Разрешительная документация на исследования мелких лабораторных животных. Гигиена лабораторных животных. Правила личной гигиены сотрудников вивария

Содержание животных в питомниках должно по возможности соответствовать условиям существования их в природе. Это положение особенно относится к диким, родившимся на воле животным и птицам (дикие голуби, воробьи, домашние серые мыши и крысы). В небла­гоприятных для них условиях содержания и кормления эти животные быстро погибают в неволе (особенно воробьи и серые мыши). Обязательным условием успешной работы питомника является строгое соблюдение всех ветеринарно-санитарных, зоотехнических и зоогигиенических правил. Последние предусматривают содержание животных в просторных, светлых, сухих и чистых клетках, в хорошо вентилируемых, с нормальной температу­рой помещениях, рациональное и полноценное кормление и проведение про­филактических мероприятий в целях предупреждения различных заболе­ваний. Громадное значение для питомника имеет хороший состав произво­дителей (самцов и самок).

Питомник (виварий) должен иметь несколько отделений для содержания различных видов животных (кролики, морские свинки, мыши и т. д.). В структуру вивария входят:

1. отделение для карантинирования и адаптации вновь поступивших животных;

2. экспериментально-биологическая клиника для содер­жания животных, находящихся в опыте;

3. изоляторы для подозрительных на инфекционные заболевания и заведомо больных животных, уничтожение которых по условиям эксперимента нежелательно;

4. экспериментальное помещение (или манипуляционная), в котором осуществляются взвешивание, термометрия, заражение, вакцинация животных, взятие у них крови и не­которые другие процедуры.

Оборудование экспериментального помещения определяется в каждом конкретном случае задачами и условиями проводимых научных исследований.

Карантинное отделение, отделение для подопытных и изо­лятор для инфицированных животных размещаются в поме­щениях, строго изолированных одно от другого и от всех остальных помещений вивария.

Кроме основных перечисленных выше структурных еди­ниц, в составе вивария должны находиться:

а) кормокух­ня из двух смежных помещений для переработки и изго­товления кормов с самостоятельными выходами в коридор из каждого помещения, кладовая со специально оборудован­ными ларями (металлическими или обитыми внутри жестью) и холодильниками для хранения запаса кормов,

б) дезинфек­ционно-моечное отделение из 2 комнат, объединенных пере­ходным автоклавом или сухожаровой камерой.

Работа дезинфекционно-моечного отделения определяется состоянием материала, поступающего на обработку. Инфи­цированный материал, например клетки, подстилки, кор­мушки, вначале дезинфицируют, а затем подвергают механи­ческой чистке и мойке. Материал, не представляющий опас­ности для заражения, вначале подлежит механической очист­ке, а затем (при необходимости) стерилизации.

Моечное помещение в правильно организованном вива­рии имеет мусоропровод для удаления нечистот и грузоподъ­емник для доставки в виварий материала и оборудования.

Рядом с дезинфекционно-моечным отделением размеща­ются склад чистого (запасного) инвентаря с клетками, поил­ками, кормушками и т. п., бытовые помещения и санитарный блок (душевая и туалет) для обслуживающего персонала.

В соответствии с существующими санитарными правила­ми, виварий размещается в отдельно расположенном здании или на верхнем этаже лабораторного корпуса. При размеще­нии вивария в лабораторном корпусе он должен быть полно­стью изолирован от всех других помещений.

Глава 13. ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ПЕРЕСЫЛКИ ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

(Извлечение из Правил Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР, утвержденных 24 июня 1971г.)

При необходимости определить или подтвердить причину заболевания или гибели животных (включая птиц, зверей, пчел, рыб), при подозрении на инфекционную или инвазионную болезнь или на отравление ветеринарный врач (фельдшер) обязан взять соответствующий патологический материал и направить его в ветеринарную лабораторию для исследования.

Во всех случаях взятия и пересылки материала специалист обязан руководствоваться изложенными ниже правилами, а также соответствующими инструкциями по борьбе с болезнями животных.

Взятие и пересылка патологического материала для бактериологического и вирусологического исследования. Патологический материал берут стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого будут брать патологический материал, на месте разреза обжигают над пламенем или прижигают нагретой металлической пластинкой.

Патологический материал берут как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года. При начавшемся разложении материал для исследования негоден.

В лабораторию материал отправляют в неконсервированном виде. Если доставить в лабораторию в течение ближайших 24-30 ч материал невозможно, то его консервируют.

Для бактериологического исследования патологический материал (органы или их части) консервируют в 30%-ном водном растворе химически чистого глицерина. Воду предварительно стерилизуют кипячением или автоклавированием в течение 30 мин. В качестве консерванта можно применять также стерильное вазелиновое масло. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, в 4-5 раз превышающем его объем.

Материал, предназначенный для вирусологического исследования, консервируют в 30-50%-ном растворе химически чистого глицерина на физиологическом растворе поваренной соли. Физиологический раствор предварительно стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30 мин.

Небольшие трупы животных (поросята, ягнята, телята), а также трупы мелких животных посылают целыми в непроницаемой таре.

Трубчатые кости направляют целыми с неповрежденными концами. Предварительно их тщательно очищают от мышц и сухожилий и завертывают в марлю или полотно, смоченные дезинфицирующей жидкостью (5%-ный раствор карболовой кислоты). Кости можно также посыпать натрия хлоридом (поваренной солью) и завернуть в полотно или марлю.

Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от содержимого, а концы его перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями. Помещают в банки с 30-40%-ным водным раствором глицерина или насыщенным водным раствором натрия хлорида. Объем консервирующей жидкости должен в 5-7 раз повышать объем взятого материала.

Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках или банках, которые закрывают пергаментной бумагой. От трупов животных кал можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов. В лабораторию кал должен быть доставлен не позднее 24 ч после взятия.

При посылке для исследования участков кожи берут наиболее пораженные части ее размером 10 х 10 см и кладут в стерильную, герметически закрывающуюся посуду.

Кровь, гной, слизь, мочу, желчь и другой жидкий патологический материал для бактериологического и вирусологического исследований посылают в запаянных пастеровских пипетках, стерильных пробирках или во флаконах, плотно закрытых стерильными резиновыми пробками.

Предметные стекла кипятят в течение 10-15 мин в 1-2%-ном водном растворе соды, затем тщательно промывают чистой водой, насухо вытирают и помещают в раствор спирта и эфира, взятых в равных частях, где и хранят до употребления.

Кровь берут из вены ушной раковины или края верхушки уха, у птиц - с поверхности гребня или из подкрыльцовой вены. Шерсть на месте взятия крови выстригают, кожу протирают ватными тампонами, смоченными сначала спиртом и затем эфиром. Инструменты (иглы, скальпель) должны быть стерильными.

Первую каплю крови удаляют стерильной ватой (исключение делается при исследовании крови на пироплазмидозы, когда для мазка берут первую каплю крови), а следующую свободно выступившую каплю берут на предварительно подготовленное предметное стекло быстрым и легким прикосновением к капле поверхностью стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают между пальцами левой руки в горизонтальном положении. К левому краю капли прикасаются под углом 45° шлифованным краем другого предметного (или покровного) стекла. Как только капля равномерно распределится по ребру этого стекла, его быстро проводят по поверхности предметного стекла слева направо, не доводя до края на 0,5-1 см. Ширина мазков должна быть уже предметного стекла. Для каждого нового мазка берут свежую каплю крови.

Готовые мазки крови высушивают только на воздухе. В холодное время года мазки делают в теплом помещении или на стеклах, подогретых на крышке теплого стерилизатора.

Метод фиксации мазков зависит от цели исследования.

Правильно приготовленные мазки крови должны быть тонкими, равномерными и достаточной длины. На высушенных мазках и отпечатках острым предметом делают надпись с указанием номера или клички животного и даты приготовления мазка.

