Faze metode fluorescentne in situ hibridizacije. FISH test: brza dijagnoza raka. Pogledajte šta je "Fluorescentna in situ hibridizacija" u drugim rječnicima

RIBA je jedno od najneverovatnijih "alata" molekularne biologije u 21. veku. U preimplantacijskoj dijagnozi, istraživačka tehnika FISH se koristi za otkrivanje hromozomskih abnormalnosti ili poremećaja uparivanja hromozoma u ćelijama embrija koji je upravo dobijen in vitro oplodnjom (IVF). Ako se ne pronađu anomalije ili znaci aneuploidije (poremećaji uparivanja, nedostatak parova hromozoma), onda se "vještački" embrij smatra održivim. Može se ugraditi u matericu buduće majke.

FISH takođe omogućava praćenje seksualnih karakteristika u hromozomskom setu embriona. To omogućava određivanje spola nerođenog djeteta i prije samog početka trudnoće (ako to smatramo početkom implantacije vantjelesnog začeta embrija u matericu).

Šta je RIBA?

Skraćenica je skraćenica za: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, ili fluorescentna in-situ hibridizacija. Transkript, najvjerovatnije, neukom čitaocu ništa ne govori. Stoga ćemo složeni koncept analizirati u dijelovima, ostavljajući neprevedeno „in-situ“ za kraj.

Hibridizacija

U molekularnoj biologiji ovaj termin ima vrlo posebno značenje, koje nema nikakve veze sa ukrštanjem vrsta u "običnoj" biologiji.

Hibridizacija je molekularna genetska tehnika koja se koristi za procjenu stanja DNK i RNK proučavanih stanica. Zasniva se na povezivanju pojedinačnih lanaca nukleinskih kiselina u jednu molekulu. Tako se provjerava komplementarnost (međusobna korespondencija) molekula ili njihovih fragmenata međusobno. Uz potpunu komplementarnost, lanci se lako i brzo spajaju u zajedničku molekulu. Spora asocijacija ukazuje na nedovoljnu komplementarnost. Nekomplementarnost lanaca je upravo zbog hromozomskih abnormalnosti (kršenja redosleda rasporeda hromozoma u određenim područjima), nesparenih hromozoma ili odsustva nekih parova.

„Alat“ za mjerenje komplementarnosti je temperatura na kojoj se lanci DNK hibridiziraju u zajednički molekul. Da biste to učinili, prvo morate zagrijati preparat nukleinske kiseline, a zatim ga nakon miješanja sa drugim zagrijanim preparatom ohladiti. Kada se zagrije, vodikove veze između DNK ili RNK lanaca nestaju, formiraju se jednolančani fragmenti molekula. Pomešani preparati dve DNK ili RNK (ili DNK - RNK) se hlade. Kada se ohladi, vodonične veze između komplementarnih baza se brzo obnavljaju, formira se jedna, hibridna molekula DNK (RNA ili DNK - RNA). Uz nedostatak komplementarnosti, proces traje duže, nekomplementarni fragmenti ostaju nepovezani. Dakle, što je viša temperatura hibridizacije, to je harmoničnija i ispravnija hromozomska struktura ćelija. Što je temperatura niža, to je više abnormalnosti u hromozomima. Na osnovu analize nekomplementarnih ostataka mogu se identifikovati specifične anomalije ili područja aneuploidije.

Fluorescentno označavanje

Za analizu komplementarnosti hibridizirajućeg molekula DNK (ili RNK) koriste se posebne genetske sonde (ili DNK sonde), koje, naravno, također nemaju mnogo zajedničkog sa svojim imenjacima koji se koriste, na primjer, u hirurgiji.

Genetske sonde su sintetizovane i posebno obeležene jednolančane DNK (ređe RNK) sa unapred određenim svojstvima komplementarnosti. Kada se hibridiziraju, spajaju se s određenim genetskim fragmentima, čime se potvrđuje njihova komplementarnost. Položaj sondi u hibridiziranoj molekuli ukazuje na normalnu ili defektnu strukturu originalnog kromosomskog materijala od kojeg je sastavljena ova "vještačka struktura".

Genetske sonde su posebno označene svetlećim (fluorescentnim) supstancama, što ih čini vidljivim pod sočivom posebnog fluorescentnog mikroskopa.

