Etapas del método de hibridación in situ fluorescente. Prueba FISH: diagnóstico rápido de cáncer. Vea qué es "hibridación fluorescente in situ" en otros diccionarios
FISH es una de las "herramientas" más asombrosas de la biología molecular en el siglo XXI. En el diagnóstico preimplantacional, la técnica de investigación FISH se utiliza para detectar anomalías cromosómicas o trastornos del apareamiento cromosómico en las células de un embrión recién obtenido mediante fecundación in vitro (FIV). Si no se encuentran anomalías o signos de aneuploidía (trastornos de emparejamiento, falta de pares de cromosomas), entonces el embrión "artificial" se considera viable. Se puede implantar en el útero de una futura madre.
FISH también permite rastrear las características sexuales en el juego de cromosomas del embrión. Esto hace posible determinar el sexo del feto incluso antes del inicio real del embarazo (si consideramos que es el comienzo de la implantación de un embrión concebido fuera del cuerpo en el útero).
¿Qué es PESCADO?
La abreviatura significa: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, o hibridación in situ fluorescente. Lo más probable es que la transcripción no le diga nada al lector ignorante. Por lo tanto, analizaremos el complejo concepto por partes, dejando para el final el “in-situ” sin traducir.
Hibridación
En biología molecular, este término tiene un significado muy especial, que no tiene nada que ver con el cruce de especies en la biología "ordinaria".
La hibridación es una técnica de genética molecular utilizada para evaluar el estado del ADN y el ARN de las células estudiadas. Se basa en la conexión de cadenas individuales de ácidos nucleicos en una sola molécula. Así, se comprueba la complementariedad (correspondencia mutua) de las moléculas o sus fragmentos entre sí. Con completa complementariedad, las cadenas se combinan fácil y rápidamente en una molécula común. La asociación lenta indica complementariedad insuficiente. La falta de complementariedad de las cadenas se debe precisamente a anomalías cromosómicas (violaciones en el orden de disposición de los cromosomas en ciertas áreas), cromosomas no apareados o ausencia de algunos pares.
La "herramienta" para medir la complementariedad es la temperatura a la que las hebras de ADN se hibridan en una molécula común. Para hacer esto, primero debe calentar la preparación de ácido nucleico y luego, después de mezclarla con otra preparación calentada, enfriarla. Cuando se calienta, los enlaces de hidrógeno entre las cadenas de ADN o ARN desaparecen y se forman fragmentos de moléculas de cadena sencilla. Las preparaciones mixtas de dos ADN o ARN (o ADN - ARN) se enfrían. Cuando se enfría, los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias se restauran rápidamente y se forma una única molécula de ADN híbrida (ARN o ADN - ARN). Con la falta de complementariedad, el proceso lleva más tiempo, los fragmentos no complementarios quedan sueltos. Por lo tanto, cuanto mayor sea la temperatura de hibridación, más armoniosa y correcta será la estructura cromosómica de las células. Cuanto más baja es la temperatura, más anormalidades en los cromosomas. Con base en el análisis de residuos no complementarios, se pueden identificar anomalías específicas o áreas de aneuploidía.
Etiquetado fluorescente
Para analizar la complementariedad de una molécula de ADN (o ARN) en hibridación, se utilizan sondas genéticas especiales (o sondas de ADN) que, por supuesto, también tienen poco en común con sus homónimos utilizados, por ejemplo, en cirugía.
Las sondas genéticas se sintetizan y etiquetan especialmente con ADN monocatenario (raramente ARN) con propiedades de complementariedad predeterminadas. Al hibridarse, se fusionan con ciertos fragmentos genéticos, confirmando así su complementariedad. La ubicación de las sondas en la molécula hibridada indica la estructura normal o defectuosa del material cromosómico original a partir del cual se ensambla esta "estructura artificial".
Las sondas genéticas están marcadas, en particular, con sustancias luminosas (fluorescentes), lo que las hace visibles bajo la lente de un microscopio fluorescente especial.