Мазки из тканей, гноя, органов и различных выделений готовят путем размазывания материала на предметном стекле стерильной палочкой или ребром другого предметного стекла до тонкого слоя. Частицы органов плотной консистенции, твердые узелки, а также вязкий материал заключают между двумя предметными стеклами и растирают. Затем стекла разъединяют, растаскивая их в противоположные стороны в горизонтальном направлении. Получаются два довольно тонких мазка. Иногда делают препараты-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков.

Взятие материала для патологогистологического исследования. Материал берут от свежих трупов или убитых животных не позднее 12, а летом - 2-3 ч после смерти от тех органов или тканей, где обнаружены патологические изменения, а также из главнейших паренхиматозных органов. Из разных участков патологически измененных органов (тканей) вырезают небольшие тонкие (не более 1- 2 см толщиной) кусочки. Вместе с пораженными участками ткани захватывают и граничащую с ней нормальную ткань. При иссечении кусочка учитывают микроскопическое строение (структуру) того или иного органа (ткани). Так, кусочки из почки, надпочечника, лимфатического узла берут с таким расчетом, чтобы попадали оба слоя - корковый и мозговой; из головного мозга - серое и белое вещество; из селезенки - белую и красную пульпу; из легкого - части органа с бронхами и плеврой. Из сердца берут несколько кусочков: из мышцы правого и левого желудочков, правого и левого предсердий, папиллярных мышц и области клапанов. Из всех органов при иссечении захватывают и их капсулу. Из разных отделов желудочно-кишечного тракта вырезают небольшие кусочки размером 2 х 3 см и перед погружением в фиксирующую жидкость их растягивают на картон и прошивают белыми нитками.

Взятый материал помещают в фиксирующую жидкость (10%-ный водный раствор нейтрального формалина), объем которой в 4-5 раз превышает объем взятого материала. В холодное время года во избежание промерзания при пересылке материал, профилированный в формалине, перекладывают в 30-50%-ный раствор глицерина (приготовленный на 10%-ном растворе формалина), в 70%-ный спирт или в насыщенный раствор натрия хлорида.

Если формалина нет, то в качестве фиксирующей жидкости используют 96%-ный этиловый спирт или ацетон. При применении спирта толщина кусочков не должна превышать 0,5 см. Для гистохимических исследований патологический материал можно фиксировать также в жидкости Карнуа (спирт абсолютный - 60 мл, хлороформ - 30 мл и ледяная уксусная кислота - 10 мл) или в жидкости Буэна (концентрированная пикриновая кислота - 15 мл, формалин - 5 мл, ледяная уксусная кислота - 1 мл). Фиксирующую жидкость меняют каждые сутки до тех пор, пока она не станет прозрачной. Оптимальная температура фиксации 37 °С.

Патологический материал фиксируют в стеклянной или в крайнем случае в глиняной посуде.

На банку с кусочками органов и тканей наклеивают этикетку, на которой указывают номер или кличку животного и кому принадлежит, а внутрь ее опускают кусочек плотной бумаги или картона с написанным на нем простым (не химическим) карандашом номером животного.

Помещать в посуду несколько объектов исследования от разных животных можно только при том условии, если каждый из них завязывают в марлю вместе с отдельной этикеткой.

Упаковка и пересылка патологического материала. Трупы мелких животных, части трупов крупных животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным. Посылаемый материал, особенно от животных, подозрительных по заболеванию инфекционной болезнью, тщательно упаковывают в плотный деревянный или металлический ящик, чтобы предупредить возможность рассеивания возбудителя инфекции в пути. Перед упаковкой материал завертывают в холст или мешковину, смоченную дезинфицирующим раствором (фенольным креолином, лизолом, известковым молоком), обертывают целлофаном или полиэтиленовой пленкой и кладут в ящик со стружками, мякиной или опилками.

Части органов, жидкости, отправляемые в лабораторию почтой в фиксированном или консервированном виде, помещают в герметически закупоренную стеклянную посуду с притертой стеклянной, пластмассовой, резиновой или корковой пробкой. Пробку закрепляют проволокой или бечевкой и заливают менделеевской замазкой (сургучом, смолкой, парафином или воском), чтобы укупорка была непроницаемой для жидкости. Укупоренную посуду вкладывают в прочно сбитый ящик, плотно обкладывают ватой, паклей, стружками, опилками или другим упаковочным материалом.

При пересылке почтой или с нарочным патологического материала от животных, подозрительных по заболеванию инфекционной болезнью, или явно инфицированного материала упаковка должна гарантировать доставку материала в целости и исключить возможность рассеивания возбудителей инфекции. На лицевой стороне посылки вверху должны быть надписи: «Осторожно - стекло» и «Верх».

Стеклянную посуду, в которой заключен посылаемый материал с подозрением на наличие особо опасных болезней (сап, сибирская язва, эмфизематозный карбункул, бруцеллез, туляремия, перипневмония крупного рогатого скота, чума крупного рогатого скота, чума свиней, псевдочума птиц, ящур, бешенство), обязательно упаковывают в металлическую коробку, которую запаивают, пломбируют или опечатывают, а затем упаковывают еще в деревянный ящик.

Если такой материал отправляют с нарочным, его кладут в стеклянную посуду, герметически закупоривают и помещают в деревянный ящик.

Взятие и отправка патологического материала при подозрении на отравление. Подозрение на отравление могут вызвать следующие признаки:

а) характерный запах содержимого желудка (горькоминдальный, чесночно-хлороформенный и т. п. при исключении запаха примененных лекарств);

б) окраска содержимого желудка: желтая (от азотной и пикриновой кислот, солей хрома), зеленая, синяя (от солей меди) или иного цвета;

в) кровянистое содержимое желудка;

г) подозрительные включения в содержимом желудка - белые кристаллы сулемы и стрихнина, нерастворившиеся белые кристаллы мышьяка;

д) набухшие, увеличенные, дряблые, легко разрывающиеся серо-желтой окраски и т. п. слизистая оболочка желудка, почки, сердце;

е) поражения начальных отделов пищеварительного тракта (ротовой полости, пищевода, желудка);

ж) изменение цвета и консистенции крови.

При подозрении на отравление в лабораторию направляют материал от трупов павших животных для химического и гистологического исследований. Одновременно с целью определения источника отравления посылают все корма (по 1 кг корма каждого вида), которые скармливали животным. Обязательно посылают остатки кормов из кормушки.

Для химического исследования в лабораторию посылают в отдельных банках следующий материал:

а) часть пищевода и пораженную часть желудка с содержимым (в количестве 0,5 кг), а от крупного и мелкого рогатого скота и верблюдов - часть пищевода, сычуга и небольшое количество содержимого из разных мест сычуга, рубца.

Желудок и его содержимое берут в следующем порядке.

При вскрытии трупа после осмотра внутренних органов перевязывают лигатурами пищевод и двенадцатиперстную кишку вблизи стенки желудка (по две лигатуры) и перерезают между ними. Желудок извлекают и кладут в кюветы, а затем вскрывают. Содержимое желудка предварительно (не выбирая из желудка) перемешивают (нельзя использовать металлические предметы), после чего осторожно, чтобы не загрязнить, берут часть его;

б) отрезок тонкого кишечника (длиной до 40 см) в наиболее пораженной части вместе с содержимым (до 0,5 кг);

в) отрезок толстого кишечника ^длиной до 40 см) в наиболее пораженной части вместе с содержимым (до 0,5 кг);

г) часть печени (0,5-1 кг) с желчным пузырем (от крупных животных), печень целиком (от мелких животных);

е) мочу в количестве 0,5 л;

ж) скелетную мускулатуру в количестве 0,5 кг.