Korištenje različitih boja za nekoliko sondi omogućava istovremenu analizu različitih genetskih struktura, na primjer, za identifikaciju hromozomskih regiona sa dva gena koji se nalaze jedan na drugom i druge anomalije.

Trenutno, kada se radi jedna analiza, genetske sonde su označene sa pet ili šest različitih boja, ponekad čak i sa sedam.

In-situ znači "kod kuće"

Originalna tehnika hibridizacije bila je glomazna. Ekstrahirana DNK je denaturirana u posebnim termalnim puferima, pomiješana u centrifugi sa drugim denaturiranim fragmentima. Hibridizacija je takođe obavljena u laboratoriji, "u hemijskom staklenom posuđu".

Savremena tehnologija omogućava izvođenje in situ analiza, odnosno "na licu mjesta", "kod kuće", u originalnim genetskim strukturama, a ne u laboratorijskim preparatima. Predmet istraživanja bila su sama jezgra ćelija (polarna tela, blastomeri, površinske ćelije blastociste ekstrahovane tokom biopsije).

Posmatranje genetskog materijala direktno u jezgri ćelija ubrzava proces, čini ga „čišćim“, slobodnim od vanjskih utjecaja i oštećenja, što nije isključeno u proizvodnji laboratorijskih preparata.

Međutim, postoje problemi koji ukazuju na nepremostiva ograničenja ove metode. Jedna hibridizacija ne može "pokriti" cijeli skup hromozoma u ćelijama. Obično su potrebne dvije ili tri uzastopne hibridizacije, što omogućava proučavanje 12-15 parova hromozoma (a kod ljudi ih ima 23). Sposobnost dalje hibridizacije u DNK lancima nakon svake rehibridizacije postepeno se smanjuje. Ovo ne dozvoljava hibridizaciju "koliko god puta želite" za iscrpnu analizu istog genetskog materijala.

FISH tehnika, Fluorescent in situ hibridizacija, razvijena je sredinom 1980-ih i koristi se za otkrivanje prisustva ili odsustva specifičnih sekvenci DNK na hromozomima, kao i alfa satelita DNK koji se nalazi na centromeri hromozoma 6, CEP6( 6p11.1-q11. jedan).

To je dalo značajan pomak u dijagnostici onkoloških bolesti melanocitnog porijekla zbog detekcije tumorskih antigena. Na pozadini maligniteta utvrđuje se mutacija u tri antigena: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) i CMM1(1p). S tim u vezi, mogućnost objektivne diferencijalne dijagnoze zasnovane na utvrđivanju genetskih karakteristika melanocitnih tumora kože je od velikog značaja u ranoj dijagnostici melanoma i njegovih prekursora.U jezgru sa normalnim skupom proučavanih gena i hromozomom 6. , dva gena RREB1 obojena crvenom bojom, dva gena MYB su uočena žutom, dva CCND1 gena zelenom i dvije centromere hromozoma 6 plavom. U dijagnostičke svrhe koriste se fluorescentni uzorci.

Evaluacija rezultata reakcije: prebrojava se broj crvenih, žutih, zelenih i plavih signala u 30 jezgara svakog uzorka, identificiraju se četiri parametra različitih varijanti genetskih poremećaja, u kojima je uzorak genetski konzistentan sa melanomom. Na primjer, uzorak odgovara melanomu ako je prosječan broj CCND1 gena po jezgru ≥2,5. Po istom principu se procjenjuje i broj kopija drugih gena. Lijek se smatra FISH-pozitivnim ako je ispunjen barem jedan od četiri uslova. Uzorci u kojima su sva četiri parametra ispod graničnih tačaka smatraju se FISH negativnim.

Određivanje specifičnih sekvenci DNK na hromozomima vrši se na rezovima biopsijskih uzoraka ili hirurškog materijala. U praktičnoj implementaciji, FISH reakcija je sljedeća: test materijal koji sadrži DNK u jezgri melanocita se obrađuje kako bi se djelimično uništio njegov molekul kako bi se razbila dvolančana struktura i time olakšao pristup željenom genskom području. Uzorci se klasifikuju prema mestu vezivanja za molekul DNK. Materijal za FISH reakciju u kliničkoj praksi su rezovi parafinskog tkiva, razmazi i otisci.

