивными молекулами . Так, в представленной работе обнаружена взаимосвязь между активностью ключевых ферментов метаболизма супероксидного радикала, органических пероксидов и выраженностью пролиферативных процессов в опухолевых клетках как в эксперименте на моделях асцитного и солидного роста карциномы Эрлиха, так и в опухолях человека. Наблюдалось существенное, в несколько раз, повышение активности СОД при переходе клеток карциномы Эрлиха из логарифмической фазы, которая характеризуется более высокой скоростью роста, в стационарную фазу. Исследование ксантиноксидазы - фермента, катализирующего образование супероксидного радикала, показало его максимальную активность в логарифмическую фазу роста опухоли, тогда как в стационарную фазу происходило достоверное снижение активности этого фермента.

Таким образом, повышение активности ксантиноксидазы в логарифмическую фазу роста с одной стороны и снижение активности СОД с другой дают основание считать, что процесс наработки супероксидного радикала активно протекает при высокой скорости опухолевого роста, тогда как его элиминация ингибирована. Представленные в данной работе результаты указывают на тесную взаимосвязь между ключевыми ферментами метаболизма супер оксидного радикала и активностью пролиферативных процессов в опухолевых клетках. Торможение скорости пролиферации в стационарной фазе роста опухолей может быть связано, по нашему мнению, со значительным ростом супероксиддисмутазной активности в этой фазе. Можно заключить, что СОД, контролируя концентрацию 0г\ по-видимому, является одним из регуляторов пролиферативной активности. Существенная разница в активности ферментов в асцитной и солидной формах объясняется тем, что асцитная опухоль характеризуется высокой скоростью клеточной пролиферации.

Также продемонстрирована тесная взаимосвязь активности глютатионзависимых ферментов с фазой и формой роста карциномы Эрлиха. Активность глутатионзависимых ферментов - ГП и ГТ в клетках асцитной опухоли в логарифмической фазе роста была значительно ниже по сравнению с другими фазами роста и активностью ферментов в солидной опухоли. В стационарной фазе роста наблюдалось достоверное увеличение активности обоих ферментов, как в солидной, так и в асцитной формах. Поскольку эти ферменты регулируют внутриклеточный пул органических пероксидов, то участие последних в процессах, регулирующих пролиферацию опухолевых клеток, является вполне вероятным.

На примерах злокачественных и доброкачественных опухолей молочной железы человека была проведена сравнительная оценка активности антиоксидантных ферментов в зависимости от митотического индекса исследуемых опухолей. В данных исследованиях выявлены те же тенденции к снижению активности АОФ при увеличении числа делящихся клеток, что было продемонстрировано на экспериментальных моделях.

Установлено, что зависимость ферментативной активности от выраженности пролиферативных процессов в доброкачественных и злокачественных опухолях имеют принципиальные отличия.

Так, нами было показано, что в фиброаденомах молочной железы с увеличением митотического индекса (до 7-12°/00) наблюдалось повышение активности практически всех исследуемых ферментов, причем наиболее выраженный рост был зарегистрирован для каталазы и глутатионтрансферазы. Изменение активности глутатионпероксидазы было наименее значимо. Низкие значения активности ксантиноксидазы, продуцирующей супероксидный радикал, наблюдались в тканях доброкачественных опухолей с невысокой скоростью пролиферации. Такие результаты, вероятно, свидетельствуют о физиологическом повышении активности АОФ в ответ на увеличение продукции активированных кислородных метаболитов при клеточном делении, их своевременной детоксикации и поддержании окислительно-восстановительного равновесия в клетках доброкачественных опухолей.

В противоположность этому, в тканях РМЖ форма зависимости активности АОФ от митотического индекса имеет другой характер. В опухолях с наивысшим митотическим индексом (>35°/оо) была зарегистрирована наиболее низкая активность СОД, ГТ, ГП, ГТ. Исключение составила только высокая активность каталазы. Снижение активностей ГП и ГР по мере возрастания числа митозов в опухолях носило линейный характер, тогда как изменения СОД и ГТ были выражены более сложной зависимостью. Представленные результаты свидетельствуют о том, что в опухолевых клетках не происходит элиминации АКМ в должной степени. Возрастание митотической активности злокачественных опухолей, возможно, сопровождается увеличением продукции супероксидного радикала. Подтверждением этого предположения является показанное в наших экспериментах увеличение активности ксантиноксидазы, катализирующей образования эндогенного супероксидного радикала во многих активно пролиферирующих опухолях. Существующие экспериментальные данные подтверждают предположение о повышении его концентрации в физиологических пределах в активно пролиферирующих клетках . В ряде работ показан высокий конститутивный уровень перекиси водорода в опухолевых клетках . Вероятно, что в дальнейшем эти радикалы участвуют в окислительной модификации ДНК, вызывают генотоксический эффект и способствуют прогрессии опухоли, поддерживая ее малигнизированное состояние, инвазивность и метастатический потенциал.

Несмотря на то, что требуются дополнительные исследования для окончательных выводов о роли АОФ в регуляции пролиферации опухолевых клеток, в настоящее время проведены первые исследования по использованию этих ферментов в терапии опухолей. Данные о способности СОД ингибировать пролиферацию клеток при повышении экспрессии фермента послужили основой для первых опытов применения СОД и миметиков СОД в качестве противоопухолевых средств. В эксперименте была показана регрессия опухолевых культур при трансфекции в них кДНК фермента Мп-СОД . Таким образом, возможность ингибирования пролиферации опухолевых клеток антиоксидантными ферментами открывает перспективу их использования в качестве противоопухолевых средств.

Данные представленные в настоящей работе доказывают возможность регуляции свободными радикалами таких важных функциональных состояний, как пролиферация и апоптоз опухолевых клеток. В механизме данных процессов большую роль играет взаимодействие радикалов кислорода и азота с системами внутриклеточной передачи сигнала, и их конечный эффект зависит от концентрации. Однако, внутри клетки возможно сразу образование нескольких типов свободно-радикальных молекул, которые могут взаимодействовать друг с другом. Влияние такого взаимодействия на пролиферацию опухолевых клеток и индукцию в них апоптоза до сих пор исследовано недостаточно. Поэтому представлялось важным изучить влияние комбинации веществ, генерирующих пероксирадикалы и доноров оксида азота на пролиферативную активность и апоптоз опухолевых клеток. Исследования такого плана могут представлять интерес и в связи с тем, что в основе многих классических методов лечения онкологических заболеваний, применяемые в клинической практике (химио-, лучевая и фотодинамическая терапия), лежит свободно-радикальный механизм. Поэтому важно оценить возможность использования доноров оксида азота в фармакологических целях в комплексной терапии опухолей.

Следующая серия экспериментов была посвящена изучению сочетанного воздействия свободных радикалов и NO на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток в модельной системе in vitro.

Предварительные исследования показали концентрационную зависимость влияния пероксидов на пролиферативную активность клеток карциномы Эрлиха, что выражалось в ингибировании синтеза ДНК высокими концентрациями и стимуляцией этого процесса выше контрольных значений низкими дозами используемых соединений.

При исследовании сочетанного действия оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию опухолевых клеток было показано, что доноры N0 в нетоксичной концентрации в комбинации с субтоксичными концентрациями пероксидов увеливали включение -тимидина в ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток, инкубированных только с источниками пероксидных радикалов, либо не влияли на нее. Комбинация Ж)-доноров в тех же концентрациях с цитотоксичными дозами ГПТБ и АБАП, угнетающих синтез ДНК более чем на 80%, приводила к снижению антипролиферативного действия свободных радикалов. Анализируя полученные данные можно заключить, что оксид азота снижает токсический эффект пероксирадикалов на опухолевые клетки и усиливает их ростстимулирующее действие при использовании в нетоксичных концентрациях, что в целом позволяет предположить защитные свойства N0 в культурах злокачественных клеток. Такое влияние может быть обусловлено антиоксидантными свойствами оксида азота что, вероятно, и обуславливает его цитопротекторное действие. Способность N0 связывать органические пероксиды с образованием пероксинитритов, которые превращаются в нитраты подтверждает его антиоксидантные качества . Кроме того, известно, что N0 связывает мембранные и внутриклеточные комплексы железа, что препятствует распаду пероксидов с образованием радикалов и развитию цепных реакций свободно-радикального окисления .

Изучение сочетанного действия оксида азота и свободных радикалов на индукцию апоптоза опухолевых клеток карциномы Эрлиха показало активацию этого процесса при комбинированном применении NaNCb (10"5 М) и АБАП (ОД мМ), L-аргинина (5x10"3 М) и АБАП (0,1 мМ), L-аргинина и ГПТБ (0,1 мМ). В других случаях наблюдалось снижение апоптотической гибели клеток. Основываясь на полученных результатах можно предположить, что сочетанное применение доноров оксида азота и свободно-радикальных агентов в низких концентрациях может приводить к усиленной пролиферации с одновременной индукцией апоптоза.

Одним из частных случаев свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки является химиотерапия лекарственными препаратами, в частности антрациклиновыми антибиотиками . Использование комбинации доксорубицина с донорами оксида азота приводило к достоверному увеличению процессов синтеза ДНК в опухолевых клетках карциномы Эрлиха, за исключением усиления опухолетоксического щ действия доксорубицина (10" М), которое наблюдалось при добавлении доноров оксида азота NaN02 и SNP в концентрациях 10" М. L-аргинин в сочетании с доксорубицином оказывал выраженное цитопротекторное действие. В то же время было обнаружено соединение, которое значительно усиливало цитотоксическое действие доксорубицина. Так нитрозогуанидин в концентрации

10"4М в 3 раза усиливал ингибирующее действие доксорубицина на синтез ДНК.

Таким образом, полученные результаты показывают, что применение доксорубицина в сочетании с донорами оксида азота in vitro выявило наличие сложной закономерности в воздействии различных комбинаций доз антибиотика и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. Доноры оксида азота имеют неоднозначное действие на опухолетоксический эффект доксорубицина, что зависит от химического строения и концентрации используемых соединений. Выявленное снижение антипролиферативного эффекта доксорубицина и индукции апоптоза опухолевых клеток донорами NO дает основание предположить, что оксид азота может являться одним из факторов, способствующим появлению клонов опухолевых клеток, устойчивых к доксорубицину и обладающих повышенной пролиферативной активностью.

Оценивая полученные в настоящей работе данные, можно заключить, что NO, вероятно, является фактором, защищающим ДНК опухолевых клеток от повреждающего действия доксорубицина и вносит свой вклад в развитие резистентности опухолей к антрациклиновым антибиотикам. Однако стоит отметить, что в некоторых ситуациях наблюдалось потенцирование повреждающего действия доксорубицина. В итоге конечный результат комбинированного действия оксида азота и свободных радикалов зависит от многих факторов: от концентрации действующих агентов, от типа клеток, от условий постановки экспериментов. Учитывая способность некоторых противоопухолевых препаратов усиливать генерацию N0, необходимо, по нашему мнению, дополнительно исследовать противоопухолевую активность комбинации препаратов, используемых в химиотерапии.

На наш взгляд, наиболее перспективным для клинического использования из всех исследованных доноров оксида азота являются нитрозосоединения, что подтверждаеся существованием противоопухолевых препаратов класса нитрозомочевины, нашедшей терапевтическое применение . Для более полной оценки способности нитрозогуанидина модулировать противоопухолевое действие доксорубицина было проведено исследование in vivo. Показано, что MNNG может усиливать терапевтический эффект доксорубицина что выражалось в значительном уменьшении размера опухоли, а также усилении индукции апоптоза и некроза клеток карциномы Эрлиха по сравнению с действием одного химиопрепарата. Ранее показано, что противоопухолевая эффективность циклофосфана повышалась при его комбинации с донором N0 по отношению к клеткам лейкемии Р-388 . Сопоставляя эти факты можно сделать вывод о целесообразности применения доноров оксида азота для повышения эффективности используемых в клинике химиотерапевтических агентов. Однако для окончательного заключения по использованию доноров N0 в химиотерапии опухолей необходимы дополнительные исследования зависимости противоопухолевого эффекта от дозы, химической структуры соединений и стадии опухолевого процесса.