Кроме того, в зависимости от особенностей предполагаемого отравления дополнительно посылают:

а) при подозрении на отравление через кожу (путем инъекции) - часть кожи, клетчатки и мышцы из места предполагаемого введения яда;

б) при подозрении на отравление газами (сероуглеродом и т. д.) - наиболее полнокровную часть легкого (в количестве 0,5 кг), трахею, часть сердца, 200 мл крови, часть селезенки и головного мозга. От мелких животных (в т<9к числе и от птиц) берут органы целиком.

При вскрытии отрытого из земли трупа животного берут: сохранившиеся внутренние органы в количестве до 1 кг; скелетную мускулатуру в количестве 1 кг, землю под трупом 0,5 кг из двух-трех мест.

Для гистологического исследования посылают небольшие кусочки, размером 1 х 3 х 5 см, следующих органов: печени; почек (обязательно с наличием коркового и мозгового слоев); сердца; легкого; селезенки; языка; пищевода; желудка; тонкого и толстого кишечника; скелетной мускулатуры; лимфоузлов; головного мозга (половину мозга в стерильной банке).

Кусочки берут из пораженных участков органов и на границе с ними из непораженной части ткани и помещают в 10%-ный раствор формалина (из расчета на 1 часть патологического материала 10 частей раствора формалина).

При подозрении на отравление веществами, употребляемыми для борьбы с сельскохозяйственными вредителями, минеральными удобрениями, красками, посылают пробы их в количестве от 100 до 1000 г.

От больных животных при подозрении на отравление посылают: рвотные массы, желательно первые порции; мочу (все количество, которое удалось получить); кал в количестве 0,5 кг; содержимое желудка, полученное через пищеводный зонд; корма и вещества, которые могли явиться причиной отравления.

Если заподозрено, что отравление наступило вследствие поедания ядовитых растений, берут для ботанического анализа пробы растений. Для этого деревянную рамку с внутренним размером в 1 м2 накладывают на травостой луга или пастбища в местах выпаса скота. Все оказавшиеся внутри рамки растения срезают под корень. Если травостой однотипный, пробу с 1 га луга или пастбища берут в 3-5 местах, при разнотипном травостое количество проб увеличивают с целью большего охвата различных растений и посылают среднюю пробу.

Если пробу трав", взятых для исследования, можно доставить в лабораторию в течение нескольких часов, траву посылают в сыром виде. В противном случае пробы сушат и доставляют сухими. Пересылают пробы трав в коробках или плетеных корзинах.

Пробы берет ветеринарный специалист или зоотехник.

Материал, взятый для химического исследования, нельзя обмывать и держать вместе с металлическими предметами; его отправляют в чистом, неконсервированном виде. Материал животного происхождения консервируют только в том случае, если он будет доставлен в лабораторию не ранее чем через 3-4 дня после взятия. Для консервирования материала применяют спирт-ректификат в соотношении 1 часть спирта на 2 части материала. Одновременно посылают и пробу спирта (не менее 50 г), которым консервирован материал.

Применять два консервирующих вещества нельзя, так как они сами являются ядами (хлороформ) или разрушают некоторые яды (формалин).

Упаковывают материал в чистые широкогорлые стеклянные или глиняные банки, плотно закрывающиеся стеклянными притертыми пробками, а если таких нет, чистыми, не бывшими в употреблении корковыми пробками или чистой писчей или вощеной бумагой.

Поверх пробки банку обертывают чистой бумагой, обвязывают тонким шпагатом (или толстой крепкой ниткой), концы которого скрепляют сургучной печатью.

На каждую банку наклеивают этикетку, на которой чернилами записывают, какие органы и в каком количестве (по массе) помещены в банку, вид и кличку животного, даты падежа и вскрытия трупа животного, указывают, какое подозревается отравление и кому принадлежит животное.

Взятый материал отправляют в лабораторию немедленно с нарочным.

Порядок оформления и отправки сопроводительных документов к материалу, направляемому на исследование. На каждый отправляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ по форме, согласно приложению № 1 настоящих правил.

Сопроводительное письмо посылают в запечатанном конверте (одновременно с материалом) почтой или с нарочным.

В сопроводительном письме указывают: вид, пол и возраст животного, от которого взят материал для исследования, его номер или кличку, сколько банок с материалом, на какое исследование посылается материал, краткое описание клинических признаков и патологоанатомических изменений.

При посылке образцов корма указывают его название, дату взятия образца, с какого угодья. Если корм получен с завода или заготовительного пункта, указывают, с какого именно.

При необходимости к письму полагают дополнительные сведения, в частности, какая помощь оказана животному, какие лекарственные средства применялись, с какого времени скармливали корм животным и т. д. При отправке материал к из рыбохозяйственного водоема указывают клинико-эпизоотологические данные.

К сопроводительному письму на пробы (мазки) крови, направляемые в плановом порядке для серологического или гематологического исследования, прилагают опись проб в двух экземплярах.

Форма сопроводительного документа к патологическому материалу

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ



В методических рекомендациях проанализированы возможности использования различных видов лабораторных животных в токсикологических экспериментах, представлены основные типы токсикологических исследований и способы введения химических веществ при их осуществлении; приведены варианты моделирования алкогольной интоксикации; обоснованы принципы моделирования комбинированного воздействия хронической алкогольной интоксикации и алиментарной недостаточности.


Методическое пособие составлено,

К.В. Шелыгиным, д.б.н.

И.А. Кирпич, доц.

В.Я. Леонтьевым, проф.

А.Г. Соловьевым.

под редакцией проф., академика РАМН П.И. Сидорова.


Рецензент: зав. кафедрой биологии и экологи человека и животных Поморского государственного университета им. Ломоносова, д.б.н., проф. В.А. Барашков


1. Моделирование острых и хронических токсических эффектов– важное направление клинической токсикологии

2. Основные лабораторные животные, используемые в токсикологических исследованиях

2.1 Грызуны

2.3. Крупные млекопитающие

3. Острые, подострые и хронические эксперименты в токсикологии

4. Способы введения токсических веществ

5. Моделирование острой и хронической алкогольной интоксикации

6. Моделирование комбинированного воздействия хронической алкогольной интоксикации и алиментарной недостаточности

Литература


1. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ТОКСИЧЕСКИХ

ЭФФЕКТОВ – ВАЖНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ КЛИНИЧЕСКОЙ ТОКСИКОЛОГИИ


Одно из основных направлений современной токсикологии напрямую связано с исследованием патологических изменений организма при острых и хронических токсических воздействиях.

Большую помощь в изучении механизмов развития морфофункциональных осложнений острой и хронической интоксикации могут оказать эксперименты на лабораторных животных, поскольку прямые исследования не всегда возможны, а порой и этически недопустимы. Разумеется, экстраполяция экспериментальных данных на патологию человека в рамках развития положений клинической токсикологии требует определенной осторожности ввиду известных особенностей протекания метаболических процессов у животных, функциональных характеристик их внутренних органов, а подчас и существенных отличий в строении организма. Тем не менее, опыты на животных позволяют проследить динамику патологических изменений в органах и составить представление о развитии патологических процессов на системном, органном, клеточном и субклеточном уровнях, что является необходимым условием для разработки эффективных методов профилактики и лечения отравлений различной этиологии.

При проведении эксперимента необходимо руководствоваться принципами гуманного отношения к животным в соответствии с Международными рекомендациями (1993), а так же с соблюдением биоэтических норм и требований Международного комитета по науке (1978).

В соответствии с диффиренцированными задачами моделирования эффектов токсического воздействия химических соединений эксперименты могут проводиться на различных лабораторных животных, наиболее распространенными видами среди которых в токсикологических исследованиях являются грызуны, птицы и крупные млекопитающие.


2. ОСНОВНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ,

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ


2.1. Грызуны.

При моделировании токсических эффектов химических веществ наиболее часто используются грызуны (мыши, крысы, морские свинки, кролики).

Белые лабораторные мыши, являющиеся альбиносами домашней серой мыши, используются для определения токсичности химических веществ, стандартизации фармакологических препаратов.