FISH reakcija vam omogućava da pronađete promjene koje su se dogodile u molekuli DNK kao rezultat povećanja broja kopija gena, gubitka gena, promjene broja kromosoma i kvalitativnih promjena - kretanja gena lokusi u istom hromozomu i između dva hromozoma.

Za obradu podataka dobijenih pomoću FISH reakcije i proučavanje odnosa između broja kopija gena tri proučavane grupe, koristi se Spearmanov koeficijent korelacije.

Melanom je karakteriziran povećanjem broja kopija u odnosu na nevus i displastični nevus.

Jednostavan nevus, u poređenju sa displastičnim nevusom, ima manje abnormalnosti u broju kopija (tj. više normalnih kopija).

Za izgradnju pravila odlučivanja za predviđanje pripada li uzorak određenoj klasi (diferencijalna dijagnoza jednostavnih i displastičnih nevusa), koristi se matematički aparat „drveta odlučivanja“. Ovaj pristup se dokazao u praksi, a rezultati primjene ove metode (za razliku od mnogih drugih metoda, kao što su neuronske mreže) mogu se jasno protumačiti za izgradnju pravila odlučivanja za razlikovanje jednostavnih, displastičnih nevusa i melanoma. Početni podaci u svim slučajevima bili su brojevi kopija četiri gena.

Zadatak konstruiranja pravila odlučivanja za diferencijalnu dijagnostiku podijeljen je u nekoliko faza. U prvoj fazi se razlikuju melanom i nevus, bez uzimanja u obzir vrste nevusa. U sljedećoj fazi gradi se pravilo odluke za razdvajanje jednostavnih i displastičnih nevusa. Konačno, u posljednjoj fazi, moguće je izgraditi "stablo odluke" za određivanje stepena displazije displastičnog nevusa.

Takva podjela zadatka razvrstavanja nevusa u podzadatke omogućava postizanje visoke točnosti predviđanja u svakoj od faza. Ulazni podaci za konstruisanje stabla odlučivanja su podaci o broju kopija četiri gena za pacijente sa dijagnozom melanoma i pacijente sa dijagnozom nemelanoma (pacijenti sa različitim tipovima nevusa – jednostavnim i displastičnim). Za svakog pacijenta dostupni su brojevi kopija gena za 30 ćelija.

Dakle, podjela zadatka predviđanja dijagnoze u nekoliko faza nam omogućava da izgradimo pravila visoke preciznosti ne samo za razlikovanje melanoma i nevusa, već i za određivanje tipa nevusa i predviđanje stupnja displazije za displastični nevus. Konstruirana "stabla odlučivanja" jasan su način za predviđanje dijagnoze na osnovu broja kopija gena i mogu se lako koristiti u kliničkoj praksi za razlikovanje benignih, premalignih i malignih melanocitnih tumora kože. Predložena dodatna metoda diferencijalne dijagnoze posebno je važna u eksciziji gigantskih kongenitalnih pigmentiranih nevusa i displastičnih nevusa kod pedijatrijskih pacijenata, budući da takvi pacijenti posjećuju medicinske ustanove s visokim postotkom dijagnostičkih grešaka. Rezultati primjene opisane metode su visoko učinkoviti, preporučljivo je koristiti je u dijagnostici pigmentiranih tumora kože, posebno kod pacijenata sa FAMM sindromom.

U svim slučajevima, bez izuzetka, formiranje i rast je povezan sa aktivnošću gena tipa HER2. On je taj koji je odgovoran za to koliko će proteina biti dodijeljeno ženskom tijelu za razvoj tkiva dojke. Kada se prve zdrave ćelije transformišu u maligne ćelije, genski receptori dobijaju informaciju da je potrebna dodatna podela ćelijskog materijala.

Gen pokreće program za izgradnju dodatnog tkiva unutar dojke, iako će u stvarnosti ovaj ćelijski materijal koristiti tumor za svoj rast i razvoj. Dakle, karcinom, zapravo, obmanjuje tijelo i tjera ga da hrani rak na račun vlastitih resursa.

Zadatak analize riba kod karcinoma dojke je upravo da se utvrdi neispravnost HER2 gena, te poduzmu odgovarajuće mjere odgovora u smislu propisivanja adekvatnog medicinskog liječenja.

