Una manifestación de la reacción de aglutinación es. Reacción de aglutinación (RA), mecanismo y métodos de fraguado. Ingredientes y como conseguirlos. El uso de la AR en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Posibles tipos de aglutinación en la determinación del grupo sanguíneo.
La reacción de aglutinación se basa en la interacción específica de anticuerpos (aglutininas) con células microbianas completas o de otro tipo. Como resultado de esta interacción se forman partículas-aglomerados que precipitan (aglutinan). En la reacción de aglutinación pueden participar bacterias, protozoos, hongos, levaduras, rickettsias, eritrocitos y otras células, tanto vivas como muertas. La reacción procede en dos fases: la primera es la combinación específica del antígeno y el anticuerpo, la segunda es inespecífica, es decir, la formación de un aglutinado visible. La precipitación de aglutinados ocurre en presencia de electrolitos, como el cloruro de sodio. Los microorganismos del aglutinado permanecen vivos, pero pierden su movilidad.
La reacción de aglutinación se usa ampliamente para el diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas y la determinación de la estructura antigénica de microbios aislados. Para establecer la estructura antigénica de un patógeno aislado del cuerpo de un paciente o portador, se utiliza un suero inmune específico obtenido mediante la inmunización de animales (conejo, burro, carnero) con determinados microorganismos. La identificación del microbio se realiza en la reacción de aglutinación sobre vidrio con sueros adsorbidos o monorreceptores o en probetas con sueros aglutinantes específicos. Los sueros adsorbidos contienen anticuerpos solo contra antígenos específicos de un microbio dado, y los sueros monorreceptores contienen anticuerpos solo contra un antígeno específico del patógeno.
Los sueros de las especies contienen anticuerpos contra todos los antígenos de un microbio en particular.
La afiliación del cultivo aislado de un microorganismo a esta especie se determina por aglutinación con su suero conocido al título de anticuerpos indicado en la etiqueta de la ampolla de suero. El título de anticuerpos séricos se considera la última dilución del mismo, en la que aún se observa aglutinación del cultivo de microbios utilizado para inmunizar al animal. Los sueros adsorbidos y monorreceptores suelen utilizarse sin diluir en la reacción de aglutinación sobre vidrio.
Al determinar la presencia de anticuerpos en el suero sanguíneo del paciente, se diluye con una solución isotónica de cloruro de sodio, a partir de una dilución de 1:50 a 1:800 o más. Se agrega una suspensión de microbios vivos o muertos a cada dilución. Las preparaciones que contienen microbios muertos por calor o formalina se llaman diagnosticums. Los diagnósticos obtenidos por calentamiento de cultivos de microorganismos contienen sólo antígenos somáticos. Cuando solo se usa formalina, los antígenos flagelares también se conservan en los microbios.
En presencia de anticuerpos en la sangre del paciente, el diagnóstico tomado en la reacción se une y se forma un precipitado (aglutinado) en dos tubos de ensayo. En este caso, los resultados de la reacción de aglutinación se consideran positivos. En el tubo de control, donde se añaden solución isotónica de cloruro de sodio y diagnóstico, la suspensión de microbios debe ser homogénea (reacción de aglutinación negativa).
La contabilidad de los resultados de la reacción de aglutinación en algunas enfermedades, como la leptospirosis, se lleva a cabo solo microscópicamente en el campo de visión oscuro del microscopio (microaglutinación). Para hacer un diagnóstico serológico de una enfermedad, se tiene en cuenta la enfermedad diagnóstica. Suele corresponder a una dilución de suero de 1:100 o 1:200.
Los anticuerpos en el suero sanguíneo del paciente mediante la reacción de aglutinación pueden detectarse en casos de fiebre tifoidea y fiebre paratifoidea (reacción de Vidal), brucelosis (reacción de Wright), tularemia, etc.
Reacción de Castellani. En algunas enfermedades infecciosas o inmunizaciones con microorganismos que tienen antígenos de grupo en su composición, además de anticuerpos específicos para este tipo, también aparecen anticuerpos de grupo en el suero sanguíneo. En este caso, las especies bacterianas relacionadas serán aglutinadas por los sueros resultantes.
Castellani propuso un método para la adsorción de anticuerpos de grupo a partir de sueros inmunes, basado en su eliminación con la ayuda de microorganismos de especies afines que tienen antígenos de grupo, pero carecen de específicos. El cultivo de tales microorganismos, agregado al suero, adsorbe anticuerpos de grupos no específicos, y después de la eliminación del complejo antígeno-anticuerpo por centrifugación, solo quedan en el suero inmunoglobulinas específicas. Los sueros tratados según el método de Castellani pueden utilizarse en la reacción de aglutinación como altamente específicos.
reacciones inmunitarias. El uso de las respuestas inmunes en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
PLAN:
Tipos de reacciones inmunes.
Condiciones para la realización de reacciones serológicas.
Requerimientos de suero.
El concepto de resultados positivos y negativos.
CONTENIDO PRINCIPAL:
Tipos de reacciones inmunes.
reacción inmunológica – esta es la interacción de un antígeno con un anticuerpo, que está determinada por la interacción específica de los centros activos del anticuerpo (paratopo) con epítopos de antígeno.
Clasificación general de las reacciones inmunológicas:
reacciones serológicas – reacciones entre antígenos (Ag) y anticuerpos (Ig)
in vitro ;
reacciones celulares con la participación de células inmunocompetentes;
pruebas alergicas - detección de hipersensibilidad.
Reacciones serológicas: 1) definición, 2) fases, 3) fijación de objetivos, 4) clasificación general.
1) Definición
Métodos de investigación serológica (del lat. Suero - suero y logos - enseñanza) utilizando una reacción antígeno-anticuerpo.
2) Fases
2 fases de interacción:
YO. específico (visible) - viene rápidamente, los anticuerpos se combinan con sus antígenos correspondientes. En esta fase interactúan grupos determinantes de antígenos (AG) y centros activos de anticuerpos (AT).
Las fuerzas involucradas en la formación del complejo AG + AT son:
Culombio;
Van der Waals
Enlaces de hidrógeno.
No hay cambios visibles en esta fase. Bajo microscopía electrónica, el complejo AG + AT en forma de red.
II. inespecífico - viene lentamente, el complejo antígeno-anticuerpo formado reacciona con un factor adicional no específico del entorno en el que ocurre la reacción, y esto es visible a simple vista - pegado, disolución, precipitación de escamas, etc. En presencia de un electrolito, la carga disminuye, la solubilidad disminuye, se forman conglomerados visibles precipitados (aglutinados).
3) Establecer metas :
a) para identificar el antígeno (anticuerpo conocido-suero de diagnóstico):
identificación serológica (identificación de especies);
serotipado (determinación de un serotipo) - determinación de una cepa;
en material patológico (diagnóstico express);
en cultivo puro:
b) para detectar anticuerpos (Ig) (antígeno conocido-diagnosticum):
presencia (reacciones cualitativas);
cantidad (aumento en el título - el método de "sueros emparejados").