Морские свинки являются классическим объектом для изучения аллергогенности химических веществ, а так же проявлений авитаминозов. Изолированные органы этих животных применяются в фармакологических исследованиях.

Кролики в связи с особенностями протекания у них овуляторного цикла и высокой скоростью размножения удобны для выявления воздействия токсических веществ на репродуктивные функции.

Лабораторные крысы (альбиносы черной и серой крыс) являются наиболее распространенным видом экспериментальных животных для разработки моделей последствий острых и хронических интоксикации. В настоящее время выведено более 100 отдельных аутобредных стоков и инбредных линий лабораторных крыс. Наиболее часто при токсикологических исследованиях используются крысы стоков Wistar, Bio Breeding Sprague-Dawley, C57BL, CFI, C3H и др. Отдельно выделяют конвенциональных (беспородных) животных, микрофлора которых полностью или частично неизвестна.

Удобство использования крыс для исследования токсических эффектов химических и биологических препаратов объясняется простотой их содержания, возможностью размещения на сравнительно небольшой территории достаточного количества животных, небольшим весом, устойчивостью к инфекционным заболеваниям, большим приплодом, который они дают. Крыс легко фиксировать рукой; постоянная заполненность желудка пищей при обычном режиме питания позволяет вводить им интрагастрально достаточные дозы токсических агентов, не вызывая катаральных изменений слизистой. Предпочтение в токсикологических исследованиях отдается самцам, так как они не имеют гормональных колебаний, способных оказывать влияние на мембранотропное действие ядов; целесообразнее использование молодых животных, поскольку у них меньше толерантность к различным токсическим веществам.


Наиболее часто при проведении токсикологических экспериментов используются куры, утки, гуси, индейки. Отдельно выделяют птиц - свободных от специфических патогенных микроорганизмов (specific pathogen free - SPF).

Птицы являются удобной моделью для проведения исследований влияния химических веществ на метаболические процессы, поскольку они протекают более интенсивно и быстрее, чем у других животных. Однако, при проведении исследований необходимо учитывать некоторые анатомо-физиологические особенности строения организма птиц. Так, например, у последних нет потовых и сальных желез, а так же мочевого пузыря, что имеет существенное значение для определения клиренса выведения токсических агентов и их метаболитов. Состав крови и мочи птиц существенно отличается от соответствующих физиологических показателей других животных. В отличие от млекопитающих птицы имеют особенности в строении желудочно-кишечного тракта, у них по-другому протекают процессы переваривания корма. В исследованиях на птицах удовлетворительным критерием является изменение массы тела.

При исследовании влияния токсических веществ на поведенческую активность необходимо учитывать, что реактивность птиц зависит от принадлежности их к яйценоской или мясной направленности, а также от степени их продуктивности.

При недостаточном освещении птицы не подходят к кормушкам и поилкам, поэтому, если по условиям эксперимента необходимо повысить потребление корма или жидкости, которые содержат токсическое вещество, используется искусственное освещение. Содержать птиц при проведении эксперимента рекомендуется группами, поскольку в этом случае они достигают большей массы и более резистентны к инфекциям.


2.3. Крупные млекопитающие.

Проведение токсикологических исследований на крупных млекопитающих (собаках, кошках, обезьянах) обусловлено наибольшей схожестью строения и функционирования их внутренних органов и систем, а также метаболических процессов с таковыми у человека.

Обезьяны, несмотря на сложность их содержания, используются в токсикологической практике при изучении влияния химических веществ на функции центральной нервной системы.

Кошки, как объект исследования чаще всего применяются в острых токсикологических экспериментах. Кроме того, их изолированные органы задействуют в целях выявления физиологических изменений при действии химических веществ.

Одним из часто используемых в клинической токсикологии крупных млекопитающих животных являются собаки. Для проведения токсикологических экспериментов наиболее пригодными считаются беспородные короткошерстные собаки со средней массой тела 10-15 кг, поскольку чистопородные и линейные животные более прихотливы в содержании и гораздо нестойки в хронических опытах. Оптимальный возраст животных 1,5-5 лет. Известно, что основные морфофункциональные изменения у собак при проведении токсикологических исследований во многом соответствуют таковым у человека.

В условиях проведения эксперимента необходимо учитывать, что собаки являются стайными животными с развитой иерархической системой, половыми и индивидуальными различиями темперамента, поэтому рекомендуется одиночное размещение собак в отдельных боксах. Собаки достаточно легко обучаются, что можно использовать при проведении некоторых процедур, ограничивая применение средств фиксации.

Кормление животных осуществляется согласно разработанным рационам и с учетом задач эксперимента. Однако, необходимо помнить, что желудочно-кишечный тракт собак не приспособлен к перевариванию большого количества растительной пищи.


3. ОСТРЫЕ, ПОДОСТРЫЕ И ХРОНИЧЕСКИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ В ТОКСИКОЛОГИИ


Выбор продолжительности эксперимента при изучении токсических свойств изучаемых веществ определяется целями исследования (таблица 1).

Острый токсикологический эксперимент используется для моделирования острой токсичности вещества, проявляющейся после его однократного или повторного введения через короткие (не более 6 часов) интервалы в течение суток. Целями изучения острой токсичности являются определение безвредных, токсических, летальных доз вещества, его способности к кумуляции, а также причин гибели животных.

Подострый эксперимент проводится для определения допустимых условий воздействия, оптимальных суточных доз, для выбора доз в хроническом эксперименте.

Исследование токсических свойств веществ в субхроническом и хроническом экспериментах осуществляется с целью установления степени их повреждающего действия при длительном введении, определения уровня обратимости вызываемых ими повреждений, а так же выявления наиболее чувствительных к токсическому действию органов и систем организма.


Таблица 1

Продолжительность и цели токсикологического эксперимента

Характер эксперимента

Продолжительность

Цели эксперимента

Однократное введение;

Определение смертельных доз, среднего времени гибели, порога острого действия

химических веществ

Подострый

2-8 недель

Определение кумуляции, аллергического действия, влияния на репродуктивную функцию химических веществ

Субхронический

13-18 недель

Определение пороговой дозы общетоксического действия при установлении ПДК веществ в воздухе

Хронический

6-12 месяцев

Определение пороговой дозы общетоксического действия при установлении ПДК веществ в воде и пище

Пожизненный

от 1 года и более

Определение пороговой дозы общетоксического действия химических веществ

4. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ


Для формирования характерных токсически обусловленных патологических изменений у животных используются добровольные, полудобровольные и принудительные способы введения токсических веществ.

На добровольный выбор животными потребляемых жидкостей или сухих кормов влияют индивидуальная чувствительность, скорость метаболизма вещества, порода, возраст, условия содержания, наличие дополнительных стрессорных факторов, концентрация раствора, наличие пищевых добавок и т.д. Данный способ не может обеспечить достаточно высоких и стабильных доз поступления токсических веществ в организм, поэтому более эффективными являются модели полудобровольного и принудительного введения.

При полудобровольном способе животные имеют возможность самостоятельно регулировать количество потребляемого вещества. К ним, в частности, относится методика предоставления раствора исследуемого вещества в качестве единственного источника жидкости.

Способы принудительного введения позволяют обеспечить массивную токсическую нагрузку, что обусловливает высокую концентрацию агента в крови и приводит к быстрому развитию патологических изменений.

При изучении токсически обусловленной патологии особое значение придается способам, характеризующимся моделированием тех концентраций токсических веществ, которые встречаются в реальных условиях. Этим параметрам, например, соответствует способ интрагастрального введения этанола, при котором средние дозы спирта, получаемые животными на протяжении эксперимента, составляют, обычно, 4-10 г/кг в сутки.