Обобщая представленные результаты, можно сказать, что в клетках млекопитающих развились не только механизмы, позволяющие адаптироваться к сосуществованию с агрессивными свободными радикалами, но и пути использования этих высокоактивных молекул для регуляции жизненно-важных функций. Свободные радикалы играют важную физиологическую роль в жизнедеятельности организма, и к числу их биологических эффектов относится регуляция пролиферации и апоптотической гибели клеток. При злокачественной трансформации происходит приспособление данных механизмов для обеспечения максимальной способности к выживанию и росту опухолевых клеток. Если в нормальных клетках срабатывает программа ограниченного числа делений и входа в дифференцировку и затем апоптоз, то в опухолевых клетках свободные радикалы являются одним из инструментов обеспечения их неконтролируемого роста, мутагенеза и опухолевой прогрессии.

В дополнение к имеющимся общепринятым молекулярно-биохимическим характеристикам опухолевых клеток, которые включают наличие мутаций в генах, продукты которых контролируют пролиферацию и апоптоз, аутокринный тип регуляции роста, активацию внутриклеточных сигнальных путей, мы обнаружили новые атрибуты опухолевого роста. На основании полученных нами данных, следует отметить, что злокачественные клетки отличают от нормальных такие характеристики, как

Внеклеточная продукция ферментативных и неферментативных антиоксидантов

Замедленный распад экзогенных пероксидов

Быстрая активация и высокая индуцибельность ферментов, участвующих в образовании сигнальных молекул липидной природы

Нарушение регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза в опухолевых клетках, ингибирование активности антиоксидантных ферментов в быстрорастущих опухолях

Использование оксида азота в качестве фактора защиты опухолевых клеток от окислительного стресса.

По результатам настоящего исследования и литературным данным возможно выделить несколько основных механизмов влияния свободных радикалов на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток (рис. 29). Необходимо подчеркнуть существование концентрационной зависимости влияния свободных радикалов на клеточные физиологические эффекты и метаболические процессы. В высоких концентрациях они оказывают повреждающее действие на опухолевые клетки, что выражается в ингибировании синтеза ДНК, нарушении процессов репарации клеточных мембран. Итогом такого воздействия являются угнетение пролиферации опухолевых клеток и индукция в них апоптоза.

Рис. 29. Возможные механизмы регуляции свободными радикалами пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

В противоположность этому, свободные радикалы в низких концентрациях усиливает передачу ростстимулирующих сигналов, в том числе, за счет освобождения арахидоновой кислоты, активируют синтез ДНК, что ведет к активации пролиферативных процессов в опухолевых клетках.

Доноры N0 могут также оказывать неоднозначное действие на процессы пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оксид азота, вследствие своих мультипотентных свойств, определяемых как цитотксичностью радикала, так и его коммуникативной активностью участвует в поддержании роста опухолей.

На данном этапе сложно найти взаимосвязь между действием всех факторов, определяющих терапевтический эффект доноров оксида азота, однако можно констатировать, что решающее значение в их физиологических ответах имеет концентрация и химическая структура N0-генерирующих соединений. В данной работе получены результаты, показывающие принципиальную возможность развития направления по использованию доноров оксид азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина. Наиболее перспективным для развития направления по использованию доноров оксида азота в онкологии представляется проведение комплексных исследований, совмещающих изучение их антиканцерогенной, противоопухолевой, антиметастатической и иммуномодулирующей активности, что в итоге может привести к их широкому клиническому применению.

В заключение необходимо отметить, что нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза играет важную роль в биологии рака, которое заключается не только в запуске канцерогенеза, но и поддержании роста опухолей, поэтому определение возможности регуляторного влияния на свободно-радикальные процессы в злокачественных клетках может являться плодотворной предпосылкой на пути создания противоопухолевых средств нового типа. Управление интенсивностью свободно-радикальных реакций может иметь существенное значение для повышения эффективности профилактических мероприятий и противоопухолевой терапии.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Кондакова, Ирина Викторовна, 2005 год

1. Аббасова С.Г. Система Fas- FasL в норме и патологии. / С.Г. Аббасова, В.М.Липкин, H.H. Трапезников, Н.Е. Кушлинский // Вопр. Биол. Мед. Фарм. Химии. - 1999. - № 3. - С. 3-17.

2. Авдеева О.С. Изучение методом ЭПР молекулярных механизмов действия радиации и метилнитрозомочевины на ткани здоровых животных и животных-опухоленосителей. / О.С.Авдеева // Автореф. дисс. канд. физ-мат. наук.- Москва. 1980.- 20 с.

3. Амосов И.С. Кислородный статус и ангиоархитектоника опухолей разного типа и их изменение при лучевой терапии / И.С. Амосов, Р.К. Караулов, H.A. Сазонова // Радиобиология. 1984. - № 24. - С. 630635.

4. Аскарова Э.Л. Генрация супероксидного радикала и текучесть мембранных липидов Acholeplasma Laidlawii при старении культуры клеток / Э.Л. Аскарова, А.Б. Капитанов, В. Кольтовер, О.С. Татищев // Биофизика. 1987. - Т. ХХХ11, вып. 1. - С. 95-99.

5. Афанасьев И.Б. Исследование механизма взаимодействия противоракового антибиотика адриамицина с анион-радикалом О2./ И.Б. Афанасьев, Н.И. Полозова // Антибиотики и мед. биотехнология. 1986.- Т. 31.- № 4.- С.261-264.

6. Белушкина H.H. Молекулярные основы апоптоза./ H.H. Белушкина., А. Хасан Хамад, С.Е. Северин // Вопр. Биол. Мед. Фарм. Химии. -1998. -№ 4.-С. 15-24.

7. Блохин H.H. Химиотерапия опухолевых заболеваний. / H.H. Блохин, Н.И. Переводчикова// М.: Медицина, 1984. 304 с.

8. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях. / А.Ф.Ванин // Вестник РАМН.- 2000.- №4. с. 3 -5.

9. Ю.Вартанян JI.C. Исследование определения СОД активности в тканях животных с тетранитротетразоливым синим / JI.C. Вартанян, С.М. Гуревич // Вопросы мед. химии. 1982. - № 5. - С.23-56.

10. Вартанян JI.C. Образование супероксидных радикалов в мембранах субклеточных органелл регенерирующей печени / JI.C. Вартанян, И.П. Садовникова, С.М. Гуревич, И.С. Соколова // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып.5. - С. 671 -678.

11. Викторов И.В. Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга. / И.В. Викторов // Вестник РАМН.-2000.-№4.- С. 5- 10.

12. Воскресенский О.Н. Антиоксидантная система, онтогенез и старение / О.Н. Вокресенский, И.А. Жутаев // Вопросы мед. химии-1994-№3.-С. 53-56.

13. Гаузе Г.Ф. Исследование молекулярных механизмов действия и применение противоопухолевых антибиотиков. / Г.Ф Гаузе, Ю.В. Дудник // Антибиотики. 1982,- Т. 27. - № 2.- С. 9-18.

14. Григорьев М.Ю. Апоптоз в норме и патологии./ М.Ю. Григорьев, E.H. Имянитов, К.П. Хансон // Мед. акад. журнал.- 2003.- Т.З.- № 3.-С. 3-11.

15. Дятловицкая Э. В. Липиды как биоэффекторы. / Э. В. Дятловицкая, В.В. Безуглов//Биохимия.- 1998.-Т. 63.-№1.-С. 3-5.

16. Казьмин С.Р. Пролиферативная активность в асцитной карциноме Эрлиха / С.Р. Казьмин, Е.В. Колосов // Вопросы онкологии. - 1979. - №7.-С. 60-64.

17. Коломийцева И.К. Радиационная биохимия мембранных липидов. / И.К. Коломийцева Москва: Наука.- 1989.- 181 с.

18. Комбинированное и комплексное лечение больных со злокачественными опухолями. // под ред. В.Е. Чиссова М.: Медицина, - 1989. - 560 с.

19. Коновалова Н.П. Донор оксида азота повышает эффективность цитостатической терапии и задерживает развитие лекарственной резистентности. / Н.П. Коновалова // Вопр. онкологии.-2003.-Т.49.-№1.-С.71-75.

20. Коновалова Н.П. Влияние донора оксида азота на терапевтическую эффективность цитостатиков и синтез ДНК.// Н.П. Коновалова, JI.M. Волкова, Л.Ю. Якушенко и др. // Российский биотерапевтический журнал,- 2003,- №2. 52-55.

21. Копнин Б. П. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров. / Б. П. Копнин // Биохимия. 2000.- Т.65. - №1. - С. 2-77.

22. Кудрин A.B. Микроэлементы и оксид азота полифункциональные лиганды. / A.B. Кудрин // Вопр. Биол. Мед. Фарм. Химии. - 2000.-№ 1. - С. 3-5.

23. Кудрявцев Ю.И. Динамика апоптотических событий, индуцированных фактором некроза опухолей в лейкозных клетках U-937. / Ю.И. Кудрявцев, А.А.Фильченков, И.В. Абраменко, JI.3 Полищук, И.И. Слуквин, Н.И. Белоус // Эксп. Онкология.- 1996.-Т.18.- С. 353-356.

24. Куцый М.П. Участие протеаз в апоптозе. / М.П. Куцый., Е.А. Кузнецова, А.И. Газиев // Биохимия.-1999.- т.64.-Вып.2.-С.149-163.

25. Ланкин В.З. Ферментативная регуляция перекисного окисления липидов в биомембранах: роль фосфолипазы А2 и глютатион-S-трансферазы /В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Г. Осис, A.M. Вихерт. // ДАН СССР. 1985. - Т. 282. - С. 204-207.

26. Левина В.И. Противоопухолевый препарат гидроксимочевина - донор оксида азота. / В.И. Левина, О.В. Азизов, А.П. Арзамасцев и др. // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. 2001. - № 1. - С. 47-49.

27. Лихтенштейн А. В. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы. / А. В. Лихтенштейн, B.C. Шапот. // Патол. физиол. и эксперим. терапия. -1998.-№3.- С. 25-44.

28. Лобышева И.И. Взаимодействие динитрозильных тиолсодержащих комплексов железа с пероксинитритом и перекисью водорода in vitro./ И.И. Лобышева, В.А. Сереженков, А.Ф. Ванин // Биохимия. -1999.-Т.64-С. 194-2000.

29. Луценко C.B. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности антибиотиков антрациклинового ряда. / C.B. Луценко, Н.Б. Фельдман, С.Г. Туманов., С.Е. Северин // Вопр. биол.мед. и фарм. химии.-2001.- №2.-С.-3-9.

30. Лушников Е.Ф. Гибель клетки (апоптоз). / Е.Ф. Лушников, А.Ю. Абросимов // М. Медицина. 2001. - 192 с.

31. Манухина Е.Б. Оксид азота в сердечно-сосудистой системе: роль в адаптационной защите. / Е.Б. Манухина, И.Ю. Малышев, Ю.В.Архипенко. // Вестник РАМН. 2000.- №4. С. 16-21.

32. Меныцикова Е.Б. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты. / Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. -Новосибирск: Наука, 1994. 196 с.

33. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами / Д.И. Метелица- Москва: Наука, 1982. 256 с.

34. Напалков Н.П. Рак и демографический переход. / Н.П. Напалков // Вопросы онкологии. 2004. - Т. 50. - №2. - С. 127-144.

35. Орлов B.C. Электронное строение и свободно-радикальные механизмы противоопухолевого действия антрациклиновых антибиотиков. / Орлов B.C., Лужков В.Б., Богданов Г.Н. // Актуальные проблемы экспер. химиотерапии опухолей. - 1982.- С. 30-32.

36. Подберёзкина Н.Б. Биологическая роль супероксиддисмутазы / Н.Б. Подберёзкина., Л.Ф. Осинская. // Украинский биохимический журнал. 1989. - Т. 61, № 2. - С 14-27.

37. Проскуряков С.Я. Оксид азота в неопластическом процессе. Проскуряков С.Я., Коноплянников А.Г., Иванников А.И. и др. // Вопросы онкологии. 2001. - Т.47. - N3. - С. 257-269.

38. Райхлин Т.Н. Регуляция и проявления апоптоза в физиологических условиях и в опухолях. / Райхлин Н. Т., Райхлин А.Н. // Вопросы онкологии. -2002. -Т48. №2. С. 159-171.