4) Clasificación general reacciones serológicas :
a) simple (2 componentes: Ag + Ig):
reacciones de aglutinación de AR (con antígeno corpuscular);
reacciones de precipitación de RP (con antígeno soluble);
b) complejo (3 componentes: Ag + Ig + C);
c) utilizando una etiqueta.
Variantes de la reacción de aglutinación y precipitación.
Reacción de aglutinación :
La reacción de aglutinación (AR) es una reacción inmune de la interacción de una suspensión de AG (eritrocitos, bacterias) con AT en una solución fisiológica.
Durante la aglutinación, las partículas de AT se unen formando un precipitado floculento.
La reacción de hemaglutinación pasiva (RPHA) es un tipo de reacción de aglutinación en la que se utiliza un anticuerpo o diagnóstico eritrocitario antigénico (eritrocitos con AT o AG adsorbidos en su superficie).
Los eritrocitos en esta reacción actúan como portadores pasivos.
La evaluación de los resultados de la RPGA se realiza de la siguiente manera:
- a reacción positiva los eritrocitos pegados pasivamente cubren el fondo del orificio en forma de U o V con una capa uniforme con bordes festoneados ("paraguas");
- a reacción (falta de aglutinación), los eritrocitos se acumulan en el hueco central del orificio, formando un "botón" compacto con bordes bien definidos.
La prueba de inhibición de la hemaglutinación (HITA) se utiliza en el diagnóstico de infecciones virales. Algunos virus contienen la proteína hemaglutinina en su superficie, que une los glóbulos rojos. La adición de anticuerpos antivirales específicos bloquea la hemaglutinina viral; no hay hemaglutinación.
La reacción de hemaglutinación indirecta (RIHA), o reacción de Coombs, se utiliza para determinar anticuerpos incompletos. La adición de suero antiglobulina (AT contra Ig humana) potencia los resultados de la reacción. RNGA se utiliza para determinar el factor Rh.
Para configurar una reacción de aglutinación (RA), se requieren tres componentes:
1) antígeno (aglutinógeno) AG;
2) anticuerpo(aglutinina) AT;
3)
electrólito
(solución isotónica de cloruro de sodio).
Ag + AT + electrolito = aglutinado
Aglutinación (del latín agglutinatio - pegado) - pegado de corpúsculos (bacterias, eritrocitos, etc.) con anticuerpos en presencia de electrolitos - cloruro de sodio.
La AR se manifiesta en forma de escamas o sedimentos, que consisten en corpúsculos (por ejemplo, bacterias, eritrocitos), "pegados entre sí" por anticuerpos.
AR se utiliza para:
Reacción de aglutinación directa de microbios (RA).
En esta reacción, los anticuerpos (aglutininas) aglutinan directamente los antígenos corpusculares (aglutinógenos).
Por lo general, están representados por una suspensión de microorganismos inactivados (reacción de aglutinación microbiana).
utilizado para determinar el tipo de microorganismoestándar de diagnóstico aglutinante suero ( conocido en ).
Las más comunes son la AR lamelar (indicativa) y desplegada.
Lamellar RA se coloca sobre vidrio. Se utiliza como método acelerado para la detección de anticuerpos o la identificación de microorganismos.
Componentes:
1. sueros aglutinantes de diagnóstico estándar (AT);
2. probar cultivo puro del paciente;
3. solución salina.
En el cultivo puro estudiado, los antígenos (AG) se encuentran en forma de partículas (células microbianas, eritrocitos y otros antígenos corpusculares), que se unen mediante anticuerpos y precipitan.
Ejemplo:
puesta en escena indicativo reacciones de aglutinación (REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES ) sobre vidrio para identificar bacterias del grupo intestinal.
Las gotas se aplican a un portaobjetos de vidrio:
1
disentería
;
2
-ésima gota: - suero aglutinante a patógenosfiebre tifoidea
;
(1-2 sueros de diagnóstico)
3
-ésima gota: - solución salina (control).
El cultivo puro probado de bacterias se agrega a cada gota. Remover.
Resultado
:
positivo
- la presencia de escamas aglutinadas,
negativo
- sin escamas aglutinadas
Conclusión:Las bacterias estudiadas son los agentes causantes de la fiebre tifoidea (se determinaron los antígenos).
Para determinar anticuerpos en el suero del paciente (diagnóstico serológico), un estándar microbianodiagnóstico que contiene suspensiónfamoso microbios o sus antígenosAG .
Determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO (reacción de hemaglutinación (RHA)) - eritrocitos aglutinantes.
Componentes de reacción:
1. AG (glóbulos rojos) análisis de sangre
2. AT (eritrotest - tsoliclones)
Conjunto de zoliclona:
Reactivo Tsoliklon anti-A (rosa)
Reactivo Tsoliklon anti-B (azul)
Reactivo anti-AB de zoliclona (incoloro)
3. electrolito (solución salina)
Técnica de definición:
1
.
Se aplica una gota (0,1 ml) de anti-A, anti-B y anti-AB tsoliklon (para control) a los pocillos de la tableta.
2.
Se aplica una pequeña gota (0,05-0,01 ml) de la sangre de prueba junto a cada gota del reactivo.
Luego, una gota de tsoliklon se mezcla con una gota de sangre con una varilla de vidrio limpia individual.
3.
La reacción de aglutinación se desarrolla durante los primeros 3 a 5 segundos cuando la placa se balancea suavemente.
Los resultados de la reacción se tienen en cuenta 2,5 - 3 minutos después de mezclar las gotas. De izquierda a derecha en los pozos anti-A, anti-B, anti-AB.
Un resultado positivo es la aparición de un precipitado granular (aglutinado).
AR positivo (+)
Negativo - sin sedimento.
RA negativo(-)
4.
Análisis de resultados.
O(yo) α β – sin aglutinación
A(II) β – aglutinación con anti-A
B(tercero) α – aglutinación con anti-B
AB(IV)O - aglutinación con anti-A, con anti-B
Representación esquemática de la aglutinación.
Antígenos AH en eritrocitos (detectados) + anticuerpoA(tsoliclona) suero de diagnóstico
Contabilización de la aglutinación en placas
Reacción de precipitación:
La reacción de precipitación es una reacción inmune de la interacción de AG en estado soluble con AT en solución salina.
Durante la precipitación, se produce la formación de un inmunocomplejo macromolecular, que se manifiesta por la transición de una solución coloidal transparente a una suspensión opaca o precipitado.
La cantidad de ambos reactivos debe estar en proporciones estrictamente definidas, ya que un exceso de uno de ellos reduce el resultado.
Hay varias formas de configurar una reacción de precipitación.