Ингаляционный метод введения веществ позволяет создавать практически любые токсические нагрузки. В то же время, принудительная продувка токсических веществ через затравочную камеру требует значительного расхода химических ингредиентов, а постоянную их концентрацию создать, практически, невозможно. Существующий способ разлива химического вещества в камере, где находятся животные, более пригоден для моделирования острых отравлений, однако, при данном способе невозможен количественный токсикологический контроль в условиях работы с несколькими веществами одновременно.

Наиболее рациональным при использовании способа ингаляционного введения, является тот, при котором для принудительной продувки через затравочную камеру используется только чистый воздух. Исследуемые вещества при этом расположены внутри камеры в небольших сосудах, площадь открытого участка которых подбирается расчетным образом. Заменяя сосуды на более узкие или широкие, можно варьировать скорость испарения химических соединений, количество которых берется с таким учетом, чтобы по окончанию затравки какое-то содержимое их осталось в сосудах. Данный способ прост в применении, обладает высокой чувствительностью, позволяет точно создавать постоянную концентрацию, значительно экономить используемые химические вещества.

Выбор концентраций и доз химического соединения решается с учетом целей эксперимента и физиологических особенностей подопытных животных. Необходимо помнить, что количество вводимых растворов ограничивается рамками физиологических возможностей, массой и возрастом животных. Так, максимальные объемы введения у крыс составляют интраназально до 0,4 мл, ректально – 1 мл, внутрикожно – 0,04 мл, подкожно – 10 мл, внутримышечно и внутрибрюшинно – до 5 мл, внутривенно – 6 мл, внутрисердечно – 1 мл, субокципитально – 0,15 мл, интрагастрально при весе тела 100-190 г – 3 мл, 200-290 г – 4-5 мл, 250-300 г – 6 мл, 300 г и более – 8 мл. Максимальные объемы веществ у собак составляют при интраназальном введении – 4 мл, подкожном – 20 мл, внутримышечном – 12 мл, внутрибрюшинном – 20 мл.

В то же время, введение веществ животным производится с учетом особенностей их анатомии, а так же формы исследуемого вещества. Например, порошкообразные - вводятся крысам перорально, путем приготовления пилюль из данного вещества и муки, хлеба или его добавления к воде или корму.

Введение растворов веществ осуществляется перорально с помощью резинового или металлического зонда, интраназально с помощью мочевого катетера, ректально. Кожное введение подразумевает предварительное удаление волосяного покрова, выполнение насечек, после чего наносят исследуемое вещество. Внутрикожные инъекции осуществляют в задней части спины или на животе, предварительно так же удалив волосяной покров. Подкожные инъекции делают на шее, спине или животе. Внутримышечно вещества вводят в заднебедренные мышцы. Внутрибрюшинные инъекции выполняют в левый нижний квадрант брюшной полости. Внутривенно вещества вводят в хвостовую вену или в дорсальную вену полового члена. Введение веществ также возможно непосредственно в сердце, либо субокципитально предварительно анестезированной крысы.

Введение токсических веществ птицам осуществляется интрагастрально при помощи зонда, внутривенно в локтевую или плечевую вену крыла, внутрибрюшинно в правый нижний квадрант брюшной полости, подкожно через кожу на животе или внутримышечно через четырехглавую мышцу бедра.

Введение исследуемых веществ собакам выполняется путем их подмешивания к корму, питьевой воде, либо принудительно, когда вещество в виде таблетки кладется на спинку языка животного. Жидкие вещества, а так же растворы вводят при помощи ложки или спринцовки, однако более удобно использовать желудочный зонд. Кроме того, введение жидких веществ возможно интраназально с помощью катетера, ректально, подкожно в области спины, бедра или затылка, внутрикожно, накожно, внутримышечно – в мышцы бедра, внутривенно – в вены голени, стопы, предплечья, внутрибрюшинно. Существуют способы субокципитального, внутримозгового и внутрисердечного введения веществ, однако, их выполнение сопряжено с техническими трудностями и подвергает повышенной угрозе жизнь животного.

Для снижения трудностей, возникающих при экспериментальном изучении токсических свойств веществ, проявляющихся в необъективности подбора доз, их вариабельности, используется метод экспериментального изучения токсичности малотоксичных соединений, путем введения доз, соответствующих максимально возможному разведению химических соединений в известных максимально вводимых объемах, .позволяет быстро подобрать максимальную вводимую дозу на кг (г) веса животного, подтвердить или опровергнуть низкую токсичность изучаемых веществ, сравнить результаты различных исследователей между собой.


5. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ


Социологические исследования, проведенные в последние десятилетия, показывают стабильно высокий уровень распространенности как злоупотребления алкоголем, так и алкоголизма и его осложнений среди различных групп населения. В то же время, при проведении эпидемиологических исследований влияние множества социальных факторов не позволяет до конца выявить искомые зависимости течения различных проявлений алкоголизма. Поэтому одним из способов исследования алкогольобусловленной патологии в клинической наркологии является моделирование проявлений острой и хронической алкогольной интоксикации на лабораторных животных.

При моделировании острой алкогольной интоксикации используются максимально переносимые дозы этанола. В этом случае исследуются патологические изменения, сопровождающие развитие острого отравления вплоть до коматозного состояния.

Моделирование хронической алкогольной интоксикации позволяет получить характерные патологические изменения, сравнимые с таковыми у человека при длительном злоупотреблении алкоголем. При применении методик с длительным введением алкоголя необходимо учитывать возрастной фактор, так как скорость элиминации этанола из организма с постарением животных замедляется.

Средние дозы этилового спирта, получаемые животными на протяжении хронического эксперимента, зависят от его задач и составляют, например, для крыс - от 4-10 г на кг веса в сутки, но иногда используются и максимально переносимые дозы – до 15 – 20 г/кг. Наиболее адекватной для моделирования характерных проявлений алкогольной висцеропатологии на крысах, являются дозы в пределах 7 г/кг/сут. 40% этанола, соответствующие, в частности, ? DL50, что обусловливает в процессе хронической интоксикации достаточно быстрое развитие типичных алкогольных поражений внутренних органов, но не сопровождается массовой гибелью животных. Продолжительность хронического эксперимента колеблется от 5 суток до 4 лет также в зависимости от целей исследования.


6. МОДЕЛИРОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И АЛИМЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ


Ряд клинических синдромов алкоголизма связывается с нарушением питания (в частности, обмена витаминов и белков) и изменением нутриентного статуса организма. Это обусловлено тем, что продолжительная алкогольная интоксикация в ряде случаев сопровождается недостаточностью питания, нарушением всасывания и метаболизма незаменимых факторов питания.

Ввиду того, что этанол, помимо высокой калорийности, не представляет пищевой ценности, при систематическом употреблении алкогольных напитков структура пищевого рациона претерпевает резкий дисбаланс, при этом часто наблюдается алиментарный дефицит, подобный дефициту при голодании. Нарушение обмена белков и общая белковая недостаточность при хронической алкогольной интоксикации достаточно обоснованно расцениваются как одни из типичных для рассматриваемой патологии проявлений. Недостаток отдельных факторов белкового питания может вызвать существенные нарушения обмена витаминов, что, в свою очередь, приводит к ухудшению функциональной активности внутренних органов. Поскольку некоторые из витаминов оказывают избирательное действие на отдельные их функции, хроническая алкоголизация еще более углубляет эти нарушения. Кроме того, при одновременном дефиците витаминов и белка морфофункциональные параметры могут отличаться от соответствующих характеристик изолированных форм алиментарной недостаточности.

На основании вышеизложенных данных, нами предложена модель комплексного воздействия хронической алкогольной интоксикации и алиментарной недостаточности - витаминов группы В, играющих важную роль при алкогольобусловленной патологии, и белка.


Алгоритм создания модели.

Алгоритм создания экспериментальной модели хронической алкогольной интоксикации на фоне алиментарного дисбаланса включает следующие компоненты:

1.Выбор лабораторных животных и условий их содержания

2. Выбор экспериментальных диет, необходимых дозировок этанола, способа его введения и продолжительности эксперимента

3.Оценка степени тяжести токсического воздействия.