39. Реутов В.П. Медико-биодогические аспекты циклов оксида азота и супероксидного аноин-радикала. / Реутов В.П. // Вестник РАМН. 2000.-№4.-С. 30-34.

40. Реутов В.П. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. / Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. //Москва, Наука. -1998.- 159 с.

41. Рябов Г.А. Роль оксида азота как регулятора клеточных процессов при формировании полиорганной недостаточности / Рябов Г.А., Азизов Ю.М. // Анестезиология и реаниматология. 2001 - Т.1. - С. 812.

42. Саприн A.C. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов. / А.С Саприн., Е.В. Калинина // Успехи биологической химии. 1999. - Т. 39. - С. 289-326.

43. Сидоренко С.П. Fas/CD95-onocpeflyeMbifi апоптоз в патогенезе лифоидных новообразований. / С.П. Сидоренко // Экспериментальная онкология. 1998. - Т. 20. - С. 15-28.

44. Скулачёв В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти. / Скулачёв В.П. Москва, 2000. - 48 с.

45. Суханов В.А. Механизмы гормональной регуляции роста опухолевых клеток. / В.А. Суханов // Успехи биологической химии. - 1995.- Т.35. -С. 97-134.

46. Фильченков А.А. Современные представления о роли апоптоза в опухолевом росте и его значении для противоопухолевлй терапии. / А.А. Фильченков // Эксп. Онкология.- 1998.- Т. 20. С.259-269.

47. Фильченков А.А. Апоптоз и рак. / А.А.Фильченков, Р.С. Стойка // -Киев: Морион, 1999.- 184 с.

48. Шапот B.C. Биохимические аспекты опухолевого роста / B.C. Шапот. Москва: Наука, 1975. -304 с.

49. Швембергер И.Н. Апоптоз: роль в нормальном онтогенезе и патологии. / Швембергер И.Н., Гинкул Л.Б. // Вопросы онкологии. -2002. Т.48, - С. 153-158.

50. Эммануэль Н.М. / Эммануэль Н.М., Саприн А.Н.// Докл. АН СССР.-1968.-Т. 182.-С. 733-735.

51. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме. / А.А. Ярилин // Пат физиол и эксперим терапия. 1998. -№2.-С. 38-48.

52. Abe J. Big mitogen - activated protein kinase 1(BMK1) is a redox-sensitive kinase. / Abe J., Kusuhara M., Ulevitch R.J. // J. Biol. Chem. -1996.-V. 271.-P. 16586-16590.

53. Adams J.M. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. / Adams J.M, Cory S. // Science. 1998.-V.281.- P.1322-1326.

54. Allen R.G. Oxidative stress and gene regulation. / Allen R.G., Tressini M. // Free Radical Biol. Med. 2000.- V. 28.- P.463-499.

55. Ambrosone C.B. Oxidants and antioxidants in breast cancer. / Ambrosone C.B. // Antioxidant Redox Signal. 2000. - Vol. 2, № 4. P. 903-917.

56. Ambs S. Interactive effects of nitric oxide and the p53 tumor suppressor gene in carcinogenesis and tumor progression. / Ambs S., Hussain S.P. and Harris C.C. // FASEB J.- 1997.- Vol 11.- 443-448.

57. Amstad P. A. Mechanism of c-fos induction by active oxygen / P. A. Amstad P. A. Krupitza, G. Gerutti // Cancer Res. 1992. - № 52. - P. 3952-3960.

58. Amstad P.A. BCL-2 is involved in preventing oxidant-induced cell death and in decreasing oxygen radical production / Amstad P.A., Liu H., Ichimiya M. et all // Redox Rep. 2001. - V.6. - P.351-362.

59. Anderson K.M. 5-Lipoxigenase inhibitors reduce PC-3 cell proliferation and initiate nonnecrotic cell death. / Anderson K.M., Seed T., Vos M., et al. // Prostate. 1998.- V. 37.- P. 161-173.

60. Andreas N. K. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase. / Andreas N. K., Billiar T. R. // J. Leukoc. Biol.-1993.- V. 54. P. 171-178.

61. Arai T. High accumulation of oxidative DNA damage, 8-hydroxyguanine, in Mmh/ogg 1 deficient mice by chronic oxidative stress./ Arai T., Kelle V.P., Minowa O., et al. //Carcinogenesis.- 2002. V. 23.- P. 2005-2010.

62. Arany I. Induction of iNOS mRNA by interferon-gamma in epitelial cells is associated with growth arrest and differentiation. / Arany I., Brysk M.M., Brysk H., et al. // Cancer Letters. 1996.- VI10.- P. 93-96.

63. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models. / Archer S.// FASEB J.- 1993. V. 7.- P. 349-360.

64. Aust A.E. Mechanisms of DNA Oxidation. / Aust A.E., Eveleigh J.F. // P.S.E.B.M. 1999.- V.222.- P.246-252.

65. Babich M.A. Synergistic killing of virus-transformed human cells with interferon and N-methyl-N"-nitro-N-nitrosoguanidine. / Babich M.A., Day R.S. // Carcinogenesis. 1989. - V. 10.- P. 265-268.

66. Bachur N.R. NADFH cytochrome P450 reductase activation of quinone anticancer agents to free radicals. / Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - N2. - P. 954-957.

67. Bae Y.S. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. / Bae Y.S., Kang S.W., Seo M.S., Baines I.C., et al. // J. Biol. Chem. 1997,- V. 272.- P. 217-221.

68. Balakirev M.Y. Modulation of the mitochondrial permeability transition by nitric oxide / Balakirev M.Yu., Khramtsov V.V., Zimmer G. // European J. Biochem.- 1997.- V. 246. P. 710-718.

69. Balamurugan K. Caspase-3: its potential involvement in Cr(III)-induced apoptosis of lymphocytes / Balamurugan K., Rajaram R., Ramasami T. // Mol Cell Biochem. 2004. - V.259. - P.43-51.

70. Bannai S. The export of glutathione from human diploid cells in culture / S. Bannai, H. Tsukeda // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - P. 3440-3450.

71. Barnouin K. H2C>2 induces a transient multiphase cell cycle arrest in mouse fibroblasts through modulating cycling D and P21 expression. / Barnouin K., Dubuisson M., Child E.S., et al. // J.Biol. Chem. 2002.- V. 277.- P. 13761-13770.

72. Bartolli G. A. Supposed role of superoxide dismutase in the control of tumor growth / G. Bartolli, G. Minotti, S. Borello // Oxy radicals and the scavenger sistems. 1983. - Elsevier Science Publishing. - P. 179-184.

73. Beers R.F. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. / Beers R.F., Sizer J.W. // J. Biol. Chem. -1952.-Vol. 195.-P. 133-140.

74. Benchekroun M.N. Doxorubicin-induced lipid peroxidation and glutathione peroxidase activity in tumor celllines selected for resistance to doxorubicin. / Benchekroun M.N., Pourquier P., Schott B., Robert J. // Eur. J. Biochem. 1993.-V. 211.-P. 141-146.

75. Bhatnagar A. Oxidative stress alters specific membrane currens in isolated cardiac myocytes. / Bhatnagar A., Srivastava S.K., Szabo G. // Circulation Res. 1990.- V.67.- P. 535 - 549.

76. Borowits S.M. The role of phospholipase A2 in microsomal lipid peroxidation induced with t-butyl hydroperoxide. / Borowits S.M., Montgomery C. // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1989.- V. 158.- P. 1021-1028.

77. Bos J.L. Ras oncogens in human cancer: a review./ J.L. Bos // Cancer Res. 1989. - V.49.- P. 4682-4689.

78. Bouroudian M. Use of silicic acid microcolumn to assay acyl-CoA: lysophosphatidylcholine acyltransferase. / Bouroudian M., Chautan M., Termine E. //Biochim. Biophys. Acta. 1988.- V. 960.- P. 253-256.

79. Bouroudian M. In vitro stady of docosohexaenoic acid incorporation into phpsphotidylcholine by enzymes of rat heart. / Bouroudian M., Nalbone G., Grinberg A., Leonardi J., Lafont H. // Mol. Cell. Biochem. 1990.- V. 93.-P.119- 128.

80. Brash A.R. Arashidonic acid as a bioactive molecule. / A.R. Brash // J. Clin. Invest.- 2001.-V. 107.-P. 1339-1345.

81. Breuer W. Newly delivered transferin iron and oxidative cell injury. / Breuer W., Greenberg E., Cabantchik Z. I. // FEBS Letters. 1997.- V. 403.-P. 213-219.

82. Briehl M.M. Modulation of antioxidant defences during apoptosis. / Briehl M.M., Baker A.F., Siemankowski L.M., Morreale J. // Oncology Res. 1997.- V. 9.- P. 281- 285.

83. Brox L. The effect of anoxia on anthracycline induced DNA damage in the RPMI 6410 human lymphoblastoid cell line. Brox L., Gowans B., To R.et al. // Can. J. Biochem.-1982.-Vol.60. N.9.- P.873-876.

84. Brumell J.H. Endogenous reacrive oxigen intermediates activate tyrosine kinases in human neutrophils. / Brumell J.H., Burkhardt A.L., Bolen J.B., et al.//J.Biol. Chem.- 1996.- V. 271.-P. 1455-1461.

85. Briine B. Apoptotic cell death and nitric oxide: activating and antagonistic transducing pathways. / B. Briine, K. Sandau, and A. von Knethen. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997.-V.229. P. 396-401.

86. Buga G.M. NG-hydroxy-L-arginine and nitric oxide inhibit Caco-2 tumor cell proliferation by distinct mechanism. / Buga G.M., Wei L.H., Bauer P.M. et al. // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275. - R1256 - R1264.

87. Burch H.B., Superoxide radical productionstimulates retroocular fibroblast proliferation in Graves ophtalmopathy. / Burch H.B., Lahiri S., Bahn R.s., Barnes S.//Exp.Eye Res. 1997,- V.2.-P.311 -316.

88. Burdon R.H. Cell proliferation and oxidative stress / R. Burdon, V. Gill, C. Rice-Evans // Free Radic. Res. Comm. 1989. - № 7. - P. 149-159.

89. Burdon R.H. Free radicals and the regulation of mammalian cell proliferation / Burdon R.H., C. Rice-Evans. // Free Radic. Res. Comm. -1989,-№6.-P. 345-358.

90. Burdon R.H. Oxidative stress and tumour cell proliferation / R.H. Burdon, V. Gill, C. Rice-Evans. // Free Radic. Res. Comm. 1990. - № 11. - P. 65-76.

91. Burdon R.H. Celluiarly generated active oxygen species and HeLa cell proliferation / R.H. Burdon, V. Gill. // Free Radic. Res. Comm. 1993. -№ 19.-P. 203-213.

92. Burdon R. H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation / R.H. Burdon. // Free Radical Biology and Medicine. 1995. - Vol. 18, № 4. - p. 775 - 794.

93. Cabelof D. Induction of DNA polimarase |3 dependent base excision repair in response to oxidative stress in vivo. / Cabelof D., Raffoul J.J., Yanamadala S., et al. // Carcinogenesis.- 2002.- V. 23.- P. 1419-1425.

94. Cao Y. Intracellular unesterified arachidonic acid signals apoptosis./ Cao Y., Pearman A. T., Zimmerman G.A. et al. // PNAS.- 2000. V. 97. P. 11280-11285.

95. Capranico G. Sequence-selective topoisomerse II inhibition by anthracycline derivatives in SV40 DNA: relationship with DNA affinity and cytotoxicity. / Capranico G., Zunino F., Kohn K. et al. // Biochemistry.- 1990.- V.29.- P. 562-569.

96. Cha M.S. Endogenous production of nitric oxide by vascular endothelial growth factor down-regulates proliferation of choriocarcinoma cells./ Cha M.S., Lee M.J., Je G.H., et all. // Oncogene.- 2001.-V.20.-P.1486-96.

97. Chao C-C. Participation of nitric oxide and iron in the oxidation of DNA in asbestos-treated human lung epithelial cells. / Chao C-C., Park S.H., Aust A.E. // Arch. Biochem. Biophys. 1996.- V 326.- P. 152-157.