1. La reacción de precipitación anular se coloca en tubos de precipitación de pequeño diámetro. Se agrega suero inmune al tubo de ensayo y el antígeno soluble se coloca cuidadosamente en capas. AG y AT se mezclan debido al movimiento térmico de las moléculas e interactúan. Con un resultado positivo, se forma un anillo de precipitado opaco en el límite de las dos soluciones.
2. La reacción de inmunodifusión doble de Ouchterlony se lleva a cabo en un gel de agar, en los pocillos de los cuales se agrega una solución AG o una solución AT según el esquema. AG y AT se difunden en el gel uno hacia el otro y, si la reacción es positiva, forman inmunocomplejos, visibles como líneas de precipitación.
Reacción de precipitación -esta formacióny precipitación del complejo de antígeno molecular soluble con anticuerpos en forma de turbidez, denominado precipitado. Se forma mezclando antígenos y anticuerpos en cantidades equivalentes.
Componentes de AR:
precipitar suero (conocido como AT-precipitina);
suero de prueba (AG-precipitinógeno desconocido);
físico Solución.
La reacción de precipitación se coloca en o en tubos de ensayo estrechos especiales (reacción de precipitación en anillo), o en placas de Petri en geles, medios nutritivos, etc.
Reacción de precipitación de anillo
Declaración y contabilidad de los resultados de la reacción.precipitación de anillopara detectar el agente causante del ántrax (reacción de Ascoli).
puesta en escena .
1. El material de prueba (cuero, lana, fieltro, cerdas, tela, carne, tierra, heces de animales, etc.) se hierve en solución salina durante 5 a 45 minutos. para obtener un extracto isotónico (extracto). Filtrar.
2. Vierta el suero anti-ántrax precipitante en el tubo de ensayo.
3. Cubra con cuidado el material de prueba (extracto).
Contabilidad .
Dentro de los próximos 10 min. en el límite entre el suero y el extracto, en los casos positivos, aparece un anillo de turbidez (anillo de precipitación). La reacción de Ascoli es muy sensible y específica.
Con su ayuda, es posible identificar rápidamente materiales infectados con ántrax.
Reacción de precipitación en agar
Estado y contabilidad de resultadosreacciones de precipitación en agarpara determinar la toxigenicidad de las corinebacterias (agentes causantes de la difteria)
puesta en escena
Colocado en agar fosfato-peptona en una placa de Petri.
1. Una tira de papel de filtro estéril humedecido consuero antitóxico.
2. Después del secado, a una distancia de 1 cm del borde de la tira, se siembran placas con un diámetro de 10 mm.cultivos aislados.
En una taza, puede sembrar de 3 a 10 cultivos, uno de los cuales,control, debe ser conocidotoxigénico.
Los cultivos se colocan en un termostato.
Contabilidad
El análisis se realiza después de 24-48-72 horas.
Resultado positivo - (cultivotoxigénico) - a cierta distancia de la tira de papel surgenlineas de precipitado, « flechas de zarcillo”, que son claramente visibles en luz transmitida.
La figura muestra la reacción de precipitación en agar para determinar la toxigenicidad del bacilo diftérico. Los cultivos medios no formaron "antenas de flecha", estos no son patógenos toxicogénicos.
Las cepas del agente causante de la difteria pueden ser toxigénicas (que producen exotoxina) y no toxigénicas. La formación de exotoxina depende de la presencia en bacterias de un profago portador del gen tox que codifica la formación de exotoxina.
En caso de enfermedad, se prueba la toxicidad de todos los patógenos de la difteria: la producción de exotoxina de la difteria mediante una reacción de precipitación en agar.
Reacciones serológicas complejas ( 3 componentes: Ag + Ig + C):
Reacción de fijación del complemento (RSC).
La reacción se lleva a cabo en dos etapas.
En la primera etapa, los anticuerpos interactúan con AG y complemento, en la segunda etapa, se agrega un indicador: el sistema hemolítico (una mezcla de eritrocitos y suero antieritrocítico).
Con un resultado positivo, en la primera etapa, AT forma un inmunocomplejo con AG, que se une al complemento de la mezcla de reacción.
En este caso, los eritrocitos del sistema hemolítico agregados en la segunda etapa no se destruyen.
De lo contrario, el complemento no unido provoca la lisis de los glóbulos rojos indicadores.
Requiere cinco ingredientes: AG, AT y complemento (primer sistema), eritrocitos ram y suero hemolítico (segundo sistema) (fig. 1).
La reacción procede en dos fases (Fig. 3).
Primera fase - la interacción de antígeno y anticuerpos con la participación obligatoria del complemento.
Segundo - identificación de los resultados de la reacción mediante un sistema hemolítico indicador (eritrocitos ovinos y suero hemolítico). La destrucción de los eritrocitos por el suero hemolítico ocurre solo en el caso de la unión del complemento al sistema hemolítico. Si el complemento se adsorbió antes en el complejo antígeno-anticuerpo, no se produce hemólisis de los eritrocitos (fig.).
El resultado de la experiencia
evaluar (Fig. 2), observando la presencia o ausencia de hemólisis en todos los tubos. La reacción se considera positiva con un retraso completo en la hemólisis, cuando el líquido en el tubo de ensayo es incoloro y los eritrocitos se depositan en el fondo, negativo, con lisis completa de los eritrocitos, cuando el líquido tiene un color intenso (sangre "laca") .
El grado de retraso de la hemólisis se estima en función de la intensidad del color del líquido y la cantidad de sedimento de eritrocitos en el fondo (++++, +++, ++, +).
Arroz. 4. Declaración y resultado del RSC.
Conclusión:Se detectaron anticuerpos en el suero estudiado.
RSK le permite detectar anticuerpos contra cualquier cepa del mismo serotipo de virus.
El valor de diagnóstico es:
un aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos en sueros emparejados (durante una epidemia de influenza);
un aumento del doble en el suero sanguíneo de pacientes con un cuadro clínico característico.
Etiquetar reacciones :
Estos métodos son muy sensibles. Se utilizan colorantes, isótopos radiactivos, enzimas, etc. como etiquetas para antígenos o anticuerpos.
RIF - reacción de inmunofluorescencia
La reacción de inmunofluorescencia se basa en la indicación luminosa del complejo antígeno-anticuerpo
Ensayo inmunoabsorbente ligado.
Un estudio de laboratorio moderno, durante el cual se realiza una búsqueda de anticuerpos específicos en la sangre o antígenos para enfermedades específicas para identificar no solo la etiología, sino también la etapa de la enfermedad.
Los resultados de ELISA se pueden emitir cualitativa y cuantitativamente.