El uso de diferentes colorantes para varias sondas permite el análisis simultáneo de varias estructuras genéticas, por ejemplo, para identificar regiones cromosómicas con dos genes superpuestos entre sí y otras anomalías.
Actualmente, cuando se realiza un solo análisis, las sondas genéticas se marcan con cinco o seis colorantes diferentes, a veces incluso siete.
In-situ significa "en casa"
La técnica de hibridación original era engorrosa. El ADN extraído se desnaturalizó en tampones térmicos especiales, se mezcló en una centrífuga con otros fragmentos desnaturalizados. La hibridación también se llevó a cabo en el laboratorio, "en cristalería química".
La tecnología moderna permite realizar análisis in situ, es decir, "en el lugar", "en casa", en las estructuras genéticas originales y no en preparaciones de laboratorio. Los objetos de estudio fueron los propios núcleos celulares (cuerpos polares, blastómeros, células de superficie del blastocisto extraídas durante la biopsia).
La observación del material genético directamente en los núcleos de las células acelera el proceso, lo hace más "limpio", libre de influencias y daños externos, que no están excluidos en la fabricación de preparaciones de laboratorio.
Hay, sin embargo, problemas que apuntan a los límites infranqueables de este método. Una sola hibridación no puede "cubrir" todo el conjunto de cromosomas en las células. Suelen ser necesarias dos o tres hibridaciones sucesivas, lo que permite estudiar de 12 a 15 pares de cromosomas (y hay 23 en humanos). La capacidad de hibridación adicional en las cadenas de ADN después de cada rehibridación disminuye gradualmente. Esto no permite la hibridación "tantas veces como quieras" para un análisis exhaustivo del mismo material genético.
La técnica FISH, Hibridación fluorescente in situ, se desarrolló a mediados de la década de 1980 y se utiliza para detectar la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en los cromosomas, así como el satélite alfa del ADN ubicado en el centrómero del cromosoma 6, CEP6( 6p11.1-q11.uno).
Esto dio un giro significativo en el diagnóstico de enfermedades oncológicas de origen melanocítico debido a la detección de antígenos tumorales. En el contexto de la malignidad, se determina una mutación en tres antígenos: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) y CMM1 (1p). En este sentido, la posibilidad de un diagnóstico diferencial objetivo basado en la determinación de las características genéticas de los tumores melanocíticos de la piel es de gran importancia en el diagnóstico precoz del melanoma y sus precursores En el núcleo con un conjunto normal de los genes estudiados y el cromosoma 6 , dos genes RREB1 teñidos de rojo, se observan dos genes MYB en amarillo, dos genes CCND1 en verde y dos centrómeros del cromosoma 6 en azul. Para fines de diagnóstico, se utilizan muestras fluorescentes.
Evaluación de los resultados de la reacción: se cuenta el número de señales rojas, amarillas, verdes y azules en 30 núcleos de cada muestra, se identifican cuatro parámetros de diversas variantes de trastornos genéticos, en los que la muestra es genéticamente compatible con melanoma. Por ejemplo, una muestra corresponde a melanoma si el número medio del gen CCND1 por núcleo es ≥2,5. El número de copias de otros genes se estima según el mismo principio. Un fármaco se considera FISH positivo si se cumple al menos una de las cuatro condiciones. Las muestras en las que los cuatro parámetros están por debajo de los puntos de corte se consideran negativas para FISH.
La determinación de secuencias específicas de ADN en los cromosomas se realiza sobre secciones de muestras de biopsia o material quirúrgico. En la implementación práctica, la reacción FISH es la siguiente: el material de prueba que contiene ADN en los núcleos de los melanocitos se procesa para destruir parcialmente su molécula para romper la estructura de doble cadena y así facilitar el acceso a la región del gen deseada. Las muestras se clasifican según el lugar de unión a la molécula de ADN. El material para la reacción FISH en la práctica clínica son secciones de tejido en parafina, frotis e impresiones.