98. Chazotte-Aubert L. Nitric oxide prevents y-radiation-induced cell cycle arrest by impairing p53 function in MCF-7 cells. / Chazotte-Aubert L., Pluquet O., Hainaut P., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. -V. 281.-P. 766-771.

99. Chen D-L. Protective effects of selenium supplementation in minimiziing 5-fluorouracil induced lipid peroxidative damage of the small intestine. / Chen D-L., Sando K., Chen K., Wasa M., et al. // J. Trace Elem Exp Med. 1997.- V.10.-P. 163-171.

100. Church D.F. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. / Church D. F., Pryor W.A. // Environ. Health Perspect. 1985.-V. 64.- P. 111-126.

101. Cohen I. Antiapopotic activity of the glutathione peroxidase homologue encoded by HTV-1. / Cohen I., Zhao L., Metivier D., et al. // Apoptosis. -2004.- V. 9.-P. 2004.

102. Cohen J.J. Programed cell death in the immune system/ Cohen J.J. // Adv. Immunol. -1991.- V.50.- P.55-85.

103. Collins J.A. Major DNA fragmentation is a late event in apoptosis./ Collins J.A. Schandl C.A., Young K.K., Vesely J. // J.Histochem. Cytochem.- 1997.- V.45.- P. 923-934.

104. Comhair S.A. Extracellular glutathione peroxidase induction in asthmatic lungs: evidence for redox regulation of expression in human airway epithelial cells. / Comhair S.A., Bhathena P.R., Farver C., et al. // FASEB J.-2001.- V.l.-P. 70-78.

105. Crawford D. Oxidant stress induces the protooncogenes c-fos and c-myc in mouse epidermal cells / D. Crawford, L. Zbinden, P. Amstad., P. Cerutti // Oncogene. 1989. - № 3. - P. 27-32.

106. Cross J.V. Oxidative stress inhibits MEKK1 by site-specific glutathionylation in the ATP binding domain. / Cross J.V., Templeton D.J. // Biochem J. 2004.- V.381(Pt 3) - P.675-683.

107. Cui S. Activation murine macrophages induce apoptosis in tumir cells through nitric oxide-dependent or -independent mechanisms. / Cui S., Reichner J., Mateo R., et al. // Cancer Res. 1994,- V. 54.- P. 2462-2467.

108. Dartsch D.C. Comparison of anthracycline-induced death of human leukemia cells: progpammed cell death versus necrosis. / Dartsch D.C., Schaefer A., Boldt S., et al. // Apoptosis. 2002,- V.7.- P. 537-548.

109. Datta R. Involvement of reactive oxygen intermediates in the induction ofc-jun gene transcription by ionising radiation. / R. Datta, D. Hallahan, E. Kharbanda, E. Rubin, M. K. Sherman, E. Humberman. // Biochemistry. -1992.-№31.-P. 8300-8306.

110. Dean R.T. Some critical membrane events during mammalian cell death. / Dean R.T. // Perspective on mammalian cell death. Oxford, New York, Tokio. 1987.-P. 18-38.

111. Denecker G. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptor. / Denecker G., Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P. // Cell. Mol. Life Sci. 2001.- V.58. - P. 356-370.

112. De Wolf F. A. Comparable interaction of doxorubicin with various acidic phospholipids results in changes of lipid order and dynamics. / De Wolf F.A., Maliepaard M., Van Dorsten., et al. // Biochim. Biophys. Acta. -1990.-V. 1096.-P. 67-80.

113. Dodd F. L-arginine inhibits apoptosis vis NO-dependent mechanism in Nb2 lymphoma cells. / Dodd F., Limoges M., Boudreau R.T., et al. // J. Cell. Biochem. 2000.- V. 77.- P. 642-634.

114. Doi K. Excessive production of nitric oxide in rat solid tumor and its implication in rapid tumor growth. / Doi K., Akaike T., Horie H., et all // Cancer.- 1996.- V.77.- P. 1598-1604.

115. Dong M. Inverse association between phospholipase A2 and COX-2 expression during mouse colon tumorigenesis. / Dong M., Guda K., Nambiar P.R., Rezaie A. et al. // Carcinogenesis.- 2003.-V. 24.- P. 307315.

116. Dong Z. Inverse correlation between expression of inducible nirric oxide synthase activity and production of metastasis in K1735 murine melanoma cells. / Dong Z., Staroselsky A., Qi X., et al. // Cancer Res. 1994.- V. 54. -P. 789-793.

117. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell fuction. / Droge W. // Physiol. Rev.- 2001.- V.82. P. 47 - 95.

118. Dybdahl M. DNA adduct formation and oxidative stress in colon and liver of Big Blue rats after dietary exposure to diesel particles. / Dybdahl M. Dybdahl M. Risom L., Moller P., Autrup H. et.al. // Carcinogenesis 2003.-V. 24.-No. 11.-P. 1759-1766.

119. Egan S. E. The pathway to signal achievement. / S. E. Egan, R.A. Weinberg. //Nature. 1993. - Vol. 365. - P. 781-783.

120. Egner P. A. Efects of superoxide dismutase on complete and multistage carcinogenesis in mouse skin. / P.A. Egner, T.W. Kensler. // Carcinogenesis. 1985. - № 6. - P. 1167-1172.

121. Eling E.T. Cellular proliferation and lipid metabolism: importance of lipoxygenase in modulating epidermal growth factor-dependent mitogenesis. / E.T. Eling, C.W. Glasgow. // Cancer and Metastasis Reviews. 1994. -V.13. - P. 397-410.

122. Elliott N.A. Stress induction and mitochondrial localization of Oxrl proteins in yeast and humans. / Elliott N.A., Volkert M.R. // Mol Cell Biol. 2004. - V.8. - P.3180-3187.

123. Esterbauer H. Cytotoxicity and genotoxicity of lipid-oxidation products./ Esterbauer H. // Amer. J. Clin. Nutr. 1993,- V. 57.- P. 779S-786S.

124. Faber M. Lipid peroxidation products and vitamin and trace element status in patiens with cancer before and after chemotherapy. / Faber M., Coudray C., Hida H. et al. // Biol Trace Elem Res. 1995.- V.47. - P.l 17123.

125. Factor V.M. Disruption of redox homeostasis in the transforming growth factor-alpha/c-myc Transgenic mouse model of accelerated hepatocarcinogenesis. / Factor V.M., Kiss A., Woitach J.T., at al. // J. Biol. Chem. 1998.- V. 273.- P. 15846-15853.

126. Farinati F. Determinants for the development of chronic gastritis and intestinal metaplasia in the stomach. / Farinati F., Cardin R., Libera G. et al. // Eur. J. Cancer Prev.- 1995.- V.4.- P. 181-186.

127. Fattman C.L. Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine. / Fattman C. L., Schaefer L.M., Oury T.D. // Free Rad. Biol. Med.-2003.-V. 35.-P. 236-256.

128. Feger F. Role of iron in tumor cell protection from the pro-apoptotic effect of nitric oxide. / F. Feger, Ferry-Dumazet H., Matsuda M. M. et all. // Cancer Res. 2001. - V. 61. - P. 5289-5294.

129. Fehsel K. Islet cell DNA is a target of inflammatory atack by nitric oxide. / Fehsel K., Jalowy A., Qi S., et al. // Diabetes. 1993.- V. 42.- P. 496-500.

130. Filep J.G. Involvement od nitric oxide in target cell lysis and DNA fragmentation induced by murine natural killer cells. / Filep J.G., Baron C., Lachance C.//Blood.- 1996.-V. 87.-P. 5136- 5143.

131. Fisher S.M. Reactive oxygen in the tumor promotion stage of skin carcinogenesis. / Fisher S.M., Cameron G.S., Baldwin J.K. et al. // Lipids. -1988.- V.23.- P.592-597.

132. Floyd R.A. The role of 8-hydrohyguanine in cancerogenesis. / Floyd R.A. // Cancerogenesis.- 1990.- V.l 1.- P. 1447-1450.

133. Floyd R.A. Role of oxygen free radicals in carcinogenesis and brain ischemia. / Floyd R.A. // FASEB J. 1990.- V. 4,- P. 2587- 2597.

134. Folch J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. / Folch J., Lees M., Stanley S. // J. Biol. Chem. -1957.-V. 226. -P.497-509.

135. Forstermann U. Biochemistry and molecular biology of nitric oxide synthases. / Forstermann U. // Drug Res. -1994.- V.44.- P. 402-407.

136. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. The superoxide radical is an agent of oxygen toxicity; superoxide dismutase provide an importantdefence. / I. Fridovich // Annu. Rev. Pharm. Tox. 1989. - V. 23. - P. 239-257.

137. Fritzer-Szekeres M. Enhanced effects of adriamycin by combination with a new ribonucleotide reductase inhibitor, trimidox, in murine leukemia. / Fritzer-Szekeres M, Novotny L, Romanova D, et al. // Life Sci. 1998. - V.63 - P. 545-552.

138. Gaiter D. Distinct effects of glutathione disulphide on the nuclear transcription factors kappaB and activator protein-1 / D. Gaiter, S. Mihm, W. Oroge // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 221. - P. 639-648.

139. Gamberini M. Proliferation of mouse fibroblasts induced by 1,2-dimethylhydrazine auto-oxidation: Role of iron and free radicals. / Gamberini M., Leite L.C.C. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997.-V. 234.- P. 44-47.

140. Gansauge S. The induction of apoptosis in proliferating human fibroblasts by oxigen radical is associated with p53 and p21 induction. / Gansauge S, Gansauge F, Gause H., et al. // FEBS Letters. 1997. - V. 404.-P. 6-10.

141. Gansauge S. Exogenous, but not endogenous, nitric oxide increases proliferation rates in senescent human fibroblasts. / Gansauge S, Gansauge F, Nussler AK, et al. // FEBS Letters. 1997. - V. 404. - P. - 160-164.

142. Gedik C. M. Oxidative stress in humans: validation of biomarkers of DNA damage. / Gedick C.M., Boyle S.P., Wood S.G. at al. // Carcinogenesis.- 2002.- V. 23.- P. 1441-1446.

143. Gerber M. Tumor progression and oxidant antioxidant / M. Gerber et al.//CancerLetters. - 1997.-V. 114. -P.211-214.

144. Gewirtz D.A. DNA damage, gene expression, growth arrest and cell death. / Gewirtz D.A. // Oncol Res.- 1993.-V.5.- P.397-408.

145. Gewirtz D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action propozed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adtiamycin and daunomicin. / Gewirtz D. A. // Biochem Pharmacol. -1999.-V. 57.-P. 727-741.

146. Ghosh J., Myers C.E. Arachidonic acid stimulates prostate cancer cell growth: critical role of 5-lipoxigenase. // Biochem and Biophys Res Commun. 1997.- V. 235. -P.418-423.

147. Glockzin S. Activation of the cell death program by nitric oxide involves inhibition of the proteasome. / Glockzin S, von Knethen A, Scheffner M, et al.//J. Biol. Chem.- 1999,-V. 274.-P. 19581-19586.

148. Goldberg H. G. The tyrosine kinase activity of the epdermal growth factor receptor is necessary for phospholipase A2 activation. / Golgberg H. G., Viegas M.M., Margolis B.L. et al.// Biochem J. 1990.- V. 267.- P. 461-465.

149. Goldman R. Reactive pxigen species are involved in the activation of cellular phospholipase A2. / FEBS. 1992. - V. 309. - P. 190-192.

150. Gopalakrishna R. Ca and phospolipid-independent activation of protein kinase C by selective oxidative modification of the regulatory domain / R. Gopalakrishna, W. B. Anderson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -V. 86.-P. 6758-6762.

151. Gorman A. Role of peroxide and superoxide anion during tumour cell apoptosis. / Gorman A, McGowan A, Cotter TG. // FEBS Letters. 1997. -V. 404.-P.-27-33.

152. Gotoh Y. Lipid peroxide-induced redox imbalance differentiatelly mediates CaCo-2 cell proliferation and growth arrest. / Gotoh Y., Noda T., Iwakiri R., et al. // Cell Prolif. 2002.- V. 35.- P. 221-235.

153. Green P.S. Mitochondrial dysfunction is an early indicator of doxorubicin-induced apoptosis. / Green P.S., Leeuwenburgh C. // Biochim. Biophys. Acta. 2002.-V. 1588.-P. 94-101.