Actualmente, ELISA se utiliza en las siguientes situaciones:
1) buscar anticuerpos específicos para cualquier enfermedad infecciosa;
2) búsqueda de antígenos de cualquier enfermedad (enfermedades infecciosas, venéreas);
3) estudio del estado hormonal del paciente;
4) examen de marcadores tumorales;
5) examen para la presencia de enfermedades autoinmunes.
En la figura, ELISA en fase sólida: los antígenos conocidos (a la izquierda) se adsorben en el pocillo de la placa, (a la derecha) en los pocillos de la placa se encuentran los anticuerpos conocidos.
Ventajas del método ELISA:
1) Alta especificidad y sensibilidad del método ELISA (más del 90%).
2) La capacidad de determinar la enfermedad y seguir la dinámica del proceso, es decir, comparar la cantidad de anticuerpos en diferentes intervalos de tiempo.
3) Disponibilidad de diagnósticos ELISA en cualquier institución médica.
Deficiencia relativa: Detección de una respuesta inmune (anticuerpos), pero no del patógeno en sí, conjugado con una enzima-marca.
Configuración de ELISA (mecanismo general):
La base del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas es la reacción inmunitaria de un antígeno y un anticuerpo con la formación de un complejo inmunitario: un antígeno-anticuerpo, que da como resultado un cambio en la actividad enzimática de etiquetas específicas en la superficie de los anticuerpos.
Componentes de reacción:
1. AG(AT) conocido - en el pozo de la tableta.
2. AT (AG) investigado.
3. AT con una enzima específica del complejo AT(AG)-AG(AT)
4. sustrato cromogénico que interactúa con la enzima
5. detener la solución
Las principales etapas del ELISA
1. En la superficie de los pocillos de la tableta hay un antígeno purificado de un patógeno específico. Se les añade el material biológico del paciente, se produce una reacción específica entre este antígeno y el anticuerpo deseado (inmunoglobulina). Se forma un complejo.
2. Se agrega un conjugado - AT con una enzima. El conjugante es específico del complejo AT-AG de la primera etapa. La enzima se activa.
3. Se agrega un sustrato y la enzima activa interactúa con él, cambiando el color incoloro de la solución.
4. Se agrega una solución de parada para detener la interacción enzima-sustrato.
Contabilidad.
Un resultado positivo es un cambio de color, en la figura: amarillo.
Análisis inmunocromatográfico
El método de análisis inmunocromatográfico (ICA, pruebas rápidas) es un método preliminar de detección cualitativa que le permite analizar rápidamente, en pocos minutos, en cualquier condición, incl. "campo".
Los beneficios de ICA incluyen:
Velocidad y facilidad de uso;
Volúmenes de muestra pequeños, sin preparación de muestra;
Barato para el productor y el consumidor;
Capacidad para producir pruebas en grandes volúmenes;
Facilidad de lectura e interpretación del resultado;
Alta sensibilidad y reproducibilidad;
Posibilidad de determinación cuantitativa;
La capacidad de utilizar lectores portátiles compatibles con una computadora;
Posibilidad de multianálisis.
Componentes (aplicados a la tira reactiva):
1. Conjugado marcado con oro coloidal - específico para el AG determinado.
2. AT de la línea de prueba - específico del complejo AT-AG
3. Los Abs de la línea de control son específicos del conjugado.
Ajuste IHA:
1. Aplicación de la muestra al área de inicio designada de la tira.
2. Obtención de un resultado en forma de la aparición de bandas coloreadas en lugar de las líneas de prueba y control.
Contabilidad
Positivo: al teñir la línea de prueba.
Negativo: en ausencia de tinción de la línea de prueba.
Inválido: en ausencia de tinción de la línea de control.
Mecanismo general IHA:
1. La muestra se coloca en el campo de inicio (almohadilla de muestra) y se une al conjugado (cuerpo específico con marca de color) ubicado en la almohadilla de conjugado. Como resultado, se forma un complejo coloreado.
2. El complejo inmunitario coloreado resultante se mueve bajo la acción de las fuerzas capilares a lo largo de la membrana de nitrocelulosa. y interactúacon línea de prueba AT.El resultado es una franja rosa-roja de un solo color.
3. Abs no unido a la banda de prueba (conjugado)avanza y alcanza la línea de control, se une al AT de la línea de control.Como resultado, aparece una segunda banda de color.Si el análisis se realiza correctamente, la línea Control siempre debe aparecer, independientemente de la presencia del antígeno (anticuerpo) investigado en la muestra de fluido biológico.
2. Condiciones para la realización de reacciones serológicas.
1. La presencia de homólogos - correspondientes entre sí antígeno y anticuerpo.
2. Platos limpios y secos.
3. Una cierta proporción de medicamentos (la mayoría de las veces iguales).
4. Presencia obligatoria de electrolito (solución isotónica de NaCl).
5. pH neutro o casi ligeramente alcalino.
6. Temperatura + 37 ° С o temperatura ambiente (necesariamente positiva).
7. Se lleva a cabo el control de antígenos y el control de suero (anticuerpos).
3 Requisitos de suero
El suero debe ser completamente claro sin ninguna mezcla de células.
Generalmente se obtiene en la semana 2 de la enfermedad, cuando los anticuerpos ya están presentes.
La sangre se extrae en la cantidad de 3-5 ml con el estómago vacío o 6 horas después de una comida.
Para obtener el suero, la sangre se deja durante 1 hora a temperatura ambiente o se centrifuga. El suero se aspira con mucho cuidado para no capturar los elementos formes.
Los sueros inmunes se obtienen de la sangre de personas o animales (generalmente conejos y caballos) inmunizados según un esquema determinado con el antígeno correspondiente (vacuna). El suero generalmente se prepara en producción.
4. El concepto de resultados positivos y negativos.
REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES.
Con una reacción positiva, los eritrocitos pegados pasivamente cubren el fondo del pozo con una capa uniforme con bordes festoneados ("paraguas"); en ausencia de aglutinación, los eritrocitos se acumulan en el hueco central del pocillo, formando un “botón” compacto con bordes bien definidos (véanse las figuras anteriores).
RP.
Con un resultado positivo, se forma un anillo lechoso en el límite de las dos soluciones (véanse las figuras anteriores).
ELISA.
Se produce un cambio en el color de la solución con una reacción positiva.
RSK.
Retraso de la hemólisis: la reacción es positiva; si el complemento está libre, se observa hemólisis - la reacción es negativa(ver fotos arriba).
Resultados de la reacción de Wasserman:
a - retraso completo de la hemólisis (+ + ++);
b - retraso pronunciado en la hemólisis (+ ++);
c - retraso parcial de la hemólisis (++);
d - retraso débil de la hemólisis (+);
e - hemólisis completa (-).
La reacción es positiva con un retraso parcial, pronunciado y completo en la hemólisis, determinado por el grado de tinción del contenido de los tubos de ensayo de rosa claro a rojo brillante, los eritrocitos no hemolizados forman posteriormente un precipitado rojo.
Tareas para el hogar:
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13.1. Reacciones antígeno-anticuerpo y sus usos
Cuando se inyecta un antígeno, se forman anticuerpos en el cuerpo. Los anticuerpos son complementarios al antígeno que provocó su síntesis y pueden unirse a él. La unión de antígenos a anticuerpos consta de dos fases. La primera fase es específica, en la que se produce una unión rápida del determinante antigénico al centro activo del fragmento Fab de los anticuerpos. Cabe señalar que la unión se debe a las fuerzas de van der Waals, el hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. La fuerza de unión está determinada por el grado de correspondencia espacial entre el sitio activo del anticuerpo y el epítopo del antígeno. Después de la fase específica, comienza una más lenta: no específica, que se manifiesta por un fenómeno físico visible (por ejemplo, la formación de escamas durante la aglutinación, etc.).
Las reacciones inmunitarias son interacciones entre anticuerpos y antígenos, y estas reacciones son específicas y muy sensibles. Son ampliamente utilizados en la práctica médica. Con la ayuda de reacciones inmunes, se pueden resolver las siguientes tareas:
Determinación de anticuerpos desconocidos por antígenos conocidos (diagnóstico antigénico). Tal tarea es cuando es necesario determinar anticuerpos contra el patógeno en el suero sanguíneo del paciente (serodiagnóstico). Encontrar anticuerpos le permite confirmar el diagnóstico;
Determinación de antígenos desconocidos por anticuerpos conocidos (suero diagnóstico). Este estudio se realiza al identificar el cultivo del patógeno aislado del material del paciente (serotipado), así como al detectar
antígenos de microbios y sus toxinas en sangre y otros fluidos biológicos. Hay muchos tipos de reacciones inmunitarias que difieren en la técnica de establecimiento y el efecto registrado. Estas son reacciones de aglutinación (RA), precipitación (RP), reacciones que involucran complemento (RCC), reacciones que usan componentes marcados (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reacción de aglutinación
La reacción de aglutinación (AR) es una reacción inmune de la interacción de un antígeno con anticuerpos en presencia de electrolitos, y el antígeno se encuentra en estado corpuscular (eritrocitos, bacterias, partículas de látex con antígenos adsorbidos). Durante la aglutinación, los antígenos corpusculares se unen mediante anticuerpos, lo que se manifiesta por la formación de un precipitado floculento. La formación de escamas se debe al hecho de que los anticuerpos tienen dos centros activos y los antígenos son polivalentes, es decir. tienen múltiples determinantes antigénicos. La AR se utiliza para identificar el patógeno aislado del material del paciente, así como para detectar anticuerpos contra el patógeno en el suero sanguíneo del paciente (por ejemplo, las reacciones de Wright y Huddleson en la brucelosis, la reacción de Vidal en la fiebre tifoidea y la fiebre paratifoidea). ).
La forma más fácil de configurar RA es una reacción en vidrio, esta es una RA aproximada, que se utiliza para determinar el patógeno aislado del paciente. Al colocar la reacción en un portaobjetos de vidrio, se aplica un suero aglutinante de diagnóstico (a una dilución de 1:10 o 1:20), luego se introduce un cultivo del paciente. La reacción es positiva si en la gota aparece un precipitado floculento. Se coloca un control cerca: en lugar de suero, se aplica una gota de solución de cloruro de sodio. Si el suero aglutinante de diagnóstico no se adsorbe 1, entonces se diluye (hasta el título, la dilución a la que debe ocurrir la aglutinación), es decir poner el RA expandido en tubos de ensayo con aumento
1 El suero aglutinante no adsorbido puede aglutinar bacterias relacionadas que tienen antígenos comunes (de reacción cruzada). Por lo tanto, disfrutasueros aglutinantes adsorbidos, de los cuales los anticuerpos de reactividad cruzada han sido eliminados por adsorción por sus bacterias relacionadas. En tales sueros, quedan anticuerpos específicos solo para esta bacteria.
diluciones de suero aglutinante, a las que se añaden 2-3 gotas de una suspensión del patógeno aislado del paciente. La aglutinación se tiene en cuenta por la cantidad de sedimento y el grado de clarificación del líquido en los tubos de ensayo. La reacción se considera positiva si se observa aglutinación en una dilución cercana al título del suero de diagnóstico. La reacción se acompaña de controles: el suero, diluido con solución isotónica de cloruro de sodio, debe ser transparente, la suspensión de microbios en la misma solución debe ser uniformemente turbia, sin sedimentos.
Para determinar los anticuerpos contra el patógeno en el suero sanguíneo del paciente, se usa un RA expandido. Cuando se coloca en tubos de ensayo, el suero sanguíneo del paciente se diluye y se agrega una cantidad igual de suspensión de diagnóstico (suspensión de microbios muertos) a los tubos de ensayo. Después de la incubación, se determina la dilución de suero más alta a la que se produjo la aglutinación, es decir, se formó un precipitado (título sérico). En este caso, la reacción de aglutinación con O-diagnosticum (bacterias muertas por calentamiento, reteniendo un antígeno O termoestable) ocurre en forma de aglutinación de grano fino. La reacción de aglutinación con H-diagnosticum (bacterias eliminadas por formalina, que retienen el antígeno H flagelar termolábil) es de grano grueso y avanza más rápido.
La reacción de hemaglutinación indirecta (pasiva)(RNGA o RPGA) es un tipo de RA. Este método es muy sensible. Con la ayuda de RNGA, se pueden resolver dos tareas: determinar los anticuerpos en el suero sanguíneo del paciente, al que se le agrega un diagnóstico de eritrocitos antigénicos, que son eritrocitos en los que se adsorben antígenos conocidos; determinar la presencia de antígenos en el material de prueba. En este caso, la reacción a veces se denomina reacción de hemaglutinación indirecta inversa (RONGA). Al realizar la estadificación, se agrega al material de prueba un diagnóstico de eritrocitos de anticuerpos (eritrocitos con anticuerpos adsorbidos en su superficie). Los eritrocitos en esta reacción actúan como transportadores y participan pasivamente en la formación de agregados inmunitarios. Con una reacción positiva, los eritrocitos pegados pasivamente cubren el fondo del pozo con una capa uniforme con bordes festoneados ("paraguas"); en ausencia de aglutinación, los eritrocitos se acumulan en el receso central del orificio, formando un "botón" compacto con bordes bien definidos.
Reacción de coaglutinación Se utiliza para detectar células patógenas (antígenos) utilizando anticuerpos adsorbidos en estafilococo aureus, que contiene proteína A. La proteína A tiene afinidad por el fragmento Fc de las inmunoglobulinas. Debido a esto, los anticuerpos se unen al estafilococo indirectamente a través del fragmento Fc, y los fragmentos Fab se orientan hacia afuera y pueden interactuar con los microbios correspondientes aislados de los pacientes. En este caso, se forman escamas.
Reacción de inhibición de la hemaglutinación (HITA) se utiliza en el diagnóstico de infecciones virales, y solo infecciones causadas por virus hemaglutinantes. Estos virus contienen en su superficie una proteína, la hemaglutinina, que es responsable de la reacción de hemaglutinación (RHA) cuando se agrega a los virus de los eritrocitos. La RTGA consiste en bloquear los antígenos virales con anticuerpos, por lo que los virus pierden su capacidad de aglutinar glóbulos rojos.
reacción de coombs - RA para la detección de anticuerpos incompletos. En algunas enfermedades infecciosas, como la brucelosis, en el suero sanguíneo del paciente circulan anticuerpos incompletos contra el patógeno. Los anticuerpos incompletos se denominan bloqueantes porque tienen un sitio de unión al antígeno y no dos, como los anticuerpos completos. Por lo tanto, cuando se agrega un diagnóstico antigénico, los anticuerpos incompletos se unen a los antígenos, pero no los unen. Para manifestar la reacción, se agrega suero de antiglobulina (anticuerpos contra las inmunoglobulinas humanas), lo que conducirá a la aglutinación de los complejos inmunes (diagnóstico antigénico + anticuerpos incompletos) formados en la primera etapa de la reacción.
La reacción de Coombs indirecta se usa en pacientes con hemólisis intravascular. En algunos de estos pacientes se encuentran anticuerpos anti-Rhesus monovalentes incompletos. Interactúan específicamente con los eritrocitos Rh positivos, pero no provocan su aglutinación. Por lo tanto, se agrega suero antiglobulina al sistema de anticuerpos anti-Rh + eritrocitos Rh positivos, lo que provoca la aglutinación de los eritrocitos. Mediante la reacción de Coombs se diagnostican estados patológicos asociados a la lisis intravascular de eritrocitos de origen inmunológico, por ejemplo, enfermedad hemolítica del recién nacido por conflicto Rhesus.
RA para determinación de grupos sanguíneos se basa en la aglutinación de los eritrocitos por los anticuerpos del suero inmune contra los antígenos de los grupos sanguíneos A (II), B (III). El control es suero que no contiene anticuerpos, es decir, suero de grupos sanguíneos AB (IV), y antígenos de eritrocitos de los grupos A (P) y B (III). Los eritrocitos del grupo 0(I) se utilizan como control negativo porque no tienen antígenos.
Para determinar el factor Rh se utilizan sueros anti-Rh (al menos dos series diferentes). En presencia del antígeno Rh en la membrana de los eritrocitos estudiados, se produce la aglutinación de estas células.
13.3. reacción de precipitación
La RP es una reacción inmunitaria de la interacción de anticuerpos con antígenos en presencia de electrolitos, y el antígeno se encuentra en estado soluble. Durante la precipitación, los antígenos solubles son precipitados por anticuerpos, lo que se manifiesta por turbidez en forma de bandas de precipitación. Se observa la formación de un precipitado visible cuando ambos reactivos se mezclan en proporciones equivalentes. El exceso de uno de ellos reduce la cantidad de inmunocomplejos precipitados. Hay varias formas de configurar una reacción de precipitación.
Reacción de precipitación de anillo colocados en tubos de precipitación de pequeño diámetro. El suero inmune se agrega al tubo de ensayo y el antígeno soluble se coloca cuidadosamente en capas. Con un resultado positivo, se forma un anillo lechoso en el borde de las dos soluciones. La reacción de precipitación en anillo, que determina la presencia de antígenos en órganos y tejidos, cuyos extractos se hierven y filtran, se denomina reacción de termoprecipitación (reacción de Ascoli para determinar un antígeno de ántrax termoestable).
Reacción de inmunodifusión doble de Ouchterlony. Esta reacción se lleva a cabo en un gel de agar. Los pozos se recortan en una capa de gel de espesor uniforme a cierta distancia entre sí y se llenan con antígeno y suero inmune, respectivamente. Después de eso, los antígenos y los anticuerpos se difunden en el gel, se encuentran y forman inmunocomplejos, que precipitan en el gel y se hacen visibles como líneas de precipitación.
nutrición. Esta reacción se puede utilizar para detectar antígenos o anticuerpos desconocidos, así como para comprobar la similitud entre diferentes antígenos: si los antígenos son idénticos, las líneas de precipitación se fusionan; si los antígenos no son idénticos, las líneas de precipitación se cruzan; si los antígenos son parcialmente idéntico, se forma un espolón.
Reacción de inmunodifusión radial. Los anticuerpos se agregan al gel de agar derretido y el gel se aplica en una capa uniforme sobre el portaobjetos. Se cortan pozos en el gel y se introduce en ellos un volumen estándar de soluciones de antígeno de varias concentraciones. Durante la incubación, los antígenos se difunden radialmente fuera del pozo y, al encontrar anticuerpos, forman un anillo de precipitación. Mientras haya un exceso de antígeno en el pozo, hay un aumento gradual en el diámetro del anillo de precipitación. Este método se utiliza para determinar antígenos o anticuerpos en la solución de prueba (por ejemplo, para determinar la concentración de inmunoglobulinas de diferentes clases en suero sanguíneo).
Inmunoelectroforesis. La mezcla de antígenos se separa preliminarmente por electroforesis, luego se introduce el antisuero precipitante en el surco que corre a lo largo de la dirección del movimiento de la proteína. Los antígenos y los anticuerpos se difunden en el gel uno hacia el otro; interactuando, forman líneas arqueadas de precipitación.
reacción de floculación(según Ramón) - un tipo de reacción de precipitación, que se utiliza para determinar la actividad del suero antitóxico o toxoide. La reacción se lleva a cabo en tubos de ensayo. En un tubo de ensayo donde el toxoide y la antitoxina están en proporción equivalente, se observa turbidez.
13.4. Reacción de fijación del complemento
Los anticuerpos, al interactuar con el antígeno correspondiente, se unen al complemento agregado (1er sistema). El indicador de la fijación del complemento son los eritrocitos sensibilizados por suero hemolítico, es decir, anticuerpos contra los eritrocitos (segundo sistema). Si el complemento no está fijo en el 1er sistema, es decir no se produce la reacción antígeno-anticuerpo, entonces los glóbulos rojos sensibilizados se lisan por completo (reacción negativa). Cuando el complemento se une a complejos inmunes del 1er sistema, después de la adición de eritrocitos sensibilizados, hemólisis
ausente (reacción positiva). La reacción de fijación del complemento se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas (gonorrea, sífilis, influenza, etc.).
13.5. reacción de neutralización
Los microbios y sus toxinas tienen un efecto dañino en los órganos y tejidos del cuerpo humano. Los anticuerpos pueden unirse a estos agentes dañinos y bloquearlos, es decir, neutralizar. La reacción de neutralización diagnóstica se basa en esta característica de los anticuerpos. Se lleva a cabo introduciendo una mezcla antígeno-anticuerpo en animales o en objetos de prueba sensibles (cultivo celular, embriones). Por ejemplo, para detectar toxinas en el material del paciente, a los animales del 1er grupo se les inyecta el material del paciente. A los animales del segundo grupo se les inyecta un material similar, pretratados con el antisuero apropiado. Los animales del 1er grupo mueren en presencia de toxina en el material. El segundo grupo de animales sobrevive, el efecto dañino de la toxina no se manifiesta, ya que se neutraliza.
13.6. Reacciones que utilizan anticuerpos o antígenos marcados
13.6.1. Reacción de inmunofluorescencia (RIF, método de Koons)
Este método se utiliza para diagnósticos rápidos. Puede detectar tanto antígenos microbianos como anticuerpos.
Método RIF directo- una reacción inmunológica de la interacción de anticuerpos con antígenos, y los anticuerpos se marcan con un fluorocromo - una sustancia capaz de emitir cuantos de luz de cierta longitud de onda cuando es golpeada por luz de cierta longitud de onda. La peculiaridad de configurar este método es la necesidad de eliminar los componentes que no reaccionaron para excluir la detección de luminiscencia no específica. Para ello, realice el lavado de anticuerpos sin reaccionar. Los resultados se evalúan usando un microscopio fluorescente. Las bacterias en un frotis tratado con un suero luminiscente brillan sobre un fondo oscuro a lo largo de la periferia de la célula.
Método RIF indirecto usado más que el anterior. Esta reacción se lleva a cabo en dos pasos. En la primera etapa, los antígenos se
interactúan con los anticuerpos correspondientes, formando inmunocomplejos. Todos los componentes que no hayan reaccionado (es decir, que no formen parte de los inmunocomplejos) deben eliminarse mediante lavado. En la segunda etapa, el complejo antígeno-anticuerpo formado se detecta utilizando suero de antiglobulina fluorocromo. Como resultado, se forma un complejo microbio + anticuerpos antimicrobianos de conejo + anticuerpos contra inmunoglobulinas de conejo marcadas con fluorocromo. Los resultados se evalúan usando un microscopio fluorescente.
13.6.2. inmunoensayo o ensayo
ELISA es el método moderno más común utilizado para diagnosticar infecciones virales, bacterianas y protozoarias, en particular, para diagnosticar infección por VIH, hepatitis viral, etc.
Hay muchas modificaciones de ELISA. El ELISA no competitivo en fase sólida es ampliamente utilizado. Se lleva a cabo en placas de poliestireno de 96 pocillos (fase sólida). Durante la reacción, es necesario lavar los componentes que no reaccionaron en cada etapa. Al determinar los anticuerpos, los pozos en los que se adsorben los antígenos se llenan con el suero sanguíneo en estudio, luego el suero antiglobulina marcado con la enzima. Muestre la reacción agregando un sustrato para la enzima. En presencia de la enzima, el sustrato cambia y el complejo enzima-sustrato se selecciona de tal manera que el producto formado en la reacción se colorea. Así, con una reacción positiva, se observa un cambio en el color de la solución. Para determinar los antígenos, se sensibiliza un vehículo en fase sólida con anticuerpos, luego se introducen secuencialmente el material de prueba (antígenos) y el suero antigénico marcado con enzima. Para la manifestación de la reacción, se introduce un sustrato para la enzima. Se produce un cambio en el color de la solución con una reacción positiva.
13.6.3. inmunotransferencia
Este método se basa en una combinación de electroforesis y ELISA. Al realizar inmunotransferencias (transferencia del inglés. mancha- spot) una mezcla compleja de antígenos se somete primero a electroforesis en un gel de poliacrilamida. El anti-
los péptidos génicos se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. A continuación, las transferencias se tratan con anticuerpos marcados con enzimas contra el antígeno específico, i. realizar un ELISA blot. La inmunotransferencia se utiliza en el diagnóstico de infecciones como el VIH.
13.6.4. Microscopía electrónica inmune
El método consiste en la microscopía en un microscopio electrónico de virus (raramente otros microbios), previamente tratados con un suero inmune apropiado marcado con preparaciones electrónicamente densas, por ejemplo, ferritina, una proteína que contiene hierro.
13.7. citometría de flujo
Las células sanguíneas se diferencian en función de la citofluorometría láser. Para ello, las células deseadas se tiñen con anticuerpos monoclonales fluorescentes contra antígenos CD. Una muestra de sangre después del tratamiento con anticuerpos marcados se pasa a través de un tubo delgado y se pasa un rayo láser a través de él, que excita la luminiscencia del fluorocromo. La intensidad de la fluorescencia se correlaciona con la densidad de los antígenos en la superficie celular y se puede cuantificar mediante un fotomultiplicador. Los resultados obtenidos se convierten en un histograma.
La citometría de flujo se utiliza para determinar el estado inmunitario (el contenido de las principales poblaciones de linfocitos, el contenido de citocinas intracelulares y extracelulares, la actividad funcional de las células NK, la actividad de fagocitosis, etc.).
No. 29 Reacción de aglutinación. Componentes, mecanismo, métodos de montaje. Solicitud.
Reacción de aglutinación- una reacción simple en la que los anticuerpos se unen a antígenos corpusculares (bacterias, eritrocitos u otras células, partículas insolubles con antígenos adsorbidos en ellas, así como agregados macromoleculares). Ocurre en presencia de electrolitos, por ejemplo, cuando se agrega una solución isotónica de cloruro de sodio.
Se utilizan varias variantes de la reacción de aglutinación: expandida, aproximada, indirecta, etc. La reacción de aglutinación se manifiesta por la formación de escamas o sedimentos (células "pegadas" por anticuerpos que tienen dos o más centros de unión al antígeno - Fig. 13.1) . AR se utiliza para:
1) detección de anticuerpos en el suero sanguíneo de pacientes, por ejemplo, con brucelosis (reacciones de Wright, Heddelson), fiebre tifoidea y fiebre paratifoidea (reacción de Vidal) y otras enfermedades infecciosas;
2) definiciones de patógenos aislado del paciente;
3) determinacion de grupos sanguineos usando anticuerpos monoclonales contra aloantígenos de eritrocitos.
Para determinar los anticuerpos del paciente poner una reacción de aglutinación detallada: Se agrega un diagnóstico (suspensión de microbios muertos) a las diluciones del suero sanguíneo del paciente, y después de varias horas de incubación a 37 ° C, se observa la dilución más alta del suero (título del suero), en el que se produjo la aglutinación, es decir, un precipitado formado.
La naturaleza y la tasa de aglutinación dependen del tipo de antígeno y de anticuerpos. Un ejemplo son las características de la interacción de diagnósticos (antígenos O y H) con anticuerpos específicos. La reacción de aglutinación con O-diagnosticum (bacterias muertas por calentamiento, reteniendo un antígeno O termoestable) ocurre en forma de aglutinación de grano fino. La reacción de aglutinación con H-diagnosticum (bacterias eliminadas por formalina, que retienen el antígeno H flagelar termolábil) es de grano grueso y avanza más rápido. Si es necesario determinar el patógeno aislado del paciente, poner orientación de la reacción de aglutinación, utilizando anticuerpos de diagnóstico (suero aglutinante), es decir, se realiza la serotipificación del patógeno. Se lleva a cabo una reacción aproximada en un portaobjetos de vidrio. A una gota de suero aglutinante de diagnóstico en una dilución de 1:10 o 1:20 agregar un cultivo puro del patógeno aislado del paciente. Se coloca un control cerca: en lugar de suero, se aplica una gota de solución de cloruro de sodio. Cuando aparece un sedimento floculento en una gota con suero y microbios, se realiza una reacción de aglutinación detallada en tubos de ensayo con diluciones crecientes de suero aglutinante, a las que se agregan 2-3 gotas de la suspensión del patógeno. La aglutinación se tiene en cuenta por la cantidad de sedimento y el grado de clarificación del líquido. La reacción se considera positiva si se observa aglutinación en una dilución cercana al título del suero de diagnóstico. Al mismo tiempo, se tienen en cuenta los controles: el suero diluido con una solución isotónica de cloruro de sodio debe ser transparente, una suspensión de microbios en la misma solución debe ser uniformemente turbia, sin sedimentos.
Diferentes bacterias relacionadas pueden ser aglutinadas por el mismo suero aglutinante de diagnóstico, lo que
hace que sea difícil identificarlos. Por lo tanto, se utilizan sueros aglutinantes adsorbidos, de los cuales
anticuerpos de reacción cruzada por adsorción a sus bacterias relacionadas. Estos sueros contienen anticuerpos
específico de esta bacteria.
Reacción de aglutinación
Aglutinación (lat. aglutinación- pegado) - pegado (conexión) de partículas corpusculares portadoras de antígeno (células enteras, partículas de látex, etc.) con moléculas de anticuerpos específicos en presencia de electrolitos, que termina con la formación de escamas o sedimento (aglutinado) visible para el ojo desnudo La naturaleza del sedimento depende de la naturaleza del antígeno: las bacterias flagelares dan un sedimento de escamas grandes, flagelar y sin cápsula, de grano fino, capsular, fibroso. Distingue la aglutinación directa, en la que la interacción con anticuerpos específicos involucra directamente antígenos propios de una bacteria o cualquier otra célula, como los eritrocitos; e indirecta, o pasiva, en la que las células bacterianas o los eritrocitos, o las partículas de látex no son portadoras propias, sino de antígenos (o anticuerpos) extraños adsorbidos sobre ellas para detectar anticuerpos (o antígenos) específicos para ellas. La reacción de aglutinación involucra principalmente anticuerpos pertenecientes a las clases IgG e IgM. Procede en dos fases: primero, hay una interacción específica del centro activo de anticuerpos con el antígeno determinante, esta etapa puede ocurrir en ausencia de electrolitos y no se acompaña de cambios visibles en el sistema de reacción. La segunda etapa, la formación del aglutinado, requiere la presencia de electrolitos que reduzcan la carga eléctrica de los complejos antígeno + anticuerpo y aceleren el proceso de su pegado. Esta fase termina con la formación de aglutinado.
Las reacciones de aglutinación se colocan en placas de vidrio o de cartón liso, o en tubos de aglutinación estériles. Las reacciones de aglutinación (directa y pasiva) sobre vidrio suelen utilizarse como método acelerado para la detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente (por ejemplo, en la brucelosis) o para la identificación serológica del patógeno. En este último caso, generalmente se utilizan sueros de diagnóstico bien purificados (adsorbidos), que contienen solo anticuerpos monorreceptores o su conjunto para varios antígenos. La ventaja indudable de la reacción de aglutinación sobre vidrio es la sencillez de su formulación y el hecho de que lleva varios minutos o incluso segundos, ya que ambos componentes se utilizan en forma concentrada. Sin embargo, solo tiene un valor cualitativo y es menos sensible que el tubo de ensayo. Una prueba de aglutinación expandida en tubos de ensayo brinda resultados más precisos, ya que le permite determinar el contenido cuantitativo de anticuerpos en el suero (establecer su título) y, si es necesario, registrar el hecho de un aumento en el título de anticuerpos, que es de diagnóstico valor. Para preparar la reacción, se introduce en la aglutinación suero diluido con una solución de NaCl al 0,85 % de cierta manera y un volumen igual (normalmente 0,5 ml) de una suspensión de un diagnóstico estándar (o cultivo de prueba) que contiene mil millones de bacterias en 1 ml. tubos La contabilidad de los resultados de la reacción de aglutinación se lleva a cabo preliminarmente después de 2 horas de incubación de los tubos a una temperatura de 37 ° C y finalmente después de 20-24 horas según dos signos: la presencia y el tamaño del precipitado y el grado de transparencia del sobrenadante. La evaluación se lleva a cabo de acuerdo con el sistema de cuatro cruces. La reacción va necesariamente acompañada del control de suero y antígeno. En aquellos casos en que se utilice una prueba detallada de aglutinación en probeta para la identificación serológica del patógeno, ésta tiene valor diagnóstico si la reacción se evalúa como positiva cuando el suero diagnóstico se diluye con al menos la mitad de su título.
Debe tenerse en cuenta que al mezclar soluciones de antígenos y anticuerpos homólogos, no siempre se observan manifestaciones visibles de la reacción de aglutinación. Se forma un precipitado solo en ciertas proporciones óptimas de ambos componentes de la reacción. Fuera de estos límites, con un exceso significativo de antígeno o anticuerpos, no se observa reacción. Este fenómeno se denomina "fenómeno prozona". Se observa tanto en la reacción de aglutinación como en la reacción de precipitación. La aparición de prozona en las reacciones inmunitarias se explica por el hecho de que los antígenos que participan en ellas suelen ser polideterminantes y las moléculas de anticuerpos IgG tienen dos centros activos. Con un exceso de anticuerpos, la superficie de cada partícula de antígeno se cubre con moléculas de anticuerpo para que no queden grupos determinantes libres, por lo que el segundo centro activo de anticuerpos no unido no puede interactuar con otra partícula antigénica y unirlos entre sí. La formación de un aglutinado o precipitado visible también se suprime con un exceso de antígeno, cuando no hay un solo sitio activo libre de anticuerpos y, por lo tanto, los complejos antígeno + anticuerpo + antígeno ya no pueden agrandarse.