La reacción FISH le permite encontrar cambios que han ocurrido en la molécula de ADN como resultado de un aumento en la cantidad de copias de un gen, pérdida de un gen, un cambio en la cantidad de cromosomas y cambios cualitativos: el movimiento de un gen. loci tanto en el mismo cromosoma como entre dos cromosomas.
Para procesar los datos obtenidos mediante la reacción FISH y estudiar la relación entre el número de copias de los genes de los tres grupos estudiados se utiliza el coeficiente de correlación de Spearman.
El melanoma se caracteriza por un aumento en el número de copias en comparación con el nevo y el nevo displásico.
Un nevo simple, en comparación con un nevo displásico, tiene menos anomalías en el número de copias (es decir, más copias normales).
Para construir reglas de decisión para predecir si una muestra pertenece a una clase particular (diagnóstico diferencial de nevus simples y displásicos), se utiliza el aparato matemático de “árboles de decisión”. Este enfoque ha demostrado su eficacia en la práctica y los resultados de la aplicación de este método (a diferencia de muchos otros métodos, como las redes neuronales) se pueden interpretar claramente para crear reglas de decisión para diferenciar nevus simples, displásicos y melanoma. Los datos iniciales en todos los casos fueron los números de copias de cuatro genes.
La tarea de construir una regla de decisión para el diagnóstico diferencial se divide en varias etapas. En la primera etapa se diferencian melanoma y nevus, sin tener en cuenta el tipo de nevus. En la siguiente etapa, se construye una regla de decisión para separar los nevos simples y displásicos. Finalmente, en la última etapa, es posible construir un "árbol de decisión" para determinar el grado de displasia del nevus displásico.
Tal división de la tarea de clasificar los nevos en subtareas hace posible lograr una alta precisión de las predicciones en cada una de las etapas. Los datos de entrada para construir el árbol de decisión son datos sobre el número de copias de cuatro genes para pacientes diagnosticados con melanoma y pacientes diagnosticados con no melanoma (pacientes con varios tipos de nevo, simple y displásico). Para cada paciente, los números de copias de genes están disponibles para 30 células.
Por lo tanto, dividir la tarea de predecir un diagnóstico en varias etapas nos permite construir reglas de decisión de alta precisión no solo para diferenciar entre melanoma y nevus, sino también para determinar el tipo de nevus y predecir el grado de displasia para un nevus displásico. Los "árboles de decisión" construidos son una forma clara de predecir un diagnóstico basado en el número de copias de genes y se pueden usar fácilmente en la práctica clínica para diferenciar los tumores de piel melanocíticos benignos, premalignos y malignos. El método adicional propuesto de diagnóstico diferencial es especialmente importante en la escisión de nevos pigmentados congénitos gigantes y nevos displásicos en pacientes pediátricos, ya que dichos pacientes acuden a instituciones médicas con un alto porcentaje de errores diagnósticos. Los resultados del uso del método descrito son altamente efectivos, siendo recomendable su uso en el diagnóstico de tumores cutáneos pigmentados, especialmente en pacientes con síndrome FAMM.
En todos los casos, sin excepción, la formación y crecimiento está asociado a la actividad del gen tipo HER2. Es él quien es responsable de la cantidad de proteína que se asignará al cuerpo femenino para el desarrollo del tejido mamario. Cuando las primeras células sanas se transforman en malignas, los receptores de genes reciben información de que se requiere una división adicional del material celular.
El gen inicia un programa para construir tejido adicional dentro del seno, aunque en realidad este material celular será utilizado por el tumor para su crecimiento y desarrollo. Entonces, el carcinoma, de hecho, engaña al cuerpo y lo obliga a alimentar el cáncer a expensas de sus propios recursos.
La tarea del análisis de peces en el cáncer de mama es precisamente identificar el mal funcionamiento del gen HER2 y tomar las medidas de respuesta adecuadas en términos de prescribir el tratamiento médico adecuado.
Si una prueba de peces no se lleva a cabo de manera oportuna para el cáncer de mama, incluso si se usan ciertos medicamentos en el proceso de tratamiento, esto puede llevar al hecho de que el tumor continuará desarrollándose agresivamente, cubriendo todos los tejidos mamarios nuevos. Estas son las llamadas consecuencias de la terapia prescrita incorrectamente debido a la falta de datos objetivos sobre el funcionamiento del gen HER2.
En el proceso de pasar el análisis de pescado, el médico introduce en la sangre del paciente sustancias especiales que contienen elementos colorantes que pueden visualizar la imagen de los trastornos cromosómicos. Por lo tanto, el médico puede ver visualmente y estudiar más a fondo las anomalías genéticas en el genoma de la mujer que llevaron al desarrollo del cáncer de mama.
Si se confirman anomalías en el trabajo del gen HER2, se prescribe el tratamiento adecuado. De lo contrario, el médico, utilizando otras pruebas, establece una razón diferente para el desarrollo del cáncer de mama.
Otra ventaja importante del análisis de peces es que en un par de días el paciente recibe un informe completo sobre la predisposición genética al desarrollo de un cáncer en particular. Con la ayuda de esta prueba médica, es posible diagnosticar simultáneamente la patología no solo de la glándula mamaria, sino también de todos los órganos abdominales.
vídeo informativo
Así como durante transferencia del sur las sondas de nucleótidos se usan para identificar fragmentos de ADN, los citogenetistas pueden usar sondas similares para analizar las aberraciones cromosómicas. Para ello, se hibridan sondas marcadas con un colorante fluorescente con ADN contenido en cromosomas fijados en portaobjetos de vidrio.
Esta técnica se llama Hibridación in situ fluorescente (PEZ), ya que el , contenido en la cromatina en interfase o en los cromosomas en metafase, se fija y desnaturaliza sobre el vidrio en un lugar (es decir, in situ), para su procesamiento con una sonda marcada que se hibrida con el ADN cromosómico. La sonda emite fluorescencia cuando los cromosomas se iluminan con luz a una longitud de onda que excita el tinte fluorescente. La posición de la señal de hibridación y, por lo tanto, la posición del segmento de ADN con la sonda hibridada se determina microscópicamente.
por lo general para Análisis FISH use sondas: fragmentos de ADN que tienen una posición única en el cromosoma. Dichas sondas experimentan hibridación y marcan la ubicación en cada cromosoma homólogo correspondiente a la posición normal de la secuencia de la sonda. Una sonda FISH también puede ser una mezcla compleja de ADN derivado de un brazo completo o incluso de un cromosoma completo. Dependiendo de la composición de la sonda, durante la hibridación con ella, se marca todo el cromosoma o parte de él.
tales mezclas sondas conocidas como sondas cromosómicas. Finalmente, se pueden combinar 24 sondas cromosómicas diferentes marcadas con diferentes combinaciones de tintes fluorescentes que emiten diferentes longitudes de onda de luz para cada uno de los 24 cromosomas humanos. Cada cromosoma está marcado con una sonda con su propia combinación característica de longitudes de onda de luz. Las 24 sondas cromosómicas se agrupan y se utilizan para el análisis FISH de los cromosomas en metafase. Esta técnica se conoce como cariotipo espectral (SKY).
Dado que cada sonda específica de cromosoma tiene fluorescencia con su propia combinación de longitudes de onda, los cromosomas mutantes, que consisten en partes de diferentes cromosomas, se distinguen bien mediante el análisis SKY, y los cromosomas incluidos en el reordenamiento se pueden identificar fácilmente. FISH que utiliza una única secuencia de nucleótidos contigua, sondas específicas de cromosomas y el método SKY con una combinación de sondas para todos los cromosomas se utilizan ampliamente en citogenética clínica para detectar aberraciones cromosómicas como deleciones, inserciones y translocalizaciones.
Hibridación in situ fluorescente
Hibridación fluorescente en el lugar , o el método FISH (ing. Fluorescencia en el lugar hibridación - PECES ) - un método citogenético que se utiliza para detectar y determinar la posición de una secuencia de ADN específica en los cromosomas en metafase o en los núcleos en interfase en el lugar. Además, FISH se usa para detectar ARNm específicos en una muestra de tejido. En este último caso, el método FISH permite establecer características espaciotemporales de la expresión génica en células y tejidos.
Sondas
Con hibridación fluorescente en el lugar utilice sondas de ADN (sondas de ADN) que se unen a dianas complementarias en la muestra. Las sondas de ADN contienen nucleósidos marcados con fluoróforos (marcado directo) o conjugados como biotina o digoxigenina (marcado indirecto). Con el marcado directo, la sonda de ADN unida al objetivo se puede observar usando un microscopio fluorescente inmediatamente después de que se complete la hibridación. En el caso del marcaje indirecto, se requiere un procedimiento de tinción adicional, durante el cual se detecta la biotina usando avidina o estepavidina marcadas con fluorescencia, y la digoxigenina usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Aunque la versión indirecta de marcar muestras de ADN requiere tiempo y reactivos adicionales, este método generalmente logra un nivel de señal más alto debido a la presencia de 3 o 4 moléculas de fluorocromo en una molécula de anticuerpo o avidina. Además, en el caso del marcaje indirecto, es posible la amplificación en cascada de la señal.
Para crear muestras de ADN, se utilizan secuencias de ADN clonado, ADN genómico, productos de reacción de PCR, oligonucleótidos marcados y ADN obtenido por microdisección.
El marcaje de la sonda puede llevarse a cabo de varias formas, por ejemplo, mediante traducción de muescas o mediante PCR con nucleótidos marcados.
Procedimiento de hibridación
Esquema del experimento sobre hibridación fluorescente. en el lugar para localizar la posición del gen en el núcleo
El primer paso es el diseño de las sondas. El tamaño de la sonda debe ser lo suficientemente grande para que se produzca la hibridación en un sitio específico, pero no demasiado grande (no más de 1 kb) para no interferir con el proceso de hibridación. Al identificar loci específicos o al teñir cromosomas completos, es necesario bloquear la hibridación de sondas de ADN con secuencias de ADN repetitivas no únicas agregando repeticiones de ADN no marcadas (por ejemplo, ADN Cot-1) a la mezcla de hibridación. Si la sonda de ADN es ADN de doble cadena, debe desnaturalizarse antes de la hibridación.
En la siguiente etapa, se preparan preparaciones de núcleos en interfase o cromosomas en metafase. Las células se fijan en un sustrato, generalmente en un portaobjetos de vidrio, seguido de la desnaturalización del ADN. Para conservar la morfología de los cromosomas o de los núcleos, la desnaturalización se realiza en presencia de formamida, lo que permite reducir la temperatura de desnaturalización a 70°.
La visualización de las sondas de ADN unidas se lleva a cabo utilizando un microscopio fluorescente. La intensidad de la señal fluorescente depende de muchos factores: la eficiencia de etiquetado de la sonda, el tipo de sonda y el tipo de tinte fluorescente.
Literatura
- Rubtsov N.B. Métodos de trabajo con cromosomas de mamíferos: Proc. subsidio / Novosib. estado un-t. Novosibirsk, 2006. 152 págs.
- Rubtsov N.B. Hibridación de ácidos nucleicos en el lugar en el análisis de anomalías cromosómicas. Capítulo del libro "Introducción al diagnóstico molecular" Vol. 2. "Métodos de genética molecular en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y oncológicas" / Ed. MAMÁ. Paltseva, DV Zaletaev. Literatura educativa para estudiantes de universidades médicas. M.: Medicina, 2011. T. 2. S. 100–136.
notas
Fundación Wikimedia. 2010 .
Vea qué es "hibridación fluorescente in situ" en otros diccionarios:
Este término tiene otros significados, véase hibridación. Hibridación de ADN, hibridación de ácidos nucleicos combinación in vitro de ácidos nucleicos monocatenarios complementarios en una molécula. Con completa complementariedad ... ... Wikipedia