Ako se riblji test ne izvrši pravovremeno na rak dojke, čak i ako se u procesu liječenja koriste određeni lijekovi, to može dovesti do činjenice da će se tumor nastaviti agresivno razvijati, pokrivajući sva nova tkiva dojke. To su takozvane posljedice pogrešno propisane terapije zbog nedostatka objektivnih podataka o funkcionisanju HER2 gena.

U procesu prolaska analize ribe, liječnik uvodi u krv pacijenta posebne tvari koje sadrže elemente za bojenje koji mogu vizualizirati sliku kromosomskih poremećaja. Tako je doktor u mogućnosti da vizuelno vidi i dalje proučava genetske abnormalnosti u genomu žene koje su dovele do razvoja raka dojke.

Ako se potvrde abnormalnosti u radu gena HER2, tada se propisuje odgovarajući tretman. Ako nije, onda doktor, koristeći druge testove, utvrđuje drugačiji razlog za razvoj raka dojke.

Još jedna bitna prednost analize ribe je da za nekoliko dana pacijent dobije sveobuhvatan izvještaj o genetskoj predispoziciji za razvoj određenog karcinoma. Uz pomoć ovog medicinskog testiranja moguće je istovremeno dijagnosticirati patologiju ne samo mliječne žlijezde, već i svih trbušnih organa.

Informativan video

Kao i tokom Southern blotting nukleotidne sonde se koriste za identifikaciju fragmenata DNK, citogenetičari mogu koristiti slične sonde za analizu hromozomskih aberacija. Da bi se to postiglo, sonde označene fluorescentnom bojom hibridiziraju se s DNK koja se nalazi u fiksnim hromozomima na staklenim predmetima.

Ova tehnika se zove Fluorescentna in situ hibridizacija (RIBA), budući da je , sadržan u interfaznom kromatinu ili u metafaznim hromozomima, fiksiran i denaturiran na staklu na jednom mjestu (tj. in situ), za obradu sa označenom sondom koja se hibridizira s hromozomskom DNK. Sonda fluorescira kada su hromozomi obasjani svetlošću na talasnoj dužini koja pobuđuje fluorescentnu boju. Položaj hibridizacionog signala, a time i položaj segmenta DNK sa hibridizovanom sondom, određuje se mikroskopski.

Obično za FISH analiza koristite sonde - fragmente DNK koji imaju jedinstvenu poziciju u hromozomu. Takve sonde prolaze kroz hibridizaciju i označavaju lokaciju na svakom homolognom hromozomu koja odgovara normalnom položaju sekvence sonde. FISH sonda također može biti složena mješavina DNK izvedene iz cijele ruke ili čak cijelog hromozoma. U zavisnosti od sastava sonde, prilikom hibridizacije sa njom, obeležava se ceo hromozom ili njegov deo.

Takve mješavine sonde poznate kao hromozomske sonde. Konačno, 24 različite hromozomske sonde označene različitim kombinacijama fluorescentnih boja koje emituju različite talasne dužine svetlosti mogu se kombinovati za svaki od 24 ljudska hromozoma. Svaki hromozom je označen sondom sa svojom karakterističnom kombinacijom talasnih dužina svetlosti. Sve 24 hromozomske sonde su objedinjene i korištene za FISH analizu metafaznih hromozoma. Ova tehnika je poznata kao spektralna kariotipizacija (SKY).

Pošto svaka sonda specifična za hromozom ima fluorescencija sa sopstvenom kombinacijom talasnih dužina, mutantni hromozomi, koji se sastoje od delova različitih hromozoma, dobro se razlikuju SKY analizom, a hromozomi uključeni u preuređenje mogu se lako identifikovati. FISH koji koristi jednu kontinualnu nukleotidnu sekvencu, hromozomske specifične sonde i SKY metodu sa kombinacijom sondi za sve hromozome naširoko se koristi u kliničkoj citogenetici za otkrivanje hromozomskih aberacija kao što su delecije, insercije i translokalizacije.

Fluorescentna in situ hibridizacija

Fluorescentna hibridizacija in situ , ili FISH metodom (eng. Fluorescencija in situ hibridizacija - RIBA ) - citogenetska metoda koja se koristi za otkrivanje i određivanje položaja specifične sekvence DNK na metafaznim hromozomima ili u interfaznim jezgrama in situ. Osim toga, FISH se koristi za otkrivanje specifičnih mRNA u uzorku tkiva. U potonjem slučaju, FISH metoda omogućava utvrđivanje prostorno-vremenskih karakteristika ekspresije gena u ćelijama i tkivima.