154. Gregson N.A. Lysolipids and membrane damage: lysolecithin and its interaction with myelin. / Gregson N.A. // Biochem. Soc. Transaction. - 1989.-V. 17.-P. 280-283.

155. Griendling K.K. Redox control of vascular smooth muscle proliferation. / Griendling K.K., Ushio-Fukai M. // J. Lab. Clin. Med.- 1998. V. 132. -P. 9-15.

156. Guehmann S. Reduction of a conserved Cys is essential for Myb DNA-binding. / S. Guehmann, G. Vorbrueggen, F. Kalkbrenner, K. Moelling // Nucleic Acids Res. 1992. - Vol. 20. - P. 2279-2286.

157. Gustafson C. Hyrogen peroxide stimulates phospholipase A2-mediated arachidonic acid release in culured intestinal epilthelial cells. / Gustafson C., Lindahl M., Tagesson C. // Scand J. Gastroenterol. 1991.- V. 26. - P. 237- 247.

158. Guyton K.Z. Activation of mitogen-activated protein kinase by H202 . Role in cell suirvival following oxidant injury. / Guyton K.Z., Liu Y., Gorospe M., et al. // J.Biol. Chem. 1996.- V. 271.- P. 4138-4142.

159. Haddad J.J. Redox and oxidant-mediated regulation of apoptosis signaling pathways: immuno-pharmaco-redox conception of oxidative siege versus cell death commitment. / Haddad J.J. // Int. Immunopharmacol. 2004.- V.4.-P.475-493.

160. Hainaut P. Redox modulation of p53 conformation and sequence specific DNA-binding in vitro. / P. Hainaut, J. Milner // Cancer Res. 1993. - Vol. 53-P. 4469-4473.

161. Halliwell B. Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis. / Halliwell B. // Br. J. Exp. Pathol. 1989. - Vol. 70, № 6. - P.737-757.

162. Halliwell B. Biologically relevant metal ion-dependent hydroxyl radical generation. An update. / B. Halliwell, J.M. Gutteridge // FTBS Lett. -1992.-Vol. 307.-P 108-112.

163. Han M. J. Cell proliferation induced by reactive oxygen species is mediated via mitogen-activated protein kinase in Chinese hamster lung fibroblast (V79) cells. / Han M. J., Kim B.Y., Yoon S.O., et al. // Mol.Cells. -2003.- V. 15. P. 94-101.

164. Harris S.R. Oxidative stress contributes to the anti-proliferative effects of flavone acetic acid on endothelial cells. // Harris S.R., Panaro N.J., Thorgeirsson U.P. // Anticancer Res.- 2000.- V.20.-N.4.-P.2249-54

165. Heffner J.E. Pulmonary strategies of antioxidant defense / Heffner J.E., Repine. J E. // Am. Rev. Respir. Dis. 1989. - Vol. 140 - P. 531-554.

166. Hofseth L. Nitric oxide-induced cellular stress and p53 activation in chronic inflammation. / Hofseth L., Saito S., Hussain S.P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003,- V. 100. P. 143-148.

167. Howard S. Neuroprotective effects of bcl-2 overexpression in hippocampal cultures: interactions with pathways of oxidative damage. / Howard S., Bottino C., Brooke S. et all. // J Neurochem. 2002. - V.83. -P.914-923.

168. Hu J. Redox-active chalcogen-containing glutathione peroxidase mimetics and antioxidants inhibit tumour promoter-induced downregulation of gap junctional intercellular communication between

169. WB-F344 liver epithelial cells. / J. Hu, L. Engman, Cotgreave I. // Carcinogenesis. 1995.-V. 16. - №8.-P. 1815-1824.

170. Hussain S.P. Interactive effect of nitric oxide and the p53 tumor supressor gene in carcinogenes and tumor progression. / Hussain S.P., Harris C.C. // FASEB J. 1997.- V. 11. - P. 443-448.

171. Hussain S.P. p53-induced up-regulation of MnSOD and GPx but not catalase increases oxidative stress and apoptosis. / Hussain S.P., Amstad P., He P., Robles A. et all. // Cancer Res. 2004. - V.64. - P. 2350-2356.

172. Iizuka S. Enzyme-linked immuno-sorbent assay for human manganese-containing superoxide dismutase and its content in lung cancer. / Iizuka S., Taniguchi N.and Makita A. // J. Natl. Cancer Inst. 1984. - V. 72. - P. 1043-1099.

173. Ikebuchi Y. Superoxide anion increases intracellular pH, intracellular free calcium and arachidonate release in human amnion cells. / Ikebuchi Y., Masumoto K., Tasaka K., Koike K. // Biol. Chem. 1991. - V. 266. -P. 13233-13237.

174. Ishii T. Mechanism for growth promotion of mouse lymphoma LI210 cells in vitro by feeder layers or 2-mercaptoethanol. / Ishii T., Hishinuma I., Bannai S. // Cell. Physiol. 1981. - V. 104. - P. 215-223.

175. Jain M.K. Kinetics of binding of phospholipase A2 to lipid/water interfaces and its relationship to interfacial activation. / Jain M.K., Rogers J., DeHaas G.H. // Biochim. Piophys. Acta. -1988. V.940. - P. 51-62.

176. Jaiswal M. Nitric oxide in gastrointestinal epithelial cell carcinogenesis: linking inflammation to oncogenesis. / Jaiswal M., LaRusso N. F., Gregory J. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. -2001. V. 281.- P. G626-G634.

177. Jensen M.S. Various nitric oxide donors protect chick embryonic neurons from cyanide-induced apoptosis. / Jensen M.S., Nyborg N., Thomsen F. // Toxicol. Sci. 2000.- V. 58. - P. 127-134.

178. Jessup J.M. Reactive nitrogen and oxygen radicals formed during hepatic ishemia-reperfusion kill weakly metastatic colorectal cancer cells. / Jessup J.M., Battle P., Waller H., et al. // Cancer Res. 1999.- V. 59.- P. 18251829.

179. Johnson M. L. Roles of nitric oxide in surgical infection and sepsis. / Johnson M. L., Timothy R. Billiar, M.D. // World J. Surg. 1998.-V.22.-P. 187-196.

180. Johnson-Thompson M.C. Ongoing research to identify environmental risk factors in breast carcinoma. / Johnson-Thompson M.C., Guthrie J. // Cancer. 2000. - V. 88.- P. 1224-1229.

181. Juckett M.B. Nitric oxide donors modulate ferritin and protect endothelium from oxidative injury. / Juckett MB, Weber M, Balla J, et al. // Free Rad. Biol. Med. 1996. - V. 20. - P.63-73.

182. Jung I.D. Doxorubicin inhibits the production of nitric oxide by colorectal cancer cells. / Jung I.D., Lee J.S., Yun S.Y. // Arch. Pharm Res. -2002.- V. 25.-P. 691-696.

183. Jung K. Mitochondria as subcellular targets for clinically useful anthracyclines. / Jung K., Reszka R. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001.- V.-49.-P. 87-105.

184. Jung O. Extracellular superoxide dismutase is a major determinant of nitric oxide bioavailability: in vivo and ex vivo evidence from ecSOD-deficient mice. / Jung O., Marklund S.L., Geiger H., et al. // Circ. Res. - 2003.-V. 93.-P. 622-699.

185. Kaiser E. Phospholipases in biology and medicine. / Kaiser E., Chiba R., Zaku K. // Clin. Biochem. 1990.- V.23.- P. 349-370.

186. Khaletskiy A. Genes regulated in human breast cancer cells overexpressing manganese-containing superoxide dismutase. / Khaletskiy A., Wang J., Wong J.Y., Oberley L.W., Li J.J., Li Z. // Free Radic. Biol. Med. 2001. -V. 30, № 3. - P. 260-267.

187. Kanner J. Nitric oxide as an antioxidant. / Kanner J., Harel S., Granit R. // Archives of biochemistry and byophysics. 1991. - V. 289. - P. 130136.

188. Kanno T. Oxidative stress underlies the mechanism for Ca(2+)-induced permeability transition of mitochondria. / Kanno T., Sato E.E., Muranaka S., et all. // Free Radic Res. 2004. - V.l. - P.27-35.

189. Kass G. E. N. Activation of protein kinase C by redox-cycling quinones / Kass G. E. N., Duddy S. K., Orrenius S. // Biochemical J. 1989. - V. 260. - P. 499-507.

190. Keen J.H. Mechanisms for several activities of the glutathione-S- transferase / Keen J.H., Habing W.H., Jakoby W.B. // J.Biol. Chem. - 1976.-V. 251.-P. 6183-6188.

191. Kehrer J.P. Free radicals as mediators of tissue injury and desease. / Kehrer J.P. // Critical. Rev. Toxicol. -1993.- V. 32.- P. 21-48.

192. Kerr J.F.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. / Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. // Br. J. Cancer. -1972.- V. 26.- P.239-257.

193. Keshavarzian A. High levels of reactive oxygen metabolites in colon cancer tissue: Analysis by chemiluminescence probe. / Keshavarzian A., Zapeda D., List T., Mobarhan S. // Nutr. Cancer. 1992.- V. 17.- P. 243249.

194. Khurana G. Nitric oxide and arachidonic acid modulation of calcium currents in postganglionic neurones of avian cultured ciliary ganglia. / Khurana G., Bennett M.R. // British J. Pharmacol. 1999.- V. 109.- P. 480485.

195. Kim Y.M. Inhibition of protein synthesis by nitric oxide correlates with cytostatic activity: nitric oxide induces phosphorilation of initiation factor eIF-2 alpha. / Kim Y.M., Son K., Hong S.J., et al. // Mol. Med. 1998.- V. 3.-P. 179-190.

196. King K.L. Cell cycle and apoptosis: common pathways to life and death. / King K.L., Cidlowski J.A // J Cell Biol.-1995. -V.58.- P. 175-180.

197. Kluck R.M. The release of cytochrome C from mitochondria: a primary site for bcl-2 regulation of aboptosis. / Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R. // Science.- 1997.- V. 275.- P. 1132-1136.

198. Kolb J.P. Mechanisms involved in the pro- and anti-apoptotic role of NO in human leukemia. / Kolb J.P. // Leukemia.-2000. V. 14. - P. 1685-94.

199. Koppenol W.H. Peroxynitrite, a cloaked oxidant formed by nitric oxide and superoxide. / Koppenol W.H., Moreno J.J., Pryor W.A. // Chem. Res. Toxicol. 1992.- V.5. - P. 834-842.

200. Korystov Yu. N., Shaposhnikova V.V., Levitman M.Kh., Kudryavtsev A.A. The effect of inhibitors of arachidonic acid metabolism on proliferation and death of tumor cells. // FEBS Lett. 1998.- V. 431.- P. 224-226.

201. Kristensen S.R. Importance of the cellular energy level for enzyme release induced by direct membrane damage. / Kristensen S.R. // Enzyme. 1990.-V. 43.-P. 33-46.

202. Kumar S. The RRC motif conserved in all Ret/kappaB proteins is essential for the DNA-binding activity and redox regulation of the v-Rel oncoprotein / S. Kumar, A. B. Rabson, C. Gelinas // Mol. Cell. Biol. -1992.-№ 12.-P. 3094-3106.

203. Kurose I. Nitric oxide mediates kupffer cell-induced reduction of mitochondrial energization in hepatoma cells: a comparison with oxidative burst. / Kurose I., Miura S., Fukumura D. // Cancer Res. 1993. - V. 53.-P. 2676-2682.

204. Kuross S.A. Nonheme iron in single erythrocyte membranes: Association with phospholipids and potential role in lipid peroxidation. / Kuross S.A., Hebbel R.P. //Blood. 1988. - V. 72. - P. 1278-1285.

205. Larsson R. Translocation and enhancement of phosphotransferase activity of protein kinase C following exposure of mouse epidermal cells to oxidants. / R. Larsson, P. Cerutti // Cancer Res. 1989. - V. 49. - P. 56275632.

206. Lau A.T.Y. Opposed arsenite- induced signaling pathways promote cell proliferation or apoptosis in cultured lung cells. / Lau A.T.Y., Li M., Xie. R. et al. // Carcinogenesis. 2004.- V. 25. - P. 21-28.