Выбор лабораторных животных и условий их содержания

В качестве подопытных животных при моделировании длительной алкоголизации на фоне алиментарного дисбаланса при прочих равных условиях предпочтительнее использовать крыс. Выбор данного вида лабораторных животных обусловлен сравнимостью алкогольобусловленных изменений у крыс с таковыми у человека, морфофизиологическими особенностями этих животных (отсутствием отвращения к этанолу и рвотного рефлекса на его действие, постоянной заполненностью желудка пищей), простотой содержания и легкостью выполнения с ними различных процедур (фиксации, введения растворов веществ с помощью зонда и т. д.).

Животные должны содержаться в стандартных условиях вивария, иметь свободный доступ к пище и воде. Учитывая возможность поступления витаминов при копрофагии, крыс содержат в клетках с дном из крупноячеистой сетки.

Выбор экспериментальных диет, необходимых дозировок этанола, способа его введения и продолжительности эксперимента

Для наиболее полного изучения комплексного воздействия недостаточности витаминов группы В и белка животных рекомендуется разделить на четыре рабочие группы, получающие:

I – сниженное содержание витаминов группы В

II – сниженное содержание белка

III – сниженное содержание белка и витаминов группы В

IV – контрольная – содержится на обычном рационе вивария.

Например, рацион, практически исключающий содержание витамина В6 содержит 18-20% казеина, очищенного от витаминов, 73-71% сахарозы, 4% солевой смеси, 3% подсолнечного масла с 0,2% рыбьего жира.

При проведении эксперимента, в цели которого входит моделирование недостаточности определенных витаминов, следует максимально точно обеспечивать покрытие потребностей животных в других витаминах (таблица 2).


Таблица 2

Суточные дозы витаминов, покрывающие основные потребности крыс (по Ю.М. Островскому, 1979).

Суточная доза, мкг

Пантотенат

Пиридоксин

Витамин С

Токоферол

В связи с изменением массы тела животных рационы необходимо корректировать в соответствии с приказом МЗ РСФСР №1179 от 10. 10. 1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения».

Моделирование недостаточности в рационе белка осуществляется путем содержания лабораторных животных на специализированных диетах, составленных по методике А.А. Покровского с соавт. (1974).

Наиболее приемлемой в условиях хронического эксперимента на крысах является экспериментальный рацион, содержание белка в котором в 4,6 раза меньше, чем при стандартном кормлении (таблица 3).


Таблица 3

Суточный рацион крыс с пониженным содержанием белка

(по А.А. Покровскому, 1974)

Ингредиенты

% по калорийности

Казеин пищевой

Смесь лярда и подсолнечного масла 1:1

Крахмал маисовый

Для достижения равной калорийности между стандартным и экспериментальным рационами к последнему добавляют расчетное количество крахмала.

В каждой группе животные разделяются не менее чем на две подгруппы:

Получающие ежедневно 40 % раствор этанола через металлический желудочный зонд (из расчета 7,0 г/кг веса) .

Получающие эквиобъемное количество дистиллированной воды.

Введение раствора этанола и дистиллированной воды производится ежедневно в утренние часы до кормления.

Для изучения алкогольобусловленной патологии у крыс продолжительность эксперимента составляет от 4 до 6 недель.


Оценка степени тяжести токсического воздействия

Для адекватной оценки токсического действия химических веществ необходимо регулярное наблюдение за животными, во время которого отмечаются потребление корма и воды, изменение внешних признаков (волосяного покрова, видимых слизистых), особенности поведения. Не реже 1 раза в неделю для изучения динамики изменений производится взвешивание, исследуется функциональное состояние внутренних органов и систем, биохимические и морфологические изменения крови. Методы для оценки состояния органов и систем выбираются с учетом целей эксперимента, однако они должны быть современными и достаточно чувствительными. При проведении исследования необходимо стремиться к использованию максимально полного набора физиологических, патоморфологических, гематологических и биохимических тестов, как для интегральной оценки состояния, так и для определения степени нарушения отдельных органов и систем.

Степень выраженности патологических изменений, регистрируемых у животных, подвергающихся длительной алкогольной интоксикации на фоне алиментарного дисбаланса, определяется с помощью анализа интегральных, биохимических, гематологических и оценки патоморфологической картины. Для проведения функциональной диагностики состояния внутренних органов используются инструментальные методы – ЭЭГ, ЭКГ.

Интегральные показатели:

*изменение внешних признаков – производится 1 раз в 3 суток, перед очередным введением этанола или дистиллированной воды, путем бальной оценки изменения окраса шерсти и волосяного покрова по следующей схеме (таблица 4):

Таблица 4

Шкала изменений внешних признаков крыс

Баллы или символы

Описание изменения

Выпадение шерсти

Загрязненный

Не загрязненный

*изменение степени активности - оценивается в баллах 1 раз в 3 суток до этанольной затравки или водной нагрузки по следующей схеме (таблица 5)

*изменение массы тела животных - регистрируется путем взвешивания через каждые 7 суток эксперимента до закладки корма и этанольной затравки

*объем суточного потребления пищи и воды; экскреция веществ.

Шкала изменения активности крыс в токсикологическом эксперименте


Баллы, символы /+/

Степень активности

Описание активности


Погибшее животное

Кома (отсутствие активности)

Боковое положение; обездвиженность; отсутствие активных движений; мышцы расслаблены; дыхание прерывисто; реакции на болевые и тактильные раздражители, в том числе и голосовые, практически отсутствуют.

Слабая (минимальная)

В основном – боковое положение; непроизвольные слабые активные движения; мышцы расслаблены; вялая реакция на болевые и тактильные раздражители, голосовая – слабая.

Пассивная

Животное заторможено, активно по клетке не передвигается, но при подталкивании перемещается на несколько шагов. Положение естественное – на четырех лапах; ощущается тонус мышц. «Избегательная» защитная реакция на раздражители, голосовая реакция слабая.

Замедленная (субнормальная)

Положение – на четырех лапах, медленные активные движения – повороты туловища и небольшие передвижения по клетке, редкие глотательные движения. Реакция на болевые и тактильные раздражители – голосовая и «избегательно-оборонительная» с попытками укусов. При фиксировании рукой за кожу в области спины - изворачивается с «уходом» от экспериментатора.

Нормальная

Интактная крыса. Подвижна; активные движения - перемещение и «изыскание лучшего места в группе»; «настороженно-ожидательная» поза при незначительных болевых и тактильных раздражителях с избеганием, резкой голосовой и активно-оборонительными реакциями, царапающими и кусательными движениями. Хороший аппетит; частые «моющие» движения лапками.

Биохимические и гематологические показатели.

Исследуются изменения основных биохимических показателей крови и совокупности гематологических параметров, подвергающихся наибольшему влиянию хронической алкогольной интоксикации (таблица 6).


Таблица 6

Биохимические и гематологические показатели крыс в токсикологическом эксперименте

Объект исследования

Исследуемые показатели

Сыворотка крови

аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, креатининфосфокиназа, гамма-глутамилтрансфераза

общий белок, белковые фракции

креатинин

мочевина

Форменные элементы крови

количество эритроцитов

гематокритная величина

цветной показатель

количество ретикулоцитов

средняя продолжительность жизни эритроцитов

лейкоцитарная формула

Подготовка гистологического материала.

Гистологическому исследованию подвергаются основные «органы – мишени» хронической алкогольной интоксикации – сердце, печень, почки, головной мозг. Необходимо помнить, что качество анализа во многом зависит от подготовки материала, в частности, фиксации исследуемых объектов. Рекомендуется использование для фиксации 10 % раствора формалина или раствор Буэна. При этом предпочтение отдается раствору Буэна, поскольку в данном случае значительно лучше выявляются изменения микроструктуры органов, свойственные длительной алкогольной интоксикации, а именно:

1) в печени – четче прослеживается структурированность цитоплазмы (вакуолизация, «булыжность» - неоднородность прокрашивания цитоплазмы клеток внутри долек), особенности изменения кровенаполнения центральных вен гемокапилляров;

2) в почках – в морфологии эпителиальной выстилки канальцев отчетливее отражаются неоднородности цитоплазматических структур с особенно частым поражением апикальных частей;

3) в легких – в соединительно-тканных межальвеолярных перегородках значительно резче выявляются гипертрофированные, со светлой цитоплазмой клетки, часть которых становится полиплоидными. Чаще отмечаются изменения со стороны альвеолярного эпителия, клетки которого слущиваются в просвет альвеол;

4) в селезенке – лучше проявляется структура ретикулярных клеток, синусов красной пульпы, где отмечается большее разрушение эритроцитов.

Таким образом, применение модели алкогольобусловленной патологии на фоне алиментарного дисбаланса предполагает изучение в экспериментальных условиях наиболее широкого круга изменений внутренних органов и систем, сравнимых с таковыми у человека при злоупотреблении алкоголем. Система оценки основных интегральных, биохимических, гематологических показателей и особенностей патоморфологической картины позволяет на протяжении всего периода исследования контролировать характер и степень патологических изменений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берзиня Н.И. Птицы в эксперименте // Лабораторные животные. – 1995. – V. - №2. – С.99-113.

2. Регламентация экспериментов на животных – этика, законодательства, альтернативы. / Под ред. Н. А. Горбуновой. – М., 1998.

5. Мяленкова И.Ю. Лабораторная собака // Лабораторные животные. – 1994. – IV. - №4. – С.234-246

6. Нужный В.П. Методологические аспекты оценки токсичности спиртосодержащих жидкостей и алкогольных напитков // Токсикологический вестник. – 1999. - №4. – С2-10.

7. Островский Ю.М. Экспериментальная витаминология. – Минск, 1979. – 450с.

8. Покровский А.А. с соавт., О соотношении между содержанием свободных аминокислот в тканях и плазме крови при белковой недостаточности в эксперимента // Вопросы питания – 1974. - №1. – С.8-15.

9. Требования Международного комитета по науке по использованию в экспериментальных исследованиях лабораторных животных // Бюллетень ИКЛАС. – 1978. - № 24. – С. 4-5.

10. Штефель В.О. О сроках воздействия при моделировании интоксикаций в токсиколого-гигиенических исследования // Гигиена и санитария. – 1996. - №8. – С.70-72.

11. Sos J et al., Diets for animals experiments. – Budapest,1974.

Немаловажное значение для токсикологического эксперимента имеют условия содержания подопытных животных. Содержание животных в условиях, вызывающих у них стресс (одиночное со­держание в пенале, грубая фиксация в нефизиологическом положении), приводит к увеличению токсичности. Изменения в пита­нии также сказываются на показателях токсичности.

Для экспериментальных исследований в токсикологических лабораториях используют крыс линии Вистар или белых беспо­родных крыс, которые являются альбиносами черной (Rattus rattus) и серой (пасюк - Rattus norvegicus) крыс, а также белых мы­шей, которые являются альбиносами домовой мыши (Mus musculus). И крысы, и мыши принадлежат к одному и тому же от­ряду грызунов (Rodentia), семейству мышиных (Muridae).

Важное преимущество белых крыс как лабораторных животных заключается в том, что они довольно устойчивы к инфекционным заболеваниям и дают большой приплод.

Белых крыс содержат в помещениях с хорошей вентиляцией, достаточным освещением и равномерной температурой - 20- 22 *С. Лабораторные крысы плохо переносят холод. Влажность воздуха в помещениях не должна превышать 40-45 %.

В качестве подстилки для животных используют крупные опилки, измельченный торф или сечку из соломы или бумаги, тряпки. В клетках поддерживают надлежащую чистоту. Они долж­ны быть всегда сухими, чистыми, хорошо вентилируемыми. Не допускают скопления в них мочи и фекалий.

Кроме ежедневной уборки клетки I -2 раза в месяц тщательно моют и дезинфицируют. Дезинфицировать клетки лучше всего крутым кипятком, горячим 5-10%-м раствором едкой щелочи или такими противомикробными средствами, как хлорная из­весть, креолин, сулема, формалин и др.

Крысы - всеядные животные, поэтому нельзя ограничивать их рацион только растительной пищей. Крысы, не получающие в не­обходимых количествах продукты животного происхождения (мо­локо, мясо, мясокостную муку), минеральные вещества и витами­ны, перестают расти.

Суточная потребность взрослой крысы в кормах составляет в среднем 30-32 г, из них 25 г смешанного корма и 5-7 г овощей.

Кормят крыс обычно 2 раза в сутки. Ввиду того что крысы ночные животные и едят в темное время суток, основную часть корма следует давать вечером, примерно к 20 ч. Не рекомендуется резко менять пищевой режим, к новой пище крыс нужно приучать постепенно. Вода для питья должна быть чистой и свежей, реко­мендуется пользоваться кипяченой водой. Заменять воду молоком также надо постепенно, в противном случае животные отказыва­ются от еды и заболевают.

что мыши более чувствительны к нарушениям температурного ре жима, смене корма и инфекционным заболеваниям (в частности сальмонеллезу). У мышей в гораздо большей степени, чем у крыс проявляется «социальная» иерархия в группе - борьба за лидер­ство, вследствие чего не рекомендуется изменять состав мышей Е клетках.

Суточная потребность взрослой мыши в кормах составляет Е среднем 9,5-10 г смешанного корма и 1-2 г овощей.

Тема 4. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Цели использования лабораторных животных в вирусологии

Задание к следующему занятию

Подведение итогов занятия

Задания

1. Найти под световым микроскопом в препаратах и зарисовать:

а) цитоплазматические тельца-включения;

б) внутриядерные тельца-включения;

в) вирионы вируса оспы в окраске по Морозову.

2. Ознакомиться с устройством и принципом работы электронного микроскопа.

3. Дешифрировать электронные микрофотографии вирионов разных вирусов (дать их схематический рисунок).

Самостоятельная работа студентов

Студенты знакомятся с устройством светового, люминесцентного и электронного микроскопов (в лаборатории), зарисовывают схему строения электронного микроскопа. Знакомятся с подготовкой препаратов для электронной микроскопии. Просматривают готовый препарат в люминесцентном микроскопе. Зарисовывают схему прямого и непрямого метода РИФ.

Контрольные вопросы:

1. Устройство электронного микроскопа.

2. Методы подготовки препаратов для просмотра в электронном микроскопе.

3. Люминесцентную микроскопию (РИФ) прямой и непрямой методы.

4. Значение электронной и люминесцентной микроскопии в вирусологических исследованиях.

Цель занятия: ознакомить студентов с требованиями к видам лабораторных животных, их карантинированием, содержанием, кормлением, мечением.

Оборудование и материалы: набор инструментов в стерилизаторе (ножницы, иглы, шприцы, пинцеты, корнцанги), лабораторные животные, ватные спиртовые тампоны краски для мечения, эфир, ксилол, мультимедийное оборудование, плакаты и презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя: Большинство вирусов разных таксономических групп могут быть отличимы друг от друга на основе патогенности для лабораторных животных разных видов или возраста.

4.1 Виды лабораторных животных. Наиболее широко в вирусологических лабораториях применяют мышей, бе­лых крыс, кроликов, морских свинок, хомяков, цыплят. У молодых мышей экс­периментально воспроизводят грипп, альфа- и флавивирусные инфекции, ящур (на новорожденных мышатах) и др. Они восприимчивы ко многим вирусам, их легко разводить и с ними удобно работать. Лучше использовать мышей инбредных линий, так как они почти одинаково реагируют на тот или иной вирус. У крыс также создают инбредные линии, но эти животные более устойчивы к оп­ределенным вирусным инфекциям, чем мыши. Онкогенность некоторых виру­сов широко изучают на золотистых хомячках. Для вирусологических опытов обычно используют гладкошерстных морских свинок массой 250–300 г.


Ту или иную инфекцию иногда изучают на животных нескольких видов, об­ладающих разной чувствительностью к данному вирусу, что позволяет диффе­ренцировать вирусы, вызывающие клинически сходные симптомы болезни (на­пример, ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней).

По генетическим качествам лабораторных животных делят на четыре группы:

1) животные смешанного происхождения, полученные от разных животноводов, такие животные гетерогенны;

2) животные, полученные непосредственно из од­ного источника, однако генетически такие животные вариабельны;

3) инбредные линии животных. Их получают в результате спаривания брата с сестрой или родителей с детьми по крайней мере не менее 20 поколений. При таком методе разведения достигается все возрастающая степень гомозиготности.

4) однородные гибриды F 1 . Высокая степень гетерозиготности, характерная для каждого гибрида, связана здесь с генетическим однообразием, которое соответствует степени гомозиготности родительских линий. Как правило, однородные гибриды F 1 менее изменчивы, чем обе родительские ли­нии. Животные-мутанты имеют отдельно выраженный наследственный фактор, который обусловливает видимое отклонение от нормальной формы.

Отрицательная сторона выделения вируса на лабораторных животных – воз­можность диагностических ошибок вследствие активации скрытого вирусоносительства. В этом случае развитие симптомов болезни после введения матери­ала не следствие действия введенного вируса, а результат самой процедуры, на­рушающей предшествующее равновесие в организме. В это время проявляется вирус или другой инфекционный агент, длительно персистирующий в организ­ме. Выражается это резкими неврологическими симптомами (повороты вдоль длинной оси тела).

Наличие скрытой вирусной инфекции может также выражаться уменьшени­ем или исчезновением чувствительности животных к исследуемому вирусу вслед­ствие явления интерференции. Возможен и противоположный эффект, а имен­но – явление синергизма в действии вирусов, что дает иногда результаты, труд­ные для правильной интерпретации.

Для некоторых вирусологических работ, например при выделении вируса с невыясненными болезнетворными свойствами, необходимо использовать гнотобиотов. Термин «гнотобиоты» объединяет две категории животных: безмик­робных (стерильных), не содержащих никаких жизнеспособных микробов, и гнотофор – носителей одного (моногнотофоры), двух (дигнотофоры) или более (полигнотофоры) микроорганизмов. В настоящее время безмикробные животные по динамике роста делятся на три группы: I – обезьяны, поросята, цыплята растут лучше обычных животных или наравне с ними; II – крысы, мыши, собаки, кошки растут наравне с обычными животными; III – морские свинки, кролики, козлята, ягнята растут хуже обычных животных.

Стерильных птиц получают посредством инкубации яиц со стерильной скор­лупой в стерильном инкубаторе, лабораторных животных – путем кесарева се­чения или гистерэктомии. Содержат животных в стерильных изоляторах. Воз­дух, вода и корм должны быть стерильными.

Особое значение среди гнотобиотов занимают СПФ-животные (Specific pathogen free), которые свободны только от патогенных микроорганизмов. В их организме имеются все необходимые для нормальной жизнедеятельности бактерии и ви­русы, которые в совокупности создают группу так называемой резидентной (по­лезной) микрофлоры. В настоящее время получены лабораторные СПФ-живот­ные – крысы, морские свинки, кролики, поросята, птицы и др.

4.2 Цели использования лабораторных животных. В настоящее время лабораторных животных используют в вирусологии для:

– обнаружения вируса в патматериале;

– первичного выделения вируса из патматериала;

– накопления вирусной массы;

– поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии;

– титрования вируса;

– получения гипериммунных сывороток;

– в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации.

В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных перечисленных видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.

4.3 Требования к лабораторным животным. Комплектуя группы животных для вирусологических исследований, необходимо выполнять следующие требования:

– животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

– возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных. Например, для биопробы на бешенство и ящур используют мышей-сосунов, на ларинготрахеит птиц – цыплят. Но в то же время заражение взрослых кроликов вирусом болезни Ауески ведет к появлению ярких и специфичных клинических признаков заболевания;

– стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе;

– лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно, т. е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день). В этот период за животными ведут ежедневное клиническое наблюдение. При подозрении на наличие инфекционной болезни животных подвергают лабораторному исследованию. В случае установления инфекционного заболевания среди животных всю поступившую партию уничтожают.

4.4 Содержание лабораторных животных. Виварий для лабораторных животных должен иметь основное помещение для животных, моечную (с боксом, сушиль­ными и стерилизационными установками), кухню для приготовления корма с одним по крайней мере столом, оборудованным для приготовления корма, и холодильником для скоропортящихся продуктов, кладовую, операционную, гар­дероб и санитарное помещение для обслуживающего персонала. Помещения должны быть чистыми. Стены и полы легко дезинфицируемыми. Запасы корма следует хранить в специальных помещениях. В местах содержания опытных животных желательно иметь гигрометр и термометр.

Мышей, крыс, хомяков и морских свинок в период опыта рекомендуется содержать в стеклянных банках с крышкой из проволочной сетки или перфори­рованного листового железа. Это облегчает наблюдение за ними, а банки легко чистить и дезинфицировать. Можно содержать животных в металлических клет­ках, которые также легко дезинфицировать.

В качестве подстилки применяют материалы, которые адсорбируют влагу и могут быть использованы животными для постройки гнезда: стружку для мы­шей, крыс, хомяков, морских свинок, хорьков, кур; опилки для крупных мы­шей, крыс, хомяков, хорьков, кур; солому для хомяков, морских свинок, кроли­ков, собак, кур; мякину для мышей, крыс; сено для мышей, крыс, хомяков, хорьков, кур; песок для кур. Следует использовать такую подстилку, которая образует как можно меньше пыли, так как последняя может привести к заболева­нию органов дыхания. Любую подстилку необходимо предварительно стерили­зовать при 100 °С в течение 30 мин.

Помещения для лабораторных животных периодически дезинфицируют, осо­бенно перед размещением новой партии животных. Это относится и к предме­там ухода за животными (лопаты, скребки, метелки и др.), которые соприкаса­ются с навозом и различными отбросами из помещения. После окончания каж­дого опыта клетки обязательно обрабатывают дезинфицирующими растворами, чему должна предшествовать чистка как клеток, так и помещения.

Посуду для корма и воды ежедневно смачивают дезинфицирующим раствором, после чего моют и споласкивают чистой водой. Помещения обрабатывают 1% раствором едкого натра, который используют в течение суток. Дезковрики пропитывают свежим раствором каждые 2 дня. Для дезинфекции предме­тов ухода, мытья полов и посуды рекомендуется использовать 3% раствор хлорамина, который должен быть применен в течение 2 ч. В виварии необходи­мо уничтожать вредителей: мух, комаров, блох, власоедов, клещей, вшей, му­равьев, мышей, крыс.

Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Животных содержат в виварии с учетом их физиологической потребности в освещенности и температуре. Так, мышам, крысам нужны полумрак и температура воздуха около 20 °С, морским свинкам, кроликам и курам – дневной свет и температура в пределах 16–23, 14–18 и не ниже 0°С соответственно. Плотность посадки должна составлять примерно 1 г массы лабораторных животных на 1 см 2 дна клетки. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой.

Если виварий один, зараженных животных содержат изолированно от здоровых и с последних начинают уборку помещения и кормление. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Лучше иметь два вивария: для содержания здоровых и зараженных животных.

Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфицируют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезинфицирующих веществ. По окончании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам. Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные. Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

Таблица 1

Масса животных в разном возрасте

Поделиться: