Диагностические методы. Серологические реакции в диагностике инфекционных болезней Серологические реакции, используемые для диагностики вирусных инфекций
Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы , т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.
Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды).
Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности.
Иммунодефициты, как первичные, так и особенно вторичные , широко распространены среди людей. Они являются причиной проявления многих болезней и патологических состояний, поэтому требуют профилактики и лечения с помощью иммунотропных препаратов.
34. Инактивированные (корпускулярные) вакцины. Получение. Применение. Достоинства. Недостатки.
Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе протективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины).
Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осаждение.
Их получают путем выращивания патогенных бактерий и вирусов на искусственных питательных средах, инактивируют, выделяют антигенные комплексы, очищают, конструируют в виде жидкого или лиофильного препарата.
Преимуществом данного типа вакцин является относительная простота получения (не требуется длительного изучения и выделения штаммов). К недостаткам же относятся низкая иммуногенность, потребность в трехкратном применении и высокая реактогенность формализированных вакцин. Так же, по сравнению с живыми вакцинами, иммунитет, вызываемый ими, непродолжителен.
В настоящее время применяются следующие убитые вакцины: брюшнотифозная, обогащенная Vi антигеном; холерная вакцина, коклюшная вакцина.
119. Серологические реакции, используемые для диагностики вирусных инфекций.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.
Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды).
Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности.
К вопросу про экспресс-диагностику:
1. Диагностике поддается культура выделенная в чистом виде. 2. В Специально оснащенных лабораториях (должно иметься разрешение) 3. Соблюдение строгих правил таких как: изолированное помещение, необходимые специальные защитные костюмы, обязательная полная санитарная обработка помещения после работы с возбудителем, санитарная обработка исследователей после окончания работы. Методы эксперсс-диагностики. 1.Бактериология - комбинированные политропные питательные среды для быстрого изучения морф,тинктор, биохим. свойств. Использование энзимоиндикаторной ленты, электрофизический метод, метод бумажных дисков, пропитанных различными в-вами (глюказо, лактоза и т.п.) 2.Фагодиагностика. 3.Серодиагностика - метод Манчини, раекция преципитации в геле по Асколи, РА, РПГА. 4. Бактериоскопия - прям и непрям РИФ. Методы экспресс диагностики при: Холере - м.З.Ермольевой, р-ция иммобилизации с холерной диагностической сывороткой, РИФ. Туляремии - РА на стекле, РПГА Чуме - фаготипирование, метод углеводных бумажных дисков, РПГА. Сиб.язва - метод Асколи, РИФ, РПГА. Характер роста: их три диффузный (Факультативные анаэробы), придонный(облигатные анаэробы) и поверхностный(облигатные аэробы.)
Выделение чистой культуры анаэробных бактерий
В лабораторной практике часто придется работать с анаэробными микроорганизмами. Они более прихотливы к питательным средам, чем аэробы, чаще нуждаются в специальных ростовых добавках, требуют прекращения доступа кислорода при их культивировании, длительность роста их длиннее. Потому работа с ними более сложна, требует значительного внимания бактериологов и лаборантов.
Важной является защита материала, который содержит анаэробные возбудители от токсичного влияния атмосферного кислорода. Потому материал из очагов гнойной инфекции рекомендуется забирать во время их пункции с помощью шприца, время между взятием материала и посевом его на питательную среду должно быть максимально коротким.
Поскольку для культивирования анаэробных бактерий используют специальные питательные среды, которые не должны содержать кислорода и имеют низкий окислительно восстановительный потенциал (-20 -150 мВ), к их составу вводят индикаторы – резазурин, метиленовий синей и тому подобное, которые реагируют на смену этого потенциала. При его росте возобновлены бесцветные формы индикаторов изменяют свой цвет: резазурин окрашивает среду в розовый цвет, а метиленовий синей – в голубой. Такие изменения свидетельствуют о невозможности использования сред для культивирования анаэробных микробов.
Способствует снижению окислительно восстановительного потенциала введения в среду не меньше 0,05 % агару, который, увеличивая его вязкость, способствует уменьшению поступления кислорода. Это, в свою очередь, достигается еще и использованием свежих (не позже двух часов после изготовления) и редуцируемых питательных сред.
Следует учесть, что через особенности бродильного типа метаболизма анаэробных бактерий они требуют более богатых на питательные компоненты и витамины сред. Чаще всего используют сердечно мозговой и печеночный настои, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитичний перевар казеина, пептон, триптон. Обязательным является добавление факторов росту, таких как твин-80, гемин, менадион, цельная или гемолизированная кровь.
Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов. В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Занял проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя за методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 год. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов. Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.
Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов. Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 часа.
На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.
Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.
Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.
Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.
Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.
В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.
На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.
Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.
Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.
Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).
Определение вида возбудителя за его биохимическими свойствами называется биохимической идентификацией.
МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ Для успешного культивирования, помимо правильно подобранных сред и правильно произведенного посева, необходимы оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение воздухом). Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, для удаления воздуха из питательной среды используют различные способы. Выделение отдельных видов бактерий (чистой культуры) из исследуемого материала, содержащего, как правило, смесь различных микроорганизмов, является одним из этапов любого бактериологического исследования. Чистой культурой микробовполучают из изолированной микробной колонии. При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Этапы выделения чистой культуры бактерий I этап (нативный материал) Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре). Посев на плотные питательные среды (получение колоний). II этап (изолированные колонии) Изучение колоний (культуральные свойства бактерий). Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке (морфологические свойства бактерий). Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры. III этап (чистая культура) Определение культуральных, морфологических, биохимических и других свойств для идентификации культуры бактерий ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ Идентификацию выделенных бактериальных культур проводят путем изучения морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков, присущих каждому виду.
Антигены – генетически чужеродные вещества, которые при введении в организм животного или человека вызывают специфический иммунный ответ - синтез антител, формирование сенсибилизированных Т-лимфоцитов, иммунологической памяти или толерантности. Под чужеродными веществами понимаются химические структуры, которых нет в организме. Инородными для организма человека являются вирусы, микроорганизмы, а также клетки, ткани, органы животных и других людей. Антигены имеют несколько рецепторов для связи с антителами и способны вступать в реакцию с ними как в организме животного или человека (in vivo), так и вне организма – в пробирке (in vitro).
Антитела - высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови. Антитела синтезируются под влиянием антигена и способны специфично реагировать (соединяться) с соответствующим антигеном. Все антитела имеют характерную структуру иммуноглобулинов; отличаются по иммунологическим, биологическим и физическим свойствам; и делятся на 5 классов – ІgG , ІgА, ІgМ, ІgD и ІgЕ.
Серологические реакции
В лабораторной практике используют серологические реакции - лабораторные реакции между антигенами и антителами, которые приводят к регистрируемым изменениям в исследуемой системе. Эти реакции получили название серологических, так как для их постановки используют сыворотку (serum), содержащую антитела.
Серологические исследования, выполняемые для обнаружения специфических антител и антигена возбудителя при инфекционных заболеваниях, - более доступные методы лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования остаются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний.
Некоторые методы определения антител, используемые в лабораторной практике
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в тестах in vitro (т.е. «в пробирке» - вне живого организма). Реакции антиген-антитело в системе in vitro могут сопровождаться возникновением нескольких феноменов - агглютинации, преципитации, лизиса и других. Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размеры частиц, физическое состояние), класса и вида антител, а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).
1. Реакция связывания комплемента
Комплемент - это система белков плазмы крови, которая включает в себя 9 компонентов указанных буквой С (С1, С2, С3,... С9), фактор В, фактор D и ряд регуляторных белков. Некоторые из этих компонентов состоят из 2 - 3 белков, например С1 - это комплекс из трех белков. Эти белки циркулируют в кровеносном русле и присутствуют на мембранах клеток. Комплемент является важнейшей системой как врождённого, так и приобретённого иммунитета. Эта система предназначена для защиты организма от действия чужеродных агентов и участвует в реализации иммунного ответа организма. Комплемент был открыт в конце 19-го столетия бельгийским ученым Ж. Борде.
Реакция связывания комплемента (РСК) – серологическая реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих антител и антигенов. Впервые описана Борде и Жангу (Bordet - Gengou) в 1901 году. РСК основана на том, что комплекс "антиген - антитело" способен поглощать комплемент, который добавляют в реакционную смесь. При соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент. Специфический иммунный комплекс адсорбирует комплемент, добавленный в систему, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Чем больше антител, тем больше фиксируется комплемента. Если же комплекс "антиген - антитело" не образуется, то комплемент остается свободным.
Сложность РСК состоит в том, что реакция образования комплекса "антиген - антитело – комплемент" невидимая. Для выявления компонентов реакции используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему. С помощью реакции гемолиза проводится количественное определение остатка комплемента после окончания реакции антигена с антисывороткой.
Реакцию связывания комплемента (РСК) используют для выявления антител на определенный антиген или определяют тип антигена по известному антителу. В этой сложной серологической реакции участвуют две системы и комплемент. Первая система - бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела. Вторая система - гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело).
РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитела, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему.
В связи с высокой чувствительностью реакция связывания комплемента (РСК) применяется как для серологической диагностики бактериальных и вирусных инфекций, аллергических состояний, так и для идентификации антигенов (выделенной бактериальной культуры).
Реакция преципитации (РП) (от лат. praecipitatio – выпадение осадка, падение вниз) основана на выпадении в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена и специфического антитела в присутствии электролита. В результате реакции образуется мутное кольцо или рыхлый осадок – преципитат. Реакция преципитации происходит между водорастворимым антигеном и антителом, получаются крупные комплексы, которые выпадают в осадок
3. Реакция флоккуляции
Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат floccus - хлопья шерсти, flocculi – клочья, хлопья; flocculation – образование рыхлых хлопьевидных агрегатов (флокул) из мелких частиц дисперсной фазы) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин – антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Реакция флокуляции основана на выявлении «инициальной» флокуляции - помутнения при образовании комплекса экзотоксин (анатоксин) + антитоксин в оптимальных количественных соотношениях ингредиентов.
4. Реакция агглютинации
Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) – это реакция взаимодействия антигена со специфическим антителом, которая проявляется в виде склеивания. При этом антигены в виде частиц-корпускул (микробные клетки, эритроциты и др.) склеиваются антителами и выпадают в осадок (агглютинат) в виде хлопьев. Агглютинаты обычно видны невооруженным глазом. Для появления реакции необходимо присутствие электролитов (например, изотонического раствора хлорида натрия), ускоряющих процесс агглютинации.
С помощью реакции агглютинации (РА), reactio agglutinationis (англ. agglutination test) выявляют антитела или корпускулярные антигены. В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латексагглютинации, коаглютинации и т.д.
5. Название антител, участвующих в осадочных реакциях
Антитела, участвующие в осадочные реакциях, получили традиционное название по своему взаимодействию с антигеном:
агглютинины – вызывают склеивание корпускулярного антигена – агглютиногена и осаждение комплекса антиген - антитела (агглютината);
преципитины – образуют преципитат с растворимым антигеном – преципитиногеном.
В лизирующих реакциях участвуют бактериолизины (вызывают лизис бактерий) и гемолизины (вызывают лизис эритроцитов).
Оглавление темы "Методы обнаружения вирусов. Методы диагностики микозов (грибковых заболеваний). Методы обнаружения простейших.":Серологические методы диагностики вирусных инфекций. Торможение гемагглютинации. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Прямая иммунофлюоресценция. Иммуноэлектронная микроскопия.
При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики . Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.
РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.
Торможение гемагглютинации
РТГА применяют для идентификации вирусов , способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.
Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов
Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.
Прямая иммунофлюоресценция
Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклона л ьных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).
Иммуноэлектронная микроскопия
Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.