Sonde

Sa fluorescentnom hibridizacijom in situ koristite DNK sonde (DNK sonde) koje se vezuju za komplementarne mete u uzorku. DNK sonde sadrže nukleozide označene fluoroforima (direktno obilježavanje) ili konjugate kao što su biotin ili digoksigenin (indirektno obilježavanje). Sa direktnim obeležavanjem, DNK sonda vezana za metu može se posmatrati pomoću fluorescentnog mikroskopa odmah nakon završetka hibridizacije. U slučaju indirektnog obeležavanja, potrebna je dodatna procedura bojenja, tokom koje se detektuje biotin pomoću fluorescentno obeleženog avidina ili stepavidina, a digoksigenin korišćenjem fluorescentno obeleženih antitela. Iako indirektna verzija obeležavanja DNK uzoraka zahteva dodatne reagense i vreme, ova metoda obično postiže viši nivo signala zbog prisustva 3-4 fluorohroma molekula na antitelu ili molekulu avidina. Osim toga, u slučaju indirektnog označavanja moguće je kaskadno pojačanje signala.

Za kreiranje uzoraka DNK koriste se klonirane DNK sekvence, genomska DNK, produkti PCR reakcije, obilježeni oligonukleotidi i DNK dobivena mikrodisekcijom.

Obeležavanje sonde se može izvesti na različite načine, na primer, nick-translacijom ili PCR-om sa obeleženim nukleotidima.

Postupak hibridizacije

Šema eksperimenta fluorescentne hibridizacije in situ kako bi se lokalizirao položaj gena u jezgru

Prvi korak je dizajn sondi. Veličina sonde treba biti dovoljno velika da se hibridizacija dogodi na određenom mjestu, ali ne prevelika (ne više od 1 kb) kako ne bi ometala proces hibridizacije. Prilikom identifikacije specifičnih lokusa ili kod bojenja cijelih hromozoma, potrebno je blokirati hibridizaciju DNK sondi s nejedinstvenim repetitivnim sekvencama DNK dodavanjem neobilježenih DNK ponavljanja (na primjer, Cot-1 DNK) hibridizacionoj smjesi. Ako je DNK sonda dvolančana DNK, ona mora biti denaturirana prije hibridizacije.

U sljedećoj fazi pripremaju se preparati interfaznih jezgara ili metafaznih hromozoma. Ćelije se fiksiraju na podlogu, obično na stakalcu, nakon čega slijedi denaturacija DNK. Da bi se očuvala morfologija hromozoma ili jezgara, denaturacija se provodi u prisustvu formamida, što omogućava smanjenje temperature denaturacije na 70°.

Vizualizacija vezanih DNK sondi se izvodi pomoću fluorescentnog mikroskopa. Intenzitet fluorescentnog signala zavisi od mnogih faktora - efikasnosti obeležavanja sonde, tipa sonde i vrste fluorescentne boje.

Književnost

• Rubcov N.B. Metode rada sa hromozomima sisara: Proc. dodatak / Novosib. stanje un-t. Novosibirsk, 2006. 152 str.

• Rubcov N.B. Hibridizacija nukleinskih kiselina in situ u analizi hromozomskih abnormalnosti. Poglavlje u knjizi "Uvod u molekularnu dijagnostiku" tom 2. "Molekularno genetičke metode u dijagnostici nasljednih i onkoloških bolesti" / Ed. M.A. Paltseva, D.V. Zaletaev. Obrazovna literatura za studente medicinskih univerziteta. M.: Medicina, 2011. T. 2. S. 100–136.

Bilješke

Wikimedia fondacija. 2010 .

Pogledajte šta je "Fluorescentna in situ hibridizacija" u drugim rječnicima:

Ovaj izraz ima druga značenja, vidi hibridizacija. DNK hibridizacija, hibridizacija nukleinskih kiselina in vitro kombinacija komplementarnih jednolančanih nukleinskih kiselina u jednu molekulu. Sa potpunom komplementarnošću ... ... Wikipedia