207. Lee K.H. Induction of apoptosis in p53-deficient human hepatoma cell line by wild-type p53 gene transduction: inhibition by antioxidant. / Lee K.H., Kim K.C., Yang Y.J. etal.//Mol. Cells.-2001.-V. 12.-P. 17-24.

208. Lee J. Y. Induction of endothelial apoptosis by 4-hydroxyhexenal. / Lee J. Y., Je J. H, Kim D. H. et al. // Eur. J. Biochem. 2004. -V.271. -P.1339-1347.

209. Lemaire G. Differential cytostatic effects of NO donors and NO producing cells. / Lemaire G., Alvarez-Pachon F.J., Beuneu C., et al. // Free Rad. Biol. Med. 1999. - V. 26. - P. 1274-83.

210. Lepoivre M. Alterations of ribonucleotide reductase activity following induction of the nitrite-generating pathway in adenocarcinoma cells. / Lepoivre M., Chenais B., Yapo A., et al. // J. Biol. Chem. 1990.- V. 265.-P. 14143 - 14149.

211. Leung S. Y. Phospholipase A2 group IIA expression in gastric adenocarcinoma is associated with prolonged survival and less frequent metastasis. / Leung S. Y., Chen X, Chu K. M. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002 December 10; 99 (25): 16203-16208.

212. Li D. Oxidative DNA damage and 8-hydroxy-2-deoxyguanosine DNA glycosylase/apurinic lyase in human breast cancer. / Li D., Zhang W., Zhu J., Chang P. // Mol. Carcinogen.- 2001.- V. 31.- P. 214-223.

213. Li J. Intracellular superoxide induces apoptosis in VSMCs: Pole of mitochondrial membrane potential, cytochrome C and caspases. / Li J., Li P.F., Dietz R., et al. // Apoptosis. 2002.- V.7. - P. 511-517.

214. Li N. Inhibition of cell growth in NIH/3t3 fibroblasts by overexpression of manganese superoxide mismutase: mechaninstic studies / N. Li, T. D. Oberley, L.W. Oberley, W. Zhong. // J. Cell Physiol. 1998. - V. 175, №3, - P. 359-369.

215. Li S. The role of cellular glutathione peroxidase redox regulation in the suppression of tumor cell growth by manganese superoxide dismutase / S.1., T. Yan, J.Q. Yang, T.D. Oberley, L.W. Oberley. // Cancer Res. 2000. -V. 60, № 15.-P. 3927-39.

216. Li Z. Genes regulated in human breast cancer cells overexpressing manganese-containing superoxide dismutase / Z. Li., A. Khaletsky, J. Wang, J. Y. Wong, L. W. Oberley, J. J. Li // Free Radic. Biol. Med. -2001. V. 33,- № 3. -P. 260 - 267.

217. Lind D.S. Nitric oxide contributes to adriamycin"s antitumor effect. / Lind D.S., Kontaridis M.I., Edwards P.D. et al. // J. Surg. Res. 1997. -V.2.-P. 283-287.

218. Lissi E. Luminol luminescence induced by 2,2-azo-bis-(2-amidinopropan) thermolisis. / Lissi E., Pascual C., Castillo M. // Free Rad. Res. Comras.- 1992. V. 17. - P. 299-311.

219. Littel C. An intracellular GSH-peroxidase with a lipid peroxide substrate / C. Littel, P.J. O"Brien // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. - V. 31.-P. 145-150.

220. Liu R. Oxygen free radicals mediate the iduction of manganese superoxide dismutase gene expession by TNF-alfa. / R. Liu, G.R. Buettner, L.W. Oberley // Free Radic Biol Med. 2000. - Vol. 28, № 8. - P. 11971205.

221. Lo Y.Y. Involvement of reacrive oxygen species in cytokine and growth factor induction of c-fos expression in chondrocytes. / LoY.Y., Cruz T.F. // J.Biol. Chem. 1995.- V. 270.- P. 11727-11730.

222. Lo Y.Y. Reacrive oxygen species mediate cytokine activation of c-Jun NH2-terminal kinases. / Lo Y.Y., Wong J.M.S., Cruz T.F.// J.Biol. Chem. -1996,-V. 271.-P. 15703-15707.

223. Loborek M. Fatty acid-mediated effects on the glutathione redox cycle in cultured endothelial cells. / M. Loborek, M. Toborek, B. Hennig // Amer. J. Clin. Nutr. 1994. -V.59, № 1. - P 60-65.

224. Lonardo F. The normal erbB-2 product is an atipycal receptor-like tyrosine kinase with constitutive activityin the absence of ligand. / Lonardo

225. F., Di Marco E., King C.R. // New Biol. 1990.- V. 2.- P. 992-1003.

226. Longoni B. Regulation of Bcl-2 protein expression during oxidative stress in neuronal and endothelial cells. / Longoni B., Boschi E., Demontis

227. G.C. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1999.- V.260.- P. 522-526.

228. Loughlin K.R. The use of hydrogen peroxide to enhance the sfficacy of doxorubicin hydrochloride in a murine bladder tumor cell line. / Loughlin K.R., Manson K., Cragnale D., et al. // J. Urol.- 2001.- V. 165.- P. 1300 -1308.

229. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent. / Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. // J. Biol. Chem. -1951.-V. 193.-P. 265-275.

230. Lundberg A.S. Control of the cell cycle and apoptosis. / Lundberg A.S. and Weinberg R.A. // European Journal of Cancer. 1999.-V. 35.- No 4.-P. 531-539.

231. Luo D. Inhibition of nitric oxide synthase by antineoplastic anthracyclines. / Luo D., Vincent S.R. // Biochem. Pharmacol. 1994. V. 11. -P. 2111 -2112.

232. Maccarone M. Nitric oxide donor compaunds inhibit lipoxigenase activity. / Maccarone M., Corasanti M.T., Guerreri P. // Biochem Biophys Res Commun. 1996.- V.219.- P.128.-133.

233. Malins D.C. Progression of human breast cancer to the metastatic state is linked to hydroxyl radical-induced DNA damade. / Malins D.C., Polissar N.L., Guncelman S.J. // Proc.Nat.Acad.Sci. USA.- 1996.- V.93.- P. 25572563.

234. Mannervik B. The isoenzymes of glutathione transferase. / B. Mannervik // Advances in enzymology and related areas of molecular biology. 1985. -V. 57.-P. 357-417.

235. Mannick J. B. S-Nitrosylation of mitochondrial caspases. / Mannick J. B., Schonhoff C., PapetaN., et all. // J. Cell Biol.- 2001.-V. 154.- N.6.- P. 1111-1116.

236. Maragos C.M. Nitric oxide/nucleophyle complexes inhibit the in vitro proliferation of A3 75 melanoma cells via nitric oxide release. / Maragos C. M., Wang J.M., Hraibie J.A. et al. // Cance. Res. 1993.- V. 53. - P. 564568.

237. Marietta M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. / Marietta M.A. // J. Biol. Chem. -1993.- V. 268.- P. 12231-12234.

238. Mates J.M. Role of reactive type of oxygen in apoptosis: values for therapy of a cancer. / Mates JM, Sanchez-Jimenez FM. // Cell Mol Biol. -2000.- V.46.-P. 199-214.

239. Matthews N.E. Nitric oxide-mediated regulation of chemosensitivity in cancer cells. / Matthews N.E., Adams M.A., Maxwell L.R. et al. // J. Natl. Cancer Inst.-2001.-V. 93.-P. 1879-1885.

240. McCord J.M. Superoxide and superoxidedismutase / J.M. McCord, J.A. Boyle, E.D. Day, L.J. Rizsolo // Ed. Michelson A.M. 1977. - P. 128-132.

241. McCormick M.L. Superoxide dismutase and catalase levels in renal-tumors and their autonomous variants in the Syrian hamster / McCormick M.L. // Carcinogenesis. 1991. -V. 12. - P. 977-983.

242. Menconi M J. Nitric oxide donor-induced hyperpermeability of cultured intestinal epithelial monolayers: role of superoxide radical, hydroxyl radical, and peroxynitrite. / Menconi M. J., Tsuji N., Unno M., et all. // Shock. 1996. - V.6. - P. 19-24.

243. Meneghini R. Iron homeostasis, oxidative stress and DNA damage. / Meneghini R. // Free Rad. Biol. Med. 1997.- V. 23.- P. 783-792.

244. Meyer M. H202 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-kB and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant response factor. / Meyer M., Schereck R., Baeuerle P.A. // EMBO J.- 1993.- V. 12.-P. 2005-2015.

245. Mignotte B. Mitichondria and apoptosis. / Mignotte B., Vayssiere J-L. // Eur. J. Biochem. -1998.- V.252.- P.l-15.

246. Mills J.C. Apoptotic membrane blebbing is regulated by myosin light chan phosphorylation. / Mills J.C., Stone N.I., Erhardt J., Pittman R.N. // J.Cell Biol.-1998.-V. 140.-P.627-636.

247. Min K. The Multidrug resistance transporter ABCG2 (breast cancer resistance protein) effluxes Hoechst 33342 and is overexpressed in hematopoietic stem cells. / Min K., Turnquist H., Jackson J., et al. // Clinical Cancer Research.-2002.-V. 8. P.22-28.

248. Miura T. Adriamycin-Fe -induced inactivation of enzymes in erythrocyte membranes during lipid peroxidation. / Miura T., Muraoka S., Ogiso T. // Res. Commun. Molec. Pathol. Pharmacol. 1995. - V. 87. - P. 133-143.

249. Miura Y. In vivo electron paramagnetic resonance studies on oxidative stress caused by x-irradiation in whole mice. / Miura Y., Anzai K., Urano S., Ozawa T. // Free Radical Biology and Medicine.- 1997.- V.23. P. 533540.

250. Modolell M. Oxidation of N-hydroxyl-L-arginine to nitric oxide mediated by respiratory brust: an alternative pathway to NO synthesis. / Modolell M., Eichmann K., Soler G. //FRBS Let. 1997.- V. 401.- P. 123126.

251. Morcos E. Endogenously formed nitric oxide modulates cell growth in bladder cancer cell lines. / Morcos E., Jansson D.T., Adolfson J., et al. // Urology. 1999.- V. 53.- P. 1252-1257.

252. Moriya M. Single-stranded shuttle phagemidfor mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanin in DNA induses targeted GC TA transversions in simian kidney cells. / Moriya M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993. V. 90. - P. 1122-1126.

253. Mozart M. Nitric oxide induces apoptosis in NALM-6 a leukaemia cell line with low cyclin E protein levels. / Mozart M., Scuderi R., Celsing F., Aguilar-Santelises M. // Cell Prolif. - 2001.- V. 34.- 369-78.

254. Mueller C. Identification of anovel redox-sensitive gene, Id3,which mediates angiotensin II-induced cell growth. / MuellerC., Baudler S., Welzel H., et al. // Circulation. 2002.- V. 105.- P. 2423-2428.

255. Mufti S.I. Alcohol-stimulated promotion of tumors in the gastrointestinal tract. / Mufti S.I. // Cancer Detect. Prev. -1998.- V.22.- P.195-203.

256. Murrell G. A. C. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals. / Murrell G. A. C., Francis M. J. O., Bromley L. // Biochem. J. -1990. V. 265.-P. 659-665.

257. Musarrat J. Prognostic and etiological relevance of 8-hydroxyguanosine in human breast carcinogenesis./ Musarrat J., Arezina-Wilson J., Wani A.A. //Eur. J. Cancer.- 1996.- V. 32A.- P. 1209-1214.

258. Musch M.W. Antigen stimulated release of arachidonic acid, lipoxigenase activity and histamine release in a cloned murine mast cells. / Musch M. W., Siegel M.I. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985.-V. 126.-P. 517-525.

259. Nakano T. Manganese superoxide dismutase expression correlates with p53 status and local recurrence of cervical carcinoma treated with radiation therapy / T. Nakano, K. Oka and N. Taniguchi // Cancer Res. 1996. - V. 56.-P. 2771-2775.

260. Nakaya N. Specific pattern of p53 phosphorylation during nitric oxide-induced cell cycle arrest. / Nakaya N., Lowe S.W., Taya Y., Chenchik A., Enikolopov G. // Oncogene.- 2000.- V. 19. 6369-6375.

261. Nalbone G. Phospholipase A activity of cultured rat ventricular myocyte is affecrted by the nature of cellular polyunsaturated fetty acids. / Nalbone G., Grynberg A., Chevalier A., et al. // Lipids. 1990.- V. 25.- P. 301- 306.

262. Neidle S. The interaction of daunomicin and adriamicin with nucleic acids. / Neidle S., Sanderson M.R. // Molecular aspects of anricancer drug action. Eds. Neidle S., Warring M.J. - London, - 1983.- P. 35-55.

263. Nindl G. Effect of hydrogen peroxide on proliferation, apoptosis and interleukin-2 production of Jurkat T cells. / Nindl G., Peterson N.R., Hughes E.F. // Biomed Sci Instrum. 2004. - V.40. - P. 123-128.

264. Nishiyama M. Can cytotoxic activity of antracyclines be related to DNA damage? / Nishiyama M., Horichi N., Mazouzi Z., et al. // Anticancer Drug Des. 1990.- V.5.- N 1. - P. 135-139.

265. Nojima H. Cell cycle checkpoints, chromosome stability and the progression of cancer. / Nojima H. // Hum cell.-1997.-V. 10.- P.221-230.

266. Nose K. Transcriptional activities of early response genes in a mouse osteoblastic cell line. / Nose K., Shibanuma M., Kikuchi K.// Eur. J. Biochem. 1991. -V. 201. - P. 99-106.

267. Nussler K. A. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase. / Nussler K., Billiar T. R. // J. Leukoc. Biol.-1993.~V.54.-P.171-178.

268. Oberley, L.W. Superoxide Dismutase. 1982- (Oberley, L. W. ed.) -V. 2, 127 p.

269. Oberley T.D. Immunohistcchemica localization of antioxidant enzymes in adult Syrian hamster tissues and during kidney development / Oberley T.D., Oberley L.W., Slattery A.F., Lauchner L.J. and Elwell J.H. // Am. J. Pathol. 1990. - V. 56. - P. 137-199.

270. Oberley L.W. The role of antioxidant enzyme in cell immortalization and transformation / Oberley L.W and Oberley T.D. // Mol. Cell. Biocem. -1988.-V. 84.-P. 147-153.

271. Oberley T.D. In vitro modulation of antioxidant enzyme levels in normal hamster kidney and estrogen-induced hamster kidney tumor / Oberley T.D., Schultz J.L. and Oberley L.W. // Free Radic. Biol. Med. 1994. - V. 16,-P. 741-751.

272. Oberley T.D. Immunogold analysis of antioxidant enzymes in human renal cell carcinoma. / Oberley T.D., Sempf J.M., Oberley M.J., McCormick M.L., Muse K.E. and Oberley L.W. // Virchows Archiv. -1994.-V. 424.-P. 155-164.

273. Oberley T. Antioxidant enzyme levels as a function of growth state in cell culture. / Oberley T., Schuetz J., Oberley L. // Free Radical Biology and Medicine. 1995.-V. 19, №1.-P. 53-65.

274. Oberley L.W. Anticancer therapy by overexpression of superoxide dismutase. / Oberley L.W. // Antioxid Redox Signal. 2001. - V. 3. - P. 461-72.

275. Okada S. Iron-induced tissue damage and cancer: The role of reactive oxygen species-free radicals. / Okada S. // Patholgy Int. 1996.- V. 46.- P. 311-332.

276. Orlov S.N. Apoptosis in vascular smooth muscle cells: Role of cell shrinkage. / Orlov S.N., Dam T.V., Tremblay J.et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 221. P.708-715.

277. Padmaja S. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals. / Padmaja S, Huie RE. // Biochem.Biophys. Res.Commun. 1993. - V. 195. -P. 539-544.

278. Pagnini U. Modulation of anthracycline activity in canine mammary tumour cells in vitro by medroxyprogesterone acetate. // Pagnini U, Florio S, Lombardi P, et all. // Res Vet Sci.- 2000.- V.69.- N.3. P. 255-62.

279. Pandey S. Oxidative stress and activation of proteasome protease during serum deprivation-induced apoptosis in rat hepatoma cells; inhibition of cell death by melatonin. / Pandey S., Lopez C., Jammu A. // Apoptosis. -2003.- V. 8.-P. 497-508.

280. Park K.G.M. Evidence for the stimulation of human tumor growth by the aminoacid L-arginine. / Park K.G.M., Heyes P.H., Blessing K., et al. // Soc. 1991.- V. 50.- P. 139A- 145A.

281. Park K.G.M. L-arginine stimulates human lymphocyte natural cytotoxicity. / Park K.G.M., Heyes P.H., Garlick P.J. et al. // Proc. Nutr. Soc. 1991.- V. 50.- P. 772A-776A.

282. Parkin D.M. Global cancer statistics in the year 2000. / Parkin D.M. // The Lancet Oncology. 2001. - V. 2.- P. 533-543.

283. Patel R. P. Reduction of Cu(II) by lipid hydroperoxides: implications for the copper-dependent oxidation of low-density lipoprotein. / Patel R. P., Svistunenko D., Wilson T., et al. // Biochem J. 1997.- V. 322.- P. 425433.

284. Pervin S. Nitric oxide-induced cytostasis and cell cycle arrest of human breast cancer cells line (MDA-MB-231): potential role of cyclin Dl. / Pervin S., Singh R., Chaudhuri G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001.-V.98.-P. 3583-3588.

285. Pcivova J. Effect of beta-adrenoreceptor blocking drugs on arachidonic acid liberation from phospholipids in stimulated rat mast cells. / Pcivova J., Drabikova K., Nosal R. // Agent and Action. 1989. - V. 27. - P. 29- 32.

286. Pietraforte D. One-electron oxidation pathway of peroxinitrite decomposition in human blood plasma: evidence for the formation of protein tryptophan-centred radicals. / Pietraforte D., Minetti M. // Biochem J.- 1997. V. 321.- P. 743-750.

287. Pignatti C. Nitric oxide mediates either proliferation or cell death in cardiomiocytes. / Pignatti C., Tantini D., Stefanelli C. // Amino Acids. - 1999.-V. 16.-P. 181-190.

288. Plesniak LA. Conformation of micellar phospholipid bound to the active site of phospholipase A2. / Plesniak L.A., Yu L., Dennis E.A. // Biochemistry. 1995 - V. 34. - P. 4943-4951.

289. Polyak K. A model for p53-induced apoptosis. / Polyak K., Xia Y., Zweier J.L., Kinzler K.W., Vogeldstein B. // Nature.- 1997.- V.389.- P. 237-238.

290. Potter A.J. Flow cytomctric analysis of the cell cycle phase specificity of DNA damage induced by radiation, hydrogen peroxide and doxorubicin. / Potter A.J., Gollahon K.A., Palanca B. J., et al. // Carcinogenesis.- 2002.-V.23.- P. 389-401.

291. Pryor W.A. Free-radical reactions in biology: initiations of lipid autooxidations by ozone and nitrogen dioxide.// Pryor W.A. // Environ. Health Perspect.- 1976.-V. 16,-P. 180-181.

292. Radi R. Peroxinitrite oxidation of sulfhydrils. / Radi R., Beckman J.S., Bush K.M. et al. // J. Biol. Chem. - 1991.- V. 226. - P. 4244-4250.

293. Radomski M. K. Human colorectal adenocarcinoma cells: differential nitric oxide synthesis determines their ability to aggregate plateles. / Radomski M. K., Jenkins D.C., Holmes L. // Cancer Res. 1991.- V. 51.-P. 6073-6078.

294. Rao D.N. Production of nitric oxide and other iron-containing metabolites during the reductive metabolism of nitroprusside by microsomes and by thiols. / Rao D.N., Cederbaum A.I. // Arch Biochem Biophys. 1995.- V. 321. - P. 363-371.

295. Ray L. E. Isolation and some characteristics of glutathione reductase from rabbit erythrocytes. / Ray L.E., Prascott J.M. // Proc. Soc. Exp. Biol. 1975.- V. 148.-P. 402-409.

296. Renooij W. Topological asymmetry of phospholipid metabolism in rat erythrocyte membranes. / Renooij W., Van Golde L. M. G., Zwaal R. F. A., et al. //Eur. J. Biochem. 1976.- V. 61.- P. 53-58.

297. Rice-Evance C. Free radical-lipid interactions and their pathological consequences. / Rice-Evance C., Burdon R. // Prog. Lipid Res. -1993. V. 32.- P. 71-110.

298. Riley P.A. Free radicals in biology: Oxidative stress and the effects of ionizing radiation. / Riley P.A. // Int. J. Radiat. Biol. 1994,- V.65.- P. 2733.

299. Risom L. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exrpsure to diesel exhaust particles by inhalation. / Risom L., Dybdahl M., Bornholdt J. et al. // Carcinogenesis. - 2003.-V. 24.-P. 1847-1852.

300. Rizzo M.T. Induction of apoptosis by arashidonic acid in chronic mieloid leukemia cells. / Rizzo M.T., Regazzi E., Garau D., Acard L. et al. // Cancer Res. 1999.- V. 59.- P. 5047-5053.

301. Robles S. J. Permanent cell cycle arrest in asynchronously proliferating normal human fibroblasts treated with doxorubicin or etoposide but not camptothecin. / Robles S. J. // Biochem. Pharmacol. 1999.- V.58.- P. 675-685.

302. Romagnani P. IP-10 and Mig production by glomerular cells in human proliferative glomerulonephritis and regulation by nitric oxide. // Romagnani P, Lazzeri E, Lasagni L, Mavilia C, et all. // J. Am. Soc. Nephrol.- 2002.- V.13.- N.I.- P.53-64.

303. Rose D. Effects of fatty acids and inhibitors of eicosanoid synthesis on the growth of a human breast cancer cell line in culture. / Rose D., Connolly M. // Cancar Res. 1990. -V. 50.- P. 7139-7144.

304. Rossi M.A. Analysis of glutathione deprndet enzyme activities in two different rat hepatomas and in normal liver in relation to their role in resistance to oxidative stress. / Rossi M.A., Dianzani M. // Tumori. -1988.-Vol. 74.-P. 617-621.

305. Sacai T. Inhibition of NO synthase induction by an anticancer drug 4"-epi-doxorubicin in rats. / Sacai T., Muramatsu I., Hayashi N. et al.// Gen. Pharmacol. 1996. - Vol.8. - P. 1367 - 1372.

306. Salvemini D. Nitric oxide activates Cyclooxigenase enzymes./ Salvemini D., Misko T. P., Masferer J.L. // Proc.Natl. Acad. Sei. USA. 1993.-V.90.- P. 7240- 7244.

307. Salvemini D. regulation of prostaglandin production by nitric oxide; an in vivo analysis. / Salvemini D., Settle S.L., Masferer J.L. / British J. Pharmacol.- 1995.-Y. 114,- P. 1171-1178.

308. Sandler S. Novel experimental strategies to prevent the development of type 1 diabetes mellitus. / Sandler S, Andersson AK, Barbu A, et all. // Ups. J. Med. Sei.- 2000. V.105. - N.2.- P.17-34.

309. Sandstrom P.A. Autocrine production of extracellular catalase prevents apoptosis of the human CEM T-cell line in cerum free medium. / Sandstrom P.A., Buttke T.M. // Proc.Natl. Acad. Sei. USA. 1993.- V.90.-P. 4708- 4712.

310. Schenk H. Distinct effect of thioredoxin and antioxidants on the activation of transcription factors NF-kB and AP-1. / Schenk H., Klein M., Erdbrugger W., et al. // Proc.Natl. Acad. Sei. USA. 1994.- V 91.- P. 1672-1676.

311. Schreck R. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of NF-kappa B transcription factor and HIV-1. / Schreck R., Richer P., Baeuerle P. A. // EMBO Journal. 1991. - № 10.-P. 2247-2258.

312. Schuler M. Mechanisms of p53-dependent apoptosis.// Schuler M., Green D.R. // Biochem. Soc. Trans.- 2001.- V.29.- P.684-688.

313. Scorrano L. Arachidonic acid causes cell death through the mitochondrial permeability transition. / Scorrano L., Penzo D., Petronilli V., Pagano F., Bernardi P. // J. Biol. Chem.- 2001.- V. 276.- P. 1203512040.

314. Scorza G. Role of ascorbate and protein thiols in the release of nitric oxide from S-nitroso-albumin and S-nitroso- glutathione in human plasma. / Scorza G., Pietraforte D., Minetti M. // Free Rad. Biol. Med. 1997.- V. 22.-P. 633-642.

315. Sedlis S.P. Effects of lysophosphatidylcholine on cultured heart cells: correlation of rate of uptake and extent of accumulation with cell injury. / Sedlis S.P., Seqeira J.M., Ahumada G.G., et al. // J. Lab. Clin. Med. -1988.-V. 112.-P. 745-754.

316. Sen C.K. Antioxidants and redox regulation of gene transcription. / Sen C.K., Packer L. // FASEB J. 1996.- V. 10.- P. 709-720.

317. Seril D.N. Oxidative stress and ulcerative colitis-associated carcinogenesis: studies in humans and animal models. / Seril D.N., Liao J., Yang G-Y., Yang C.S. // Carcinogenesis.- 2003.- V.24. P.353-362.

318. Sevanian A. The influence of phospholipase A2 and glutathione peroxidase on the elimination of membrane lipid peroxides / Sevanian A., Muakkassah-Kelley S.F., Montestruque S. // Arch. Biochem. Biophys. -1983. V. 223. - P. 441-452.

319. Shen J. Liver tumorigenicity of trimethylarsine oxide in male Fischer 344 rats - association with oxidative DNA damage and enhanced cell proliferation. / Shen J., Wanibuchi H., Salim E.I. et al. // Carcinogenesis. -2003.-V. 24.-P. 1827-1835.

320. Shi Q. Influence of nitric oxide synthase II gene disruption on tumor growth and metastasis. // Shi Q, Xiong Q, Wang B, et all. // Cancer Res.-2000.- V. 60.-P. 2579-2583.

321. Shibanuma M. Induction of DNA replication and expression of protooncogenes c-myc and c-fos in quiescent Balb/3T3 cells by xanthine-xanthine oxidase. / M. Shibanuma, T. Kuroki, M. Nose // Oncogene. -1988.- V. 3.-P. 17-21.

322. Shibanuma M. Stimulation by hydrogen peroxide of DNA synthesis competence family gene expression and phosphyorylation of a specific protein in quiescent Balb/ 3T3 cells. / M. Shibanuma, T. Kuroki, K. Nose // Oncogene. 1990. - V. 3. - P. 27-32.

323. ShinouraN. Expression level of Bcl-2 determines anti- or proapoptotic function. / Shinoura N., Yoshida Y., Nishimura M., Muramatsu Y., Asai A. // Cancer Res.- 1999.- V. 59.- P. 4119-4128.

324. Siegert A. Nitric oxide of human colorectal adenocarcinoma cell lines promotes tumour cell invasion. / Siegert A., Rosenberg C., Schmitt W.D., et all. //Br. J. Cancer.- 2002 .-V.86.-N.8. P. 1310-1315.

325. Sies H. // Oxidative stress: oxidants and antioxydants. N. Y.: Academic Press. 1991.- 128 p.

326. Singh S. Niyric oxide, the biological mediator of the decade: fact or fiction. / Singh S., Evans T.V. // Eur.Respir. J. -1997,- V.10.- P. 699-707.

327. Smalowski W. E. Nitric oxide exposure inhibits induction of lymphokine-activated killer cells by inducting precursor apoptosis. /

328. Smalowski W.E., Yim C.- Y., McGregor J.R. // Nitric oxide: biology and chemistry. 1998.- V. 2.- P. 45-56.

329. Smith T.R. DNA damage and breast cancer risk. / Smith T. R., Miller M.S., Lohman K.K. // Carcinogenesis. 2003. - V. 24. - P. 883-889.

330. Snow E.T. Metal carcinogenesis: mehanistic implications. / Snow E.T. //Pharmacol Ther. 1992.- V.53.- P. 31-65.

331. St. Clair O.K. Complementary DNA encoding colon cancer manganese superoxide dismutase and the expression of its gene in human cells. / St. Clair O.K. and Holland J.C. // Cancer Res. 1991. - V. 51. - P. 939-943.

332. Stein C. S. Involvement of nitric oxide in IFN-gamma-mediated reduction of microvessel smooth muscle cell proliferation. / Stein C.S., Fabry Z., Murphy S., Hart M.N. // Mol. Immunol. 1995.- V. 32.- P. 96573.

333. Stirpe F. Stimulation by xanthine oxidase of 3T3 Swiss fibroblasts and human lymphocytes. / Stirpe F., Higgins T., Tazzori P. L., Rosengurt E. // Exp. Cell Res. 1999.-V. 192.-P. 635-638.

334. Sun Y. Free radicals, antioxidant enzymes, and carcinogenesis. / Y. Sun // Free Radic. Biol. Med. 1990. - V. 8, - P. 583-599.

335. Sun Y. Lowered antioxidant enzymes in spontaneously transformed embryonic mouse liver cells in culture. / Sun Y., Oberley L.W., Elwell J.H. and Sierra-Rivera E. // Carcinogenesis. 1993. - V. 14. - P. 1457-1463.

336. Takei Y. Evidences for involvement of cyclooxigenase-2 in proliferation of two gastrointestinal cancer cell lines. / Takei Y., Kobayashi I., Nagano K., et al. // Prostagland. Leukotriens and Essent. Fatty Acids. 1996.- V. 55.-P. 179-183.

337. Terwel D. S-nitroso-N-acetylpenicillamine and nitroprusside induce apoptosis in a neuronal cell line by the production of different reactive molecules. / Terwel D, Nieland LJ, Schutte B, et all. // Eur. J. Pharmacol.-2000 .-V. 14.- P.19-33.

338. Tham D.M. Increased expression of extracellular glutatione peroxidase in mice with dextran sodium sulfate-induced experimental colitis. / Tham D.M., Whitin J.C., Cohen HJ. // Pediatr. Res. 2002. - V. 5.- P. 641-646.

339. Thannickal V.J. Ras-dependent and - independent regulation of reacrive oxigen species by mitogenic growth factors and TGF-(31. / Thannickal V.J. // FASEB J.- 2000.- V.14.- P. 1741-1748.

340. Thomas W.J. The role of oxygen-derived free radicals and nitric oxide in cytokine-induced antiproliferation of pancreatic cancer cells. / Thomas W.J., Thomas D.L., Knezetic J.A., et all. // Neuropharmacology.-2002.- V.-42.-N.2.-P.262-269.

341. Tormos C. Role of glutathione in the induction of apoptosis and c-fos and c-jun mRNAs by oxidative stress in tumor cells / Tormos C., Javier Chaves F., Garcia M.J., et all. // Cancer Lett. 2004. - V.208.- P.103-113.

342. Tsudji S. Evidence for involvement of cyclooxigenase-2 in proliferation of two gastrointestinal cancer cell lines. / Tsudji S., Kawano S., Sawaoka

343. H., Takei Y. I I Prostagland. Leukotriens ans Essent. Fatty Acids. 1996. -V.55.-P. 179-183.

344. Um H.D. Fas mediates apoptosis in human monocytes by a reactive oxygen intermediate dependent pathway. / Um H.D., Orenstein J.M., Wahl S.M. // J. Immunol. 1996.- V.156.- P. 3469-34-77.

345. Umansky V. Activated endothelial cells induce apoptosis in lymphoma cells: Role of nitric oxide. / Umansky V., Bucur M., Schirrmacher V., et al. /Int. J. Oncol. 1997.- V. 10. - P. 465-471.

346. Van der Woude C.J. Cronic inflammation, apoptosis and pre-malignant lesions in the gastro-intestinal tract. / Van der Woude C.J., Kleibeuker J.H., Jansen P.L., Moshage H. // Apoptosis.- 2004.- V.9.- P. 123-130.

347. Vaskovsky V.E. A universal reagent for phospholipid analysis. / Vaskovsky V.E., Kostetsky E., Vasendin I.A. // J. Chromatography/-1975. -V. 115.- P.129-142.

348. Vaskovsky V.E. Modified Junguikkel"s reagent for detecting phospholipids and other phosphorous compounds on thin-layer chromatograms. / Vaskovsky V.E., Latyshev N. // J. Chromatography/-1975.-V. 115.-P. 246-249.

349. Vetrovsky P. Possible mechanism of nitric oxide production from N-hydroxy-L-arginine or hydroxylamine by superoxide ion. / Vetrovsky P., Stoclet J., Entlicher G. // Int.J. Biochem. Cell. Biol. 1996.- V28.- P. 1311-1318.

350. Wang H. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. / Wang H., Joseph J. A. // Free Rad. Biol. Med.- 1999. V.27.- P. 612-616.

351. Wasylyk C. Oncogenic conversion of Ets affects redox regulation in vivo and in vitro. / Wasylyk C., Wasylyk B. // Nucleic Acids Res. 1993. -Vol. 21.-P. 523-529.

352. Weinberg R.A. Tumor supressor genes. / Weinberg R.A. // Science.-1991.-V.254.-P. 1138-1146.

353. Weinstein D. M. Cadiac peroxinitrite formation and left ventricular disfunction following doxorubicin treatment in mice. / Weinstein D. M., Mihm M.J., Bauer J.A. // J Pharmacol Exp. Ter. 2000.- V. 294. - P. 396401.

354. Whitin J.C. Extracellular glutatione peroxidase is secreted basolaterally by human renal proximal tubule cells. / Whitin J.C., Bhamre S., Tham D.M., Cohen H. J. // Am. J. Renal. Physiol. 2002.- V. 283,- P. F20 - F28.

355. Willson R.L. Organic peroxy free radicals as ultimate agents in oxygen toxicity. / Willson R.L. // Oxidative stress. L., Acad. Press. - 1985.- P. 41-72.

356. Winter M.L. Free radical-induced carbonyl content in protein of estrogen-treated hamsters assayed by sodium boro(3H)hydride reduction / Winter M.L. and Liehr J.G. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 66, № 2. - P. 14446-14450.

357. Xu Q. Cellular defense against H202-induced apoptosis via MAP kinase-MKP-1 pathway. / Xu Q., Konta T., Nakayama K. et all. // Free Radic. Biol. Med. 2004. - V.36. - P. 985-993.

358. Xu W. Nitric oxide upregulates expression of DNA-PKcs to protect cells from DNA-damaging anti-tumour agents. / Xu W., Liu L., Smith G.C., Charles L.G. //Nat. Cell. Biol. 2000.- V.2.- N.6.- P.339-345.

359. Yamamoto S. Tumor promotion and arachidonic acid cascade. / Yamamoto S. // Nippon Yakurigaku Zasshi.- 1993.-V. 101.-N.6.- P. 34961.

360. Yamamoto T. Nitric oxide donors. / Yamamoto T., Bing R.J. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 2000.- V. 225. - P. 1-10.

361. Yang J.Q. v-Ha-ras mitogenic signaling through superoxide and derived reactive oxygen species. / Yang JQ, Buettner GR, Domann FE, Li Q,

362. Engelhardt JF, Weydert CD, Oberley LW. 11 Anticancer Res.- 2001.- V. 21.-P. 3949-56.

363. Yang A.H. In vitro modulation of antioxidant enzymes in normal and malignant renal epithelium. / A.H. Yang, T.D. Oberley, L.W. Oberley, S.M. Schmid, K.B. Cummings. // In Vitro Cell Dev. Biol. 1987 - V. 23, №8.-P. 546-558.

364. Yang F. Modulation of nitric oxide evoked apoptosis by the p53-downstream target p21 (WAF1/CIP1). / Yang F., Knethen A., Brune B. // J. Leukoc. Biol. -2000. -V.69. - P.916-922.

365. Yu B. P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. / B. P.Yu. // Physiol. Review. 1994. - V. 74, № 1. - P. 139-162.

366. Zhang R. Thioredoxin-2 Inhibits Mitochondria-Located ASK 1-Mediated Apoptosis in a JNK-Independent Manner. / Zhang R., Al-Lamki R., Bai L. et all. // Circ Res. 2004. - V.94 - P. 1483 - 1491.

367. Zhang X.M. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. / X.M.Zhang, Q. Xu // Eur. J. Surg.- 2001,-V.167.- N. 7,- P. 484-489.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Поделиться: