Reacción en cadena de la polimerasa, su esencia y aplicaciones. PCR: ¿qué es? Diagnóstico de enfermedades infecciosas por reacción en cadena de la polimerasa Reacción en cadena de la polimerasa PCR

La realización de análisis de PCR (diagnóstico de PCR) comienza con la recopilación de material para que lo examine un ginecólogo, urólogo o dermatovenereólogo. La calidad y la fiabilidad de los resultados obtenidos posteriormente están garantizadas por las más altas calificaciones y la vasta experiencia de los médicos del centro médico Euromedprestige, que observan todas las reglas necesarias para realizar análisis de PCR: esterilidad completa, uso de materiales exclusivamente desechables.

El material recogido del cepillo se coloca en un recipiente con solución salina. Después del muestreo, las muestras deben entregarse al laboratorio de PCR lo antes posible.

El análisis de PCR en el laboratorio se lleva a cabo en tres etapas:

  1. aislamiento de ADN
  2. Amplificación de fragmentos de ADN
  3. Detección de productos de amplificación de ADN

La extracción de ADN es la etapa inicial del diagnóstico por PCR, cuya esencia es la siguiente: el médico toma el material para la investigación del paciente y lo somete a un procesamiento especial. Durante el procesamiento, la doble hélice del ADN se divide en hebras separadas. Se agrega un líquido especial al material del paciente, que disuelve las sustancias orgánicas que interfieren con la "pureza" de la reacción. Esto elimina lípidos, aminoácidos, péptidos, carbohidratos, proteínas y polisacáridos. El resultado es ADN o ARN.

El principio del método PCR es "construir" nuevas infecciones de ADN o ARN. Esto no se puede hacer sin la eliminación de material celular.

La cantidad de tiempo dedicado a la extracción de ADN depende del agente causante de la infección y del tipo de material utilizado para la prueba de PCR. Por ejemplo, se tarda de 1,5 a 2 horas en preparar la sangre para el siguiente paso.

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amplificación de ADN

Para llevar a cabo la siguiente etapa del diagnóstico de ADN, la amplificación de ADN, los médicos utilizan las llamadas matrices de ADN, moléculas de ADN de infecciones, en las que posteriormente se realizará la "clonación" de ADN. Ya se ha mencionado que no es necesaria la presencia del ADN completo de la infección, para esta etapa es suficiente un pequeño trozo de la molécula de ADN, que es exclusivo de este microbio (infección).

En el corazón de la amplificación del ADN y, en consecuencia, en el corazón de todo el principio de la reacción de PCR se encuentra el proceso natural de finalización del ADN para todos los seres vivos: la replicación del ADN, que se lleva a cabo mediante la duplicación de una sola cadena de ADN.

A partir de un solo fragmento de ADN, el médico del laboratorio lo copia y aumenta el número de copias en una reacción en cadena: después del primer ciclo ya tienes 2 fragmentos, después del segundo ciclo - 4, después del tercero - 8, después del cuarto - 16, luego 32, 64, 128, 256... Con cada ciclo, el número de copias se duplica, y después de veinte ciclos, la cuenta pasa a millones, y después de treinta, a miles de millones. El ciclo dura unos minutos y se reduce a un cierto cambio en el régimen de temperatura en un reactor químico muy pequeño. Aquí, en una solución en cantidades suficientes, se encuentran todos los componentes necesarios de la síntesis, en primer lugar, los nucleótidos A, G, T y C, y también se llevaron a cabo finas operaciones químicas preparatorias para que inmediatamente se hiciera una copia exacta de cada segmento de ADN terminado, luego de esta copia, nuevamente una copia, esta es la reacción en cadena ramificada.

Al unir los cebadores a la cadena de ADN, "piezas" de ADN sintetizadas artificialmente (pares de nucleótidos) similares al ADN de los microbios (infección), se forman dos hélices cortas, que consisten en dos cadenas de secciones de ADN, que son necesarias para la síntesis. del futuro ADN.

La síntesis de una nueva cadena ocurre al completar cada una de las dos hebras de ADN. El proceso de amplificación ocurre con la ayuda de un sitio específico: la ADN polimerasa, que dio nombre al método de laboratorio. La polimerasa actúa como catalizador de la reacción y controla la unión secuencial de las bases de nucleótidos a la nueva cadena de ADN en crecimiento.

Por lo tanto, la amplificación de ADN es un aumento múltiple en el número de copias de ADN que son específicas, es decir, inherentes solo a un organismo en particular. No es necesario completar toda la cadena de ADN para ver el agente causante de la infección. Solo se necesita el área que es característica de esta bacteria como individuo.

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Todos los pasos de amplificación, numerosos y repetitivos, ocurren a diferentes temperaturas. Para el análisis de PCR, se utilizan equipos especialmente programables, PCR, un termostato o un amplificador, que cambia automáticamente las temperaturas. La amplificación se lleva a cabo según un programa predeterminado correspondiente al tipo de infección que se detecta. Según el programa y el tipo de infección que se detecte, el proceso de PCR automatizado demora de 2 a 3 horas.

La calificación del asistente de laboratorio que realiza el análisis juega un papel importante en el diagnóstico de PCR, la configuración correcta del equipo de PCR y la interpretación de los resultados dependen de ello. Los médicos del Centro Médico Euromedprestige tienen una amplia experiencia en la realización de diagnósticos de ADN, lo que asegura la fiabilidad de los resultados del estudio y garantiza el éxito positivo en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Superar pruebas PCR y realizar un completo diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas en nuestro centro médico "Euromedprestige".

Durante la detección de productos de amplificación, la mezcla resultante de productos de amplificación se separa. Se agregan soluciones especiales a la mezcla, que dotan a los fragmentos de ADN de la capacidad de fluorescencia: reflejan rayas luminosas de color rojo anaranjado. El brillo resultante indica la presencia de ADN de virus, microbios o bacterias en el material extraído del paciente para el análisis de PCR.

Recientemente, se ha desarrollado un método fiable, muy sensible y rápido para diagnosticar varias enfermedades infecciosas humanas. Este método se llama "análisis PCR". Qué es, cuál es su esencia, qué microorganismos puede revelar y cómo tomarlo correctamente, lo contaremos en nuestro artículo.

Historial de descubrimiento


Además, los métodos de PCR se utilizan en el diagnóstico del cáncer.

Ventajas del método

El diagnóstico por PCR tiene varias ventajas:

  1. Alta sensibilidad. Incluso en presencia de solo unas pocas moléculas de ADN de microorganismos, el análisis de PCR determina la presencia de infección. El método ayudará con enfermedades crónicas y latentes. A menudo, en tales casos, el microorganismo no se cultiva.
  2. Cualquier material es adecuado para la investigación, por ejemplo, saliva, sangre, secreciones genitales, cabello, células epiteliales. El más común es un análisis de sangre y un frotis urogenital para PCR.

  3. No se requiere el cultivo a largo plazo de cultivos. El proceso de diagnóstico automatizado le permite obtener los resultados del estudio después de 4-5 horas.
  4. El método es casi 100% fiable. Solo se han registrado casos aislados de resultados falsos negativos.
  5. Posibilidad de identificar varios tipos de patógenos a partir de una muestra de material. Esto no solo acelera el proceso de diagnóstico de la enfermedad, sino que también reduce significativamente los costos de material. A menudo, el médico prescribe un análisis completo de PCR. El precio del examen, que consiste en la determinación de seis patógenos, es de unos 1.500 rublos.

    6. Para que los resultados sean confiables durante el estudio de PCR, es necesario pasar el análisis, siguiendo las recomendaciones de preparación preliminar para el diagnóstico:

    1. Antes de donar saliva, debe abstenerse de comer y tomar medicamentos 4 horas antes de tomar el material. Inmediatamente antes del procedimiento, enjuáguese la boca con agua hervida.
    2. Las reglas anteriores también deben seguirse al tomar una muestra de la superficie interna de la mejilla. Después del enjuague, se recomienda realizar un ligero masaje en la piel para resaltar el secreto de la glándula.
    3. La orina generalmente se recolecta en casa. Para hacer esto, debe realizar un baño completo de los genitales. Recoja 50-60 ml de orina en un recipiente de plástico estéril. Para garantizar la pureza del material, se recomienda que las mujeres inserten un tampón en la vagina y que los hombres tiren del pliegue de la piel tanto como sea posible. No se puede tomar el material durante el flujo menstrual.
    4. Para donar semen, debe abstenerse de tener relaciones sexuales durante 3 días antes de recolectar el material. Los médicos también desaconsejan visitar la sauna y tomar un baño caliente, beber alcohol y comida picante. 3 horas antes del análisis, debe abstenerse de orinar.
    5. Para el parto, por ejemplo, si se realiza una prueba PCR para clamidia, se recomienda tanto a mujeres como a hombres tener reposo sexual durante 3 días. Los medicamentos antibacterianos no deben tomarse 2 semanas antes del análisis. Durante una semana, debe dejar de usar geles íntimos, ungüentos, óvulos vaginales, duchas vaginales. 3 horas antes del examen, debe abstenerse de orinar. Durante la menstruación, el muestreo de material no se lleva a cabo, solo 3 días después del cese de la descarga de sangre, puede tomar un frotis urogenital.

    PCR durante el embarazo

    Durante la espera de un bebé, muchas infecciones de transmisión sexual son extremadamente peligrosas para el desarrollo normal del feto. Las ETS pueden provocar retraso del crecimiento intrauterino, aborto espontáneo o parto prematuro, malformaciones congénitas del niño. Por lo tanto, es extremadamente importante someterse a un examen de PCR al principio del embarazo. Es necesario pasar el análisis al registrarse, hasta 12 semanas.

    El material se extrae del canal cervical con un cepillo especial. El procedimiento es indoloro y no representa un peligro para el bebé. Por lo general, durante el embarazo, se realiza un análisis de clamidia por el método de PCR, así como de ureaplasmosis, micoplasmosis, citomegalovirus, herpes, papilomavirus. Tal complejo de exámenes se llama PCR-6.

    PCR para diagnóstico de VIH

    Debido al hecho de que el método es muy sensible a los cambios en el cuerpo y las condiciones del diagnóstico, muchos factores pueden afectar el resultado. Por lo tanto, el análisis de PCR para la infección por VIH no es un método confiable, su eficiencia es del 96-98%. En el 2-4% restante de los casos, la prueba da resultados falsos positivos.

    Pero en algunas situaciones, uno no puede prescindir del diagnóstico de PCR del VIH. Por lo general, se administra a personas con un resultado ELISA falso negativo. Dichos indicadores indican que una persona aún no ha desarrollado anticuerpos contra el virus y no se pueden detectar sin un aumento múltiple en el número. Esto es exactamente lo que se puede lograr al realizar un análisis de sangre utilizando el método PCR.

    Dicho diagnóstico también es necesario para los niños de primer año de vida nacidos de una madre seropositiva. El método es la única forma de determinar de manera confiable el estado de un niño.

    PCR para el diagnóstico de hepatitis

    El método de reacción en cadena de la polimerasa permite detectar el ADN del virus de la hepatitis A, B, C mucho antes de la formación de anticuerpos contra la infección o la aparición de los síntomas de la enfermedad. El análisis de PCR para la hepatitis C es especialmente efectivo, ya que en el 85% de los casos esta enfermedad es asintomática y, sin un tratamiento oportuno, pasa a la etapa crónica.

    La detección oportuna del patógeno ayudará a evitar complicaciones y tratamientos a largo plazo.

    Examen completo de PCR

    Análisis PCR integral: examen por el método de reacción en cadena polimérica, que incluye la determinación de varios tipos de infecciones simultáneamente: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, citomegalovirus, herpes tipos 1 y 2, gonorrea, papilomavirus. El precio de tales diagnósticos oscila entre 2000 y 3500 rublos. dependiendo de la clínica, los materiales y equipos utilizados, así como del tipo de análisis: cualitativo o cuantitativo. Lo que es necesario en su caso: el médico decidirá. En algunos casos, basta con determinar la presencia del patógeno, en otros, por ejemplo, con la infección por VIH, un título cuantitativo juega un papel importante. Al diagnosticar todos los patógenos anteriores, el examen se denomina "análisis PCR-12".

    Descifrando los resultados del análisis.

    Descifrar el análisis de PCR no es difícil. Solo hay 2 escalas del indicador: "resultado positivo" y "resultado negativo". Cuando se detecta un patógeno, los médicos pueden confirmar la presencia de la enfermedad con un 99 % de certeza y comenzar a tratar al paciente. Con un método cuantitativo para determinar la infección, la columna correspondiente indicará el indicador numérico de bacterias detectadas. Solo un médico puede determinar el grado de la enfermedad y prescribir el tratamiento necesario.

    En algunos casos, por ejemplo, al determinar la infección por VIH por PCR, con un resultado negativo, es necesario realizar exámenes adicionales para confirmar los indicadores obtenidos.

    ¿Dónde llevar el análisis?

    ¿Dónde realizar un análisis PCR: en una clínica pública o en un laboratorio privado? Desafortunadamente, en las instituciones médicas municipales, el equipo y los métodos suelen estar desactualizados. Por lo tanto, es mejor dar preferencia a laboratorios privados con equipos modernos y personal altamente calificado. Además, en una clínica privada obtendrás resultados mucho más rápido.

    En Moscú, muchos laboratorios privados ofrecen análisis de PCR para diversas infecciones. Por ejemplo, en clínicas como Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, se lleva a cabo el análisis de PCR. El precio del examen es de 200 rublos. para la identificación de un único patógeno.

    Se puede concluir que el diagnóstico de enfermedades infecciosas por PCR en la mayoría de los casos es una forma rápida y confiable de detectar el patógeno en el organismo en las primeras etapas de la infección. Pero aún así, en ciertos casos, vale la pena elegir otros métodos de diagnóstico. Solo un especialista puede determinar la necesidad de dicho estudio. Descifrar el análisis PCR también requiere un enfoque profesional. Siga las instrucciones de su médico y no se haga pruebas que no necesite.


PRINCIPIO DEL MÉTODO (base biológica molecular)

Entre la amplia variedad de métodos de hibridación para el análisis de ADN, la PCR es la más utilizada en el diagnóstico de laboratorio clínico.

Principio del método reacción en cadena de la polimerasa (PCR)(Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) fue desarrollado por Cary Mullis (Cetus, EE. UU.) en 1983. y actualmente es muy utilizado tanto para la investigación científica como para el diagnóstico en la práctica asistencial y del servicio de Supervisión Sanitaria y Epidemiológica del Estado (genotipado, diagnóstico de enfermedades infecciosas).

El método de PCR se basa en un proceso natural: finalización complementaria de la plantilla de ADN, que se lleva a cabo con la ayuda de la enzima ADN polimerasa. Esta reacción se llama replicación del ADN.

La replicación natural del ADN implica varios pasos:

1) desnaturalización del ADN(desenrollamiento de la doble hélice, divergencia de hebras de ADN);

2) Formación de segmentos cortos de ADN de doble cadena.(semillas requeridas para iniciar la síntesis de ADN);

3) Síntesis de una nueva hebra de ADN(completación complementaria de ambos hilos)

Este proceso se puede utilizar para obtener copias segmentos cortos de ADN específicos de microorganismos específicos, esos. para llevar a cabo una búsqueda específica de dichas áreas específicas, que es el objetivo del diagnóstico genético para identificar patógenos de enfermedades infecciosas.

Descubrimiento de ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa) de bacterias termófilas Termis acuática, cuyo óptimo está en la región de 70-72°C, hizo posible hacer cíclico el proceso de replicación del ADN y utilizarlo para el trabajo in vitro. La creación de termostatos programables (amplificadores), que, de acuerdo con un programa dado, realizan cambios de temperatura cíclicos, creó los requisitos previos para la introducción generalizada del método PCR en la práctica del diagnóstico clínico de laboratorio. Con la repetición repetida de ciclos de síntesis, se produce un aumento exponencial en el número de copias de un fragmento de ADN específico, lo que permite obtener un número suficiente de copias de ADN a partir de una pequeña cantidad del material analizado, que puede contener células individuales de microorganismos. , para su identificación por electroforesis.

La finalización complementaria de la cadena no comienza en ningún punto de la secuencia de ADN, sino solo en ciertos bloques de inicio: secciones cortas de doble cadena. Al unir tales bloques a regiones específicas de ADN, es posible dirigir el proceso de síntesis de una nueva hebra solo en esta región, y no a lo largo de toda la longitud de la hebra de ADN. Para crear bloques de partida en regiones de ADN dadas, se utilizan dos cebadores de oligonucleótidos (20 pares de nucleótidos), llamados cebadores Los cebadores son complementarios a las secuencias de ADN en los límites izquierdo y derecho de un fragmento específico y están orientados de tal manera que la finalización de una nueva hebra de ADN ocurre solo entre ellos.

Por lo tanto, la PCR es un aumento múltiple en el número de copias (amplificación) de una región de ADN específica catalizada por la enzima ADN polimerasa.

Los siguientes componentes son necesarios para la amplificación:

Una mezcla de desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP)(una mezcla de cuatro dNTP, que son el material para la síntesis de nuevas hebras de ADN complementarias)

Enzima Taq polimerasa(una polimerasa de ADN termoestable que cataliza el alargamiento de cadenas de cebadores agregando secuencialmente bases de nucleótidos a una cadena creciente de ADN sintetizado).

solución tampón(medio de reacción que contiene iones Mg2+ necesarios para mantener la actividad enzimática)
Para determinar regiones específicas del genoma de virus que contienen ARN, primero se obtiene una copia de ADN a partir de una plantilla de ARN utilizando una reacción de transcripción inversa (RT) catalizada por la enzima transcriptasa inversa (transcriptasa inversa).

Para obtener un número suficiente de copias del fragmento de ADN característico deseado, la amplificación incluye varios (20-40) ciclos.



Cada ciclo de amplificación incluye 3 etapas que se desarrollan en diferentes condiciones de temperatura

Paso 1: Desnaturalización del ADN(desenrollamiento de doble hélice). Fluye a 93-95°C durante 30-40 segundos.

Etapa 2: Fijación de imprimaciones (recocido). La unión del cebador se produce de manera complementaria a las secuencias correspondientes en hebras de ADN opuestas en los límites de un sitio específico. Cada par de primers tiene su propia temperatura de recocido, cuyos valores están en el rango de 50-65°C. Tiempo de recocido -20-60 seg.

Etapa 3: Construcción de cadenas de ADN. La terminación complementaria de las cadenas de ADN ocurre desde el extremo 5' hasta el extremo 3' de la cadena en direcciones opuestas, comenzando desde los sitios de unión del cebador. El material para la síntesis de nuevas cadenas de ADN son los trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) añadidos a la solución. El proceso de síntesis es catalizado por la enzima ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa) y tiene lugar a una temperatura de 70-72°C. Tiempo de síntesis - 20-40 seg.






Las nuevas cadenas de ADN formadas en el primer ciclo de amplificación sirven como moldes para el segundo ciclo de amplificación, en el que se forma el fragmento de ADN específico deseado (amplicón). (ver figura 2). En ciclos de amplificación posteriores, los amplicones sirven como molde para la síntesis de nuevas cadenas. Así, la acumulación de amplicones en solución ocurre según la fórmula 2n, donde n es el número de ciclos de amplificación. Por lo tanto, incluso si solo una molécula de ADN de doble cadena estuviera inicialmente presente en la solución inicial, alrededor de 108 moléculas de amplicón se acumulan en la solución después de 30 a 40 ciclos. Esta cantidad es suficiente para la detección visual fiable de este fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa. El proceso de amplificación se lleva a cabo en un termostato programable especial (amplificador), que, de acuerdo con un programa dado, cambia automáticamente las temperaturas de acuerdo con el número de ciclos de amplificación.

ETAPAS DE PCR - ANÁLISIS


El método PCR, como herramienta de diagnóstico de laboratorio para enfermedades infecciosas, se basa en la detección de un pequeño fragmento de ADN del patógeno (varios cientos de pares de bases), específico solo para este microorganismo, utilizando una reacción en cadena de la polimerasa para acumular el fragmento deseado.
La técnica de análisis mediante el método PCR incluye tres etapas:

1. Aislamiento de ADN (ARN) de una muestra clínica


2. Amplificación de fragmentos de ADN específicos
3. Detección de productos de amplificación

Aislamiento de ADN (ARN)
En esta etapa del análisis, la muestra clínica se somete a un procesamiento especial, que da como resultado la lisis del material celular, la eliminación de fracciones de proteínas y polisacáridos, y la preparación de una solución de ADN o ARN libre de
inhibidores y listo para una mayor amplificación.
La elección de la técnica de extracción de ADN (ARN) está determinada principalmente por la naturaleza del material clínico procesado.

Amplificación de fragmentos de ADN específicos
En esta etapa, los fragmentos cortos de ADN específicos se acumulan en la cantidad necesaria para su posterior detección. La mayoría de los métodos para determinar fragmentos específicos del genoma utilizan los llamados. “una versión clásica de la PCR guiada. Para aumentar la especificidad y la sensibilidad del análisis, algunos métodos utilizan el método de PCR "anidado", que utiliza 2 pares de cebadores ("externos" - para la primera etapa e "internos" - para la segunda etapa).

Detección de productos de amplificación
En la mayoría de las técnicas, en esta etapa, la mezcla de productos de amplificación obtenidos en la 2ª etapa se separa mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa. Antes de la separación electroforética, se agrega una solución de bromuro de etidio a la mezcla de amplificación, que forma fuertes uniones intersticiales con fragmentos de ADN de doble cadena. Estos compuestos, bajo la acción de la radiación UV, pueden emitir fluorescencia, lo que se registra como bandas luminosas de color rojo anaranjado después de la separación electroforética de la mezcla de amplificación en gel de agarosa.

Como alternativa al método electroforético de detección, que tiene algunas desventajas: subjetividad en la lectura de los resultados, se pueden proponer restricciones en la determinación del ADN de varios microorganismos en una reacción. esquemas de detección de hibridación. En estos esquemas, el fragmento de ADN resultante de la amplificación se hibrida (forma complejos de 2 cadenas - "híbridos") con una sonda de oligonucleótido específica. El registro de tales complejos se puede realizar colorimétricamente o fluorimétricamente. SPC "Litekh" creó kits de detección basados ​​en hibridación con registro fluorimétrico de resultados

VENTAJAS DEL MÉTODO PCR como método de diagnóstico de enfermedades infecciosas:

- Detección directa de la presencia de patógenos

Muchos métodos de diagnóstico tradicionales, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, detectan proteínas marcadoras que son productos de desecho de agentes infecciosos, lo que proporciona solo evidencia indirecta de la presencia de una infección. La identificación de una región de ADN específica del patógeno por PCR da una indicación directa de la presencia del agente infeccioso.



- Alta especificidad
La alta especificidad del método de PCR se debe al hecho de que en el material de prueba se detecta un fragmento de ADN único característico solo para este patógeno. La especificidad está determinada por la secuencia de nucleótidos de los cebadores, que excluye
la posibilidad de obtener resultados falsos, a diferencia del método de inmunoensayo enzimático, donde los errores no son infrecuentes debido a la reacción cruzada de los antígenos.

- Alta sensibilidad
El método PCR le permite detectar incluso células individuales de bacterias o virus. El diagnóstico por PCR detecta la presencia de patógenos de enfermedades infecciosas en los casos en que otros métodos (inmunológicos, bacteriológicos,
microscópico) es imposible. La sensibilidad del análisis PCR es de 10-1000 células por muestra (la sensibilidad de las pruebas inmunológicas y microscópicas es de 103-105 células).

-Universalidad del procedimiento de identificación de diversos patógenos
El material para el estudio por PCR es el ADN del patógeno. El método se basa en la detección de un fragmento de ADN o ARN que es específico de un organismo en particular. La similitud de la composición química de todos los ácidos nucleicos permite el uso de métodos unificados para la investigación de laboratorio. Esto hace posible diagnosticar varios patógenos a partir de un bioensayo. Varias secreciones biológicas (moco, orina, esputo), raspados de células epiteliales, sangre, suero pueden usarse como material de prueba.

- Alta velocidad de obtención del resultado del análisis
El análisis de PCR no requiere el aislamiento y cultivo del patógeno, lo que lleva mucho tiempo. Un método unificado para el procesamiento de biomateriales y la detección de productos de reacción, y la automatización del proceso de amplificación permiten realizar un análisis completo en 4-4,5 horas.

Cabe señalar que el método PCR puede detectar patógenos no solo en el material clínico obtenido del paciente, sino también en el material obtenido de objetos ambientales (agua, suelo, etc.)

APLICACIÓN DEL MÉTODO PCR EN LA ATENCIÓN PRÁCTICA DE SALUD

El uso del método PCR para el diagnóstico de enfermedades infecciosas tanto de naturaleza bacteriana como viral es de gran importancia para resolver muchos problemas de microbiología y epidemiología. El uso de este método también contribuye al desarrollo de investigaciones fundamentales en el campo de las enfermedades infecciosas crónicas y poco estudiadas.

El uso más efectivo y económicamente justificado del método en:

práctica uroginecológica- para detectar clamidia, ureaplasmosis, gonorrea, herpes, gardnerelosis, infección por micoplasma;

en neumología- para el diagnóstico diferencial de neumonía viral y bacteriana, tuberculosis;

en gastroenterología- para detectar helicobacteriosis;

en la clínica de enfermedades infecciosas- como método rápido para el diagnóstico de salmonelosis, difteria, hepatitis virales B, C y G;

en hematología- para detectar infección por citomegalovirus, oncovirus.

Al final del artículo, vid.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, PCR) inventado en 1983 por Carey Mullis (científico estadounidense). Posteriormente, recibió el Premio Nobel por este invento. Actualmente, el diagnóstico por PCR es uno de los métodos más precisos y sensibles para diagnosticar enfermedades infecciosas.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)- un método experimental de biología molecular, un método para aumentar significativamente pequeñas concentraciones de ciertos fragmentos de ácido nucleico (ADN) en un material biológico (muestra).
El método PCR se basa en la duplicación repetida de una determinada sección de ADN con la ayuda de enzimas en condiciones artificiales (in vitro). Como resultado, se producen cantidades suficientes de ADN para la detección visual. En este caso, solo se copia el área que cumple las condiciones especificadas, y solo si está presente en la muestra en estudio.
Además de simplemente aumentar el número de copias de ADN (este proceso se denomina amplificación), la PCR permite muchas otras manipulaciones con material genético (introducción de mutaciones, corte y empalme de fragmentos de ADN) y se usa ampliamente en la práctica biológica y médica, por ejemplo, diagnosticar enfermedades (hereditarias, infecciosas), establecer paternidad, clonar genes, introducir mutaciones, aislar nuevos genes.

Especificidad y aplicación

Realización de PCR

Para PCR, en el caso más simple, se requieren los siguientes componentes:

  • plantilla de ADN que contiene la sección de ADN a amplificar;
  • dos cebadores complementarios a los extremos del fragmento deseado;
  • ADN polimerasa termoestable;
  • trifosfatos de desoxinucleótidos (A, G, C, T);
  • iones Mg2+ necesarios para el funcionamiento de la polimerasa;
  • solución tampón

La PCR se lleva a cabo en un amplificador, un dispositivo que proporciona enfriamiento y calentamiento periódicos de los tubos de ensayo, generalmente con una precisión de al menos 0,1 ° C. Para evitar la evaporación de la mezcla de reacción, se agrega al tubo de ensayo un aceite de alto punto de ebullición, como vaselina. La adición de enzimas específicas puede aumentar el rendimiento de la reacción de PCR.
Progreso de la reacción

Por lo general, cuando se realiza una PCR, se realizan de 20 a 35 ciclos, cada uno de los cuales consta de tres etapas. La plantilla de ADN de doble cadena se calienta a 94 - 96 °C (o 98 °C si se usa una polimerasa particularmente termoestable) durante 0,5 - 2 minutos para permitir que las cadenas de ADN se separen. Esta etapa se llama desnaturalización: se destruyen los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas. A veces, antes del primer ciclo, la mezcla de reacción se precalienta durante 2 a 5 minutos para desnaturalizar por completo la plantilla y los cebadores.
Cuando se separan las hebras, se baja la temperatura para permitir que los cebadores se unan a la plantilla monocatenaria. Esta etapa se llama recocido. La temperatura de recocido depende de las imprimaciones y normalmente se elige entre 4 y 5 °C por debajo de su punto de fusión. Tiempo de etapa - 0,5 - 2 minutos.

La ADN polimerasa replica la hebra molde utilizando el cebador como cebador. Esta es la etapa de elongación. La temperatura de elongación depende de la polimerasa. Las polimerasas de uso frecuente son más activas a 72 °C. El tiempo de elongación depende tanto del tipo de ADN polimerasa como de la longitud del fragmento que se amplifica. Normalmente, el tiempo de elongación se considera de un minuto por cada mil pares de bases. Después del final de todos los ciclos, a menudo se lleva a cabo una etapa adicional de elongación final para completar todos los fragmentos monocatenarios. Esta etapa dura de 10 a 15 minutos.
Preparación de material para la investigación y su transporte al laboratorio.

Para un análisis exitoso, es importante recolectar correctamente el material del paciente y prepararlo adecuadamente. Se sabe que en los diagnósticos de laboratorio la mayoría de los errores (hasta el 70%) se cometen en la etapa de preparación de la muestra. Para la toma de sangre en el laboratorio INVITRO actualmente se utilizan sistemas de vacío que, por un lado, lesionan mínimamente al paciente y, por otro lado, permiten tomar el material de forma que no entre en contacto. con el personal o el medio ambiente. Esto evita la contaminación (contaminación) del material y asegura la objetividad del análisis PCR.

ADN - ácido desoxirribonucleico - un polímero biológico, uno de los dos tipos de ácidos nucleicos que proporcionan almacenamiento, transmisión de generación en generación e implementación del programa genético para el desarrollo y funcionamiento de los organismos vivos. El papel principal del ADN en las células es el almacenamiento a largo plazo de información sobre la estructura del ARN y las proteínas.


El ARN - ácido ribonucleico es un polímero biológico, similar en su estructura química al ADN. La molécula de ARN se construye a partir de las mismas unidades monoméricas - nucleótidos que el ADN. En la naturaleza, el ARN suele existir como una sola hebra. En algunos virus, el ARN es el portador de la información genética. En la célula, juega un papel importante en la transferencia de información del ADN a la proteína. El ARN se sintetiza en una plantilla de ADN. Este proceso se llama transcripción. Hay secciones en el ADN que contienen información responsable de la síntesis de tres tipos de ARN, que difieren en sus funciones: ARN mensajero o mensajero (ARNm), ribosómico (ARNr) y de transporte (ARNt). Los tres tipos de ARN están involucrados en la síntesis de proteínas de una forma u otra. Sin embargo, la información sobre la síntesis de proteínas está contenida solo en el ARNm.


Los nucleótidos son la unidad repetitiva básica en las moléculas de ácido nucleico, el producto de un compuesto químico de una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos (pentosa) y uno o más grupos fosfato. Los nucleótidos presentes en los ácidos nucleicos contienen un grupo fosfato. Se nombran según la base nitrogenada que contienen - adenina (A) que contiene adenina, guanina (G) - guanina, citosina (C) - citosina, timina (T) - timina, uracilo (U) - uracilo. El ADN consta de 4 tipos de nucleótidos: A, T, G, C, el ARN también tiene 4 tipos: A, U, G, C. El azúcar en la composición de todos los nucleótidos del ADN es la desoxirribosa, el ARN es la ribosa. Durante la formación de ácidos nucleicos, los nucleótidos, al unirse, forman un esqueleto de azúcar-fosfato de la molécula, en un lado del cual hay bases.


Un cebador es un ADN corto que se utiliza para replicar la hebra molde. Cada uno de los cebadores es complementario a una de las cadenas del molde bicatenario, enmarcando el principio y el final de la región amplificada.


Literatura

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)- es un método de tecnología bioquímica en biología molecular, llevado a cabo con el objetivo de aumentar una o más copias de fragmentos de ADN en varios grados, lo que le permite crear desde varios miles hasta millones de copias de una secuencia de ADN específica.


Desarrollado en 1983 por Cary Mullis, el método PCR es ahora un método común y, a menudo, indispensable utilizado en laboratorios de investigación médica y biológica para muchas aplicaciones diferentes. Estos incluyen clonación de ADN para secuenciación, filogenia basada en ADN o análisis funcional de genes; diagnóstico de enfermedades hereditarias; identificación de huellas genéticas (utilizadas en las ramas de la ciencia forense y en pruebas de paternidad), así como la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas. En 1993, Mullis recibió el Premio Nobel de Química junto con Michael Smith por su trabajo en PCR.

El método se basa en ciclos térmicos, que consisten en ciclos repetidos de reacciones de calentamiento y enfriamiento para desnaturalizar y replicar el ADN mediante enzimas. Los cebadores (piezas cortas de ADN) que contienen secuencias que son complementarias al sitio de destino junto con la ADN polimerasa (de la que recibe su nombre el método) son componentes clave para impulsar la selectiva y la reamplificación. En el proceso de PCR, el propio ADN sintetizado se utiliza como plantilla para la replicación, lo que pone en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN se amplifica exponencialmente. La PCR se puede modificar significativamente para realizar una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Casi todas las aplicaciones de PCR utilizan una polimerasa de ADN termoestable como la polimerasa Taq, una enzima originalmente aislada de bacterias. Termoacuático. Esta ADN polimerasa ensambla enzimáticamente una nueva hebra de ADN a partir de los componentes básicos del ADN: nucleótidos, utilizando ADN monocatenario como plantilla y oligonucleótidos de ADN (también llamados cebadores de ADN) que se necesitan para iniciar la síntesis de ADN. La gran mayoría de los métodos de PCR utilizan ciclos térmicos, es decir, alternan el calentamiento y el enfriamiento de la muestra de PCR en una determinada serie de pasos de temperatura. Estos pasos de ciclos térmicos se requieren primero para separar físicamente las dos hebras de la doble hélice del ADN a alta temperatura en un proceso llamado desnaturalización del ADN. A una temperatura más baja, cada hebra se usará como molde en la síntesis de ADN por la ADN polimerasa para amplificar selectivamente la región de ADN objetivo. Selectividad de los resultados de la PCR utilizando cebadores que son complementarios a la región de ADN objetivo para la amplificación en determinadas condiciones de ciclos térmicos.

Principios del diagnóstico por PCR

La PCR se utiliza para amplificar una sección específica de una cadena de ADN (ADN objetivo). La mayoría de los métodos de PCR normalmente amplifican fragmentos de ADN hasta ~10 000 pares de bases (kb), aunque algunos métodos permiten que los fragmentos se amplíen hasta 40 kb de tamaño. La reacción produce una cantidad limitada del producto amplificado final, que está controlado por los reactivos disponibles en la reacción y la inhibición por retroalimentación de los productos de reacción.

El kit básico de PCR requiere varios componentes y reactivos. Incluyen:

  • plantilla de ADN, que contiene la región de ADN diana a amplificar.
  • dos cebadores, complementario a los extremos 3' de cada una de las cadenas sentido y antisentido del ADN diana.
  • Taq polimerasa u otra ADN polimerasa que funcione a una temperatura óptima de alrededor de 70°C.
  • Trifosfatos de desoxinucleósido(dNTP; grupos trifosfato que contienen nucleótidos), los componentes básicos a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN.
  • solución tampón, proporcionando condiciones químicas adecuadas para una actividad y estabilidad óptimas de la ADN polimerasa.
  • cationes divalentes, iones de magnesio o manganeso; Mg2+ se usa comúnmente, pero Mn2+ también se puede usar para la mutagénesis de ADN mediada por PCR, ya que las concentraciones más altas de Mn2+ aumentan la tasa de error durante la síntesis de ADN.
  • Cationes monovalentes iones de potasio

La PCR se suele llevar a cabo en un volumen de reacción de 10-200 µl en pequeños tubos de reacción (volumen de 0,2-0,5 ml) en un termociclador-amplificador. El ciclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas para cada paso de la reacción. Muchos cicladores modernos utilizan el efecto Peltier, que permite calentar y enfriar el conjunto del tubo PCR simplemente invirtiendo la dirección de la corriente eléctrica. Los tubos de reacción de paredes delgadas promueven una conductividad térmica favorable para garantizar un rápido equilibrio térmico. Los cicladores más antiguos que no tienen una tapa calentada requieren una capa de aceite en la superficie de la mezcla de reacción o una gota de cera en un vial.

orden de procedimiento

Por lo general, la PCR consiste en una serie de 20 a 40 cambios de temperatura repetidos llamados ciclos, y cada ciclo generalmente consta de 2 a 3 pasos de temperatura discretos, generalmente tres. El ciclo a menudo comienza y termina con un solo paso de temperatura (los llamados anticipación) a alta temperatura (> 90 °C) para la expansión final del producto o almacenamiento breve. Las temperaturas utilizadas y la duración de su aplicación en cada ciclo depende de muchos parámetros. Estos incluyen la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTP en la reacción y el punto de fusión (Tm) de los cebadores.

  • Etapa de inicialización: Este paso consiste en calentar la reacción a una temperatura de 94-96°C (o 98°C si se utilizan polimerasas altamente termoestables), lo que se lleva a cabo durante 1-9 minutos. El paso solo se requiere para las ADN polimerasas que requieren activación por calor, la llamada PCR de inicio en caliente.
  • Paso de desnaturalización: Es el primer evento de ciclo térmico regular y consiste en calentar la reacción a 94-98°C durante 20-30 segundos. Esto provoca la escisión de la plantilla de ADN con la destrucción de los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias y la formación de moléculas de ADN monocatenarias.
  • Paso de recocido: La temperatura de reacción se reduce a 50-65 °C durante 20-40 segundos, lo que permite que los cebadores se unan a la plantilla de ADN monocatenario. Por lo general, la temperatura de recocido es de aproximadamente 3 a 5 grados Celsius por debajo de la Tm de las imprimaciones utilizadas. Los enlaces de hidrógeno ADN-ADN estables se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide más estrechamente con la plantilla de secuencia. La polimerasa se une al híbrido cebador-plantilla e inicia la síntesis de ADN.
  • Etapa de expansión / elongación: La temperatura durante este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; La polimerasa Taq tiene su temperatura de actividad óptima a 75-80°C; comúnmente se usa una temperatura de 72°C para esta enzima. En esta etapa, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena molde de ADN agregando dNTP que son complementarios a la plantilla en la dirección de 5" a 3", uniendo el grupo fosfato de 5" del dNTP al grupo fosfato de 3" grupo hidroxilo al final del ADN resultante (en expansión). El tiempo de expansión depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud del fragmento de ADN a amplificar. Normalmente, a su temperatura óptima, la ADN polimerasa polimeriza mil bases por minuto. En condiciones óptimas, es decir, en ausencia de restricciones debidas a sustratos o reactivos limitantes, en cada paso de expansión, la cantidad de ADN diana se duplica, lo que da como resultado una amplificación exponencial (geométrica) de un fragmento de ADN.
  • Extensión final: Este es el único paso, que a veces se realiza a 70-74 °C durante 5-15 minutos después del último ciclo de PCR, para garantizar que el ADN monocatenario restante se haya extendido por completo.
  • Expectativa final: Este paso a 4-15 °C se puede utilizar indefinidamente para que la reacción sea breve. Para comprobar si la PCR ha sintetizado el fragmento de ADN esperado (también denominado a veces "amplímero" o "amplicón"), se utiliza la electroforesis en gel de agarosa para separar los productos de la PCR por tamaño. El tamaño de los productos de PCR se determina por comparación con una escalera de ADN (marcador de peso molecular) que contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, realizada en un gel junto con los productos de PCR.

Etapas de la reacción en cadena de la polimerasa

El proceso de PCR se puede dividir en tres pasos:

  1. Amplificación exponencial: Durante cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (suponiendo una eficiencia de reacción del 100 %). La reacción es muy sensible: solo se necesita una pequeña cantidad de ADN.
  2. Etapa de nivelación: la reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos como los dNTP y los cebadores hace que se vuelvan limitantes .
  3. Meseta: El producto ya no se acumula debido al agotamiento de los reactivos y enzimas.

optimización PCR

En la práctica, la PCR puede fallar por varios motivos, en particular debido a su sensibilidad a la contaminación, que provoca la amplificación de subproductos de ADN. En este sentido, se han desarrollado una serie de técnicas y procedimientos para optimizar las condiciones de la PCR. La contaminación por ADN extraño se maneja mediante protocolos y procedimientos de laboratorio que purifican las mezclas previas a la PCR de posibles contaminantes de ADN. Esto generalmente incluye separar los kits de PCR de las áreas de análisis o purificación de los productos de PCR, usar utensilios de plástico desechables y limpiar a fondo la superficie de trabajo entre los pasos de reacción. Las técnicas de diseño de cebadores desempeñan un papel importante en la mejora del aislamiento de los productos de la PCR y en la prevención de la formación de subproductos, y el uso de componentes de tampón alternativos o enzimas de polimerasa puede ayudar a amplificar regiones de ADN largas o problemáticas. La adición de reactivos como la formamida a los sistemas tampón puede aumentar la especificidad y la recuperación de la PCR. Se puede realizar una simulación por ordenador de los resultados teóricos de la PCR (PCR electrónica) para ayudar en el diseño del cebador.

Aplicación de PCR

Aislamiento selectivo de ADN

La PCR permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico mediante la amplificación selectiva de una región de ADN específica. Esta aplicación de PCR complementa muchos métodos, como la creación de sondas de hibridación para métodos de clonación de ADN y transferencia Southern o Northern, que requieren grandes cantidades de ADN que representen una región específica de ADN. La PCR proporciona a estos métodos un alto contenido de ADN puro, lo que permite el análisis de muestras de ADN, incluso con una pequeña cantidad de material de partida.

Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para identificar secuencias amplificadas por PCR desconocidas, en las que uno de los cebadores de amplificación se puede usar en la secuenciación de Sanger, el aislamiento de secuencias de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que involucran la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido o material genético. de otro organismo. Las colonias de bacterias (E. coli) pueden examinarse rápidamente mediante PCR para corregir el diseño del ADN del vector. La PCR también se puede utilizar para la toma de huellas genéticas; una técnica utilizada en medicina forense para identificar a una persona u organismo comparando el ADN experimental utilizando varios métodos de PCR.

Algunos métodos de PCR de "huella digital" tienen un alto poder discriminatorio y pueden usarse para determinar relaciones genéticas entre individuos, como padre-hijo o entre hermanos, y se usan en pruebas de paternidad. Esta técnica también se puede aplicar para determinar las relaciones evolutivas entre organismos.

Amplificación y cuantificación de ADN

Dado que la PCR aumenta el número de copias de las regiones objetivo del ADN, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades muy pequeñas de una muestra. Esto suele ser fundamental para las investigaciones forenses en las que solo se dispone de trazas de ADN como prueba. La PCR también se puede utilizar para analizar ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estos métodos de PCR se han utilizado con éxito en animales como el mamut de 40.000 años de antigüedad, así como en ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso.

Los métodos de PCR cuantitativa estiman la cantidad de una secuencia dada presente en una muestra, un método que se usa a menudo para cuantificar el nivel de expresión génica. La PCR en tiempo real es una herramienta de cuantificación de ADN establecida que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ciclo de amplificación por PCR.

PCR en el diagnóstico de enfermedades

La PCR permite el diagnóstico precoz de enfermedades malignas como la leucemia y el linfoma, que en la actualidad está muy desarrollada en la investigación del cáncer y ya se utiliza de forma rutinaria. La PCR se puede realizar directamente en muestras de ADN genómico para detectar células malignas específicas de translocación con una sensibilidad que es al menos 10 000 veces mayor que otros métodos.

La PCR también permite la detección de organismos no cultivados o de crecimiento lento, como micobacterias, bacterias anaerobias y virus a partir de cultivos de tejidos y modelos animales. La base de las aplicaciones de diagnóstico por PCR en el campo de la microbiología es la identificación de agentes infecciosos y la diferenciación de cepas no patógenas de las patógenas debido a genes específicos.

El ADN viral también se puede detectar mediante PCR. Los cebadores deben ser específicos para las secuencias de ADN diana del virus, y la PCR se puede utilizar para pruebas de diagnóstico de ADN o secuenciación del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite detectar virus poco tiempo después de la infección e incluso antes de la aparición de la enfermedad. Esta detección temprana del virus podría brindar a los médicos importantes opciones de tratamiento. La cantidad de virus ("carga viral") en un paciente también se puede determinar mediante análisis de ADN cuantitativo basado en PCR.

Variaciones de los métodos básicos de reacción en cadena de la polimerasa

  • PCR específica de alelo: método de diagnóstico o clonación basado en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) (diferencias de una sola base en el ADN). Requiere un conocimiento previo de la secuencia de ADN, incluidas las diferencias entre los alelos, y utiliza cebadores cuyos extremos 3' abarcan los SNP. La amplificación por PCR estricta es mucho menos eficiente en presencia de una falta de coincidencia entre la plantilla y el cebador, por lo que la amplificación exitosa con un SNP específico el cebador señala la presencia de SNP específicos en la secuencia.
  • Ensamblaje de PCR o ensamblaje de ciclos de polimerasa (PCP): síntesis artificial de secuencias largas de ADN por PCR en un grupo de oligonucleótidos largos con segmentos superpuestos cortos. Los oligonucleótidos alternan entre las direcciones de las cadenas sentido y antisentido, y los segmentos superpuestos determinan el orden de los fragmentos de la PCR, generando así selectivamente el producto de ADN largo final.
  • PCR asimétrica: amplifica preferentemente una cadena de ADN en una plantilla de ADN de doble cadena. Se utiliza en la secuenciación y el sondeo de hibridación donde se requiere la amplificación de solo una de las dos cadenas complementarias. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, pero con un gran exceso de cebadores para la cadena destinada a la amplificación. Debido a la amplificación lenta (progresión aritmética) al final de la reacción después del uso de un cebador limitante, se requieren ciclos de PCR adicionales. La última modificación de este proceso, conocida como "LATE-PCR" (linealidad después de la fase exponencial - PCR) utiliza un cebador limitante con un punto de fusión (Tm) más alto que el exceso de cebador para mantener la eficiencia de la reacción, ya que la concentración del cebador limitante disminuye en medio de la reacción.
  • PCR de marcación: un método muy paralelo para obtener moléculas de ADN precisas para la síntesis de genes. El conjunto complejo de moléculas de ADN se modifica mediante etiquetas de flanco únicas para una secuenciación paralela masiva. Los cebadores dirigidos a etiquetas luego proporcionan moléculas secuenciadas por PCR.
  • Amplificación dependiente de helicasa: similar a la PCR tradicional pero requiere una temperatura constante que pasar por los ciclos de desnaturalización y recocido/expansión. Se utiliza ADN helicasa, una enzima que desenrolla el ADN, en lugar de la desnaturalización por calor.
  • PCR de arranque en caliente: una técnica que reduce la amplificación no específica durante la configuración inicial de los pasos de PCR. Se puede hacer manualmente calentando los componentes de la reacción a la temperatura de desnaturalización (por ejemplo, 95 °C) antes de agregar la polimerasa. Se han desarrollado sistemas enzimáticos especializados que inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea mediante la unión de anticuerpos o en presencia de inhibidores unidos covalentemente que se disocian solo después de un paso de activación a alta temperatura. La PCR de inicio en caliente/final en frío se logra con polimerasas híbridas novedosas que son inactivas a temperatura ambiente y se activan instantáneamente a la temperatura de elongación.
  • PCR específica de secuencia entre microsatélites (ISSR): Método de huellas dactilares de ADN mediante PCR que aumenta el número de copias de regiones entre secuencias repetidas simples para obtener una huella única a partir de la longitud del fragmento amplificado.
  • invertido PCR ampliamente utilizado para definir regiones de secuencia alrededor de insertos genómicos. Implica una serie de divisiones de ADN y autoligado, lo que da como resultado secuencias conocidas en cada extremo de la secuencia desconocida.
  • PCR mediada por ligadura: Utiliza pequeños conectores de ADN vinculados al ADN de interés y algunos cebadores vinculados a los conectores de ADN; Se utiliza para la secuenciación de ADN, la caminata del genoma y la huella de ADN.
  • PCR específica de metilación(MSP): Desarrollado por Stephen Bailin y Jim Herman en la Escuela de Medicina Johns Hopkins, se utiliza para detectar la metilación de las islas CpG en el ADN genómico. El ADN se trata primero con bisulfito de sodio, que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, que los cebadores de PCR reconocen como timina. A continuación, se realizan dos PCR en el ADN modificado utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto por cualquier isla CpG dentro de la secuencia del cebador. En estos puntos, un conjunto de cebadores reconoce el ADN con citosinas para aumentar el número de copias de ADN metilado y un conjunto reconoce el ADN con uracilo o timina para amplificar el ADN no metilado. MSP usando qPCR también se puede realizar para obtener información cuantitativa en lugar de cualitativa sobre la metilación.
  • Miniprimer - PCR: Se utilizan polimerasas termoestables (S-Tbr), que pueden extenderse a partir de cebadores cortos ("smalligos"), con un número de 9 o 10 nucleótidos. Esta técnica permite que la PCR se dirija a regiones asociadas con cebadores más pequeños y se utiliza para amplificar secuencias de ADN conservadas, como el gen de ARNr 16S (o eucariota 18S).
  • Amplificación de sonda dependiente de ligadura multiplex (MLPA): permite la amplificación de múltiples objetivos con solo un par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex.
  • PCR múltiplex consta de varios conjuntos de cebadores en una mezcla de PCR para obtener amplicones de diferentes tamaños que son específicos para diferentes secuencias de ADN. Al centrarse en varios genes al mismo tiempo, es posible obtener información adicional durante una sola prueba, que de otro modo requeriría varias veces más reactivos y más tiempo para completarse. Las temperaturas de recocido para cada conjunto de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una sola reacción y con tamaños de amplicón. Es decir, la longitud de sus pares de bases debe ser lo suficientemente diferente para formar bandas distintas cuando se visualice mediante electroforesis en gel.
  • PCR anidado: aumenta la especificidad de la amplificación del ADN, al reducir el fondo debido a la amplificación del ADN no específica. Se utilizan dos conjuntos de cebadores en dos PCR consecutivas. En la primera reacción, se utiliza un par de cebadores para sintetizar productos de ADN que, además del propósito previsto, aún pueden consistir en fragmentos de ADN amplificados no específicamente. Luego, los productos se usan en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de unión son total o parcialmente diferentes de los extremos 3' de cada uno de los cebadores usados ​​en la primera reacción. La PCR anidada suele tener más éxito en la amplificación específica de fragmentos largos de ADN que PCR tradicional, pero requiere un conocimiento más detallado de las secuencias diana.
  • PCR con extensiones superpuestas o empalme con extensiones superpuestas(SOE): Una técnica de ingeniería genética que se utiliza para unir dos o más piezas de ADN que contienen secuencias complementarias. Se utiliza para conectar fragmentos de ADN que contienen genes que regulan secuencias o mutaciones; la técnica permite la creación de construcciones de ADN específicas y largas.
  • PCR cuantitativa (QPCR): se utiliza para medir la cantidad de producto de PCR (generalmente en tiempo real). Cuantifica cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. qPCR se usa ampliamente para determinar la presencia de una secuencia de ADN en una muestra y su número de copias en la muestra. La PCR cuantitativa en tiempo real tiene un grado de precisión muy alto. Los métodos QRT-PCR (o QF-PCR) utilizan tintes fluorescentes como Sybr Green, EvaGreen o sondas de ADN que contienen fluoróforos como TaqMan para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real. A veces se denomina RT-PCR (PCR en tiempo real) o RQ-PCR. QRT-PCR o RTQ-PCR son abreviaturas más apropiadas, ya que RT-PCR generalmente se refiere a la PCR de transcripción inversa que a menudo se usa junto con qPCR.
  • PCR de transcripción inversa (RT-PCR): para aumentar el número de copias de ADN a partir de ARN. La transcriptasa inversa transcribe el ARN en ADNc, que luego se amplifica mediante PCR. La RT-PCR se usa ampliamente en el perfil de expresión para detectar la expresión génica o para determinar la secuencia de una transcripción de ARN, incluidos los sitios de inicio y finalización de la transcripción. Si se conoce la secuencia de ADN genómico de un gen, se puede usar RT-PCR para mapear la ubicación de exones e intrones en el gen. El extremo 5' de un gen (correspondiente al sitio de inicio de la transcripción) suele determinarse mediante RACE-PCR (amplificación rápida de los extremos del ADNc).
  • PCR en fase sólida: cubre varios significados, incluyendo "Polonia Amplification" (donde la PCR de colonias se realiza en una matriz de gel, por ejemplo), "Bridge PCR" (los cebadores se unen covalentemente a una superficie de soporte sólida), PCR en fase sólida tradicional (donde "asimétrica PCR" se utiliza en presencia de cebadores que contienen un soporte sólido con una secuencia correspondiente a uno de los cebadores acuosos), y PCR en fase sólida mejorada (donde la PCR en fase sólida convencional se puede mejorar mediante el uso de cebadores de soporte sólido anidados y Tm alta con la opción de aplicar un "paso" térmico para favorecer la formación de imprimaciones con soporte firme).
  • PCR térmica asimétrica intercalada (TAIL-PCR): se utiliza para aislar una secuencia desconocida siguiendo una secuencia conocida. En una secuencia conocida, TAIL-PCR utiliza un par de cebadores anidados con diferentes temperaturas de hibridación; cebador degenerado se utiliza para amplificar en una dirección diferente de la secuencia desconocida.
  • PCR de toma de contacto (PCR escalonada): una variante de PCR destinada a reducir el fondo no específico al reducir gradualmente la temperatura de hibridación a medida que avanzan los ciclos de PCR. La temperatura de recocido en los ciclos iniciales suele estar unos pocos grados (3-5 °C) por encima de la Tm de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores, la temperatura está unos pocos grados (3-5 °C) por debajo de la Tm de la cebadores Las temperaturas más altas brindan más especificidad para la unión del cebador y las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente a partir de productos específicos generados durante los ciclos iniciales.
  • PAN-AC: utiliza condiciones isotérmicas para la amplificación y se puede aplicar a células vivas.
  • Recorrido rápido universal por el genoma: para el recorrido del genoma y la toma de huellas dactilares genéticas utilizando una PCR "de dos caras" más específica que los enfoques tradicionales de "una cara" (usando solo un cebador específico de gen y un cebador común, lo que puede conducir a un "ruido" artificial) debido al mecanismo , incluida la formación de una estructura de lazo. Los derivados simplificados de UFW son "Lane RAGE" (PCR anidada con lazo para amplificación rápida de extremos de ADN genómico), "5" RACE Lane" y "3" RACE Lane.
  • EnsilicoPCR(PCR digital, PCR virtual, e-PCR, e-PCR) se refiere a las herramientas computacionales utilizadas para calcular los resultados de una reacción en cadena de polimerasa teórica utilizando un conjunto determinado de cebadores (sondas) para amplificar secuencias de ADN de un genoma secuenciado o transcriptoma.

Historia de la PCR

En un artículo del Journal of Molecular Biology de 1971, Kleppe y otros describieron por primera vez un método que utiliza un ensayo enzimático para replicar una plantilla de ADN corta con cebadores en condiciones in vitro. Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de la PCR no recibió mucha atención, y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 generalmente se atribuye a Carey Mullis.

Cuando Mullis desarrolló la PCR en 1983, trabajaba en Emeryville, California, para Cetus Corporation, una de las primeras empresas de biotecnología. Allí fue responsable de la síntesis de cadenas cortas de ADN. Mullis escribió que concibió el PCR mientras conducía por la carretera de la costa del Pacífico una noche en su automóvil. Reprodujo en su mente una nueva forma de analizar los cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que, en cambio, había inventado un método para aumentar el número de copias de cualquier sección del ADN a través de repetidos ciclos de duplicación causados ​​por la ADN polimerasa. En Scientific American, Mullis resumió el procedimiento: “Comenzando con una sola molécula de material genético de ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de esas moléculas en un día. Esta reacción es fácil de realizar. No requiere más que un tubo de ensayo, algunos reactivos simples y una fuente de calor”. Fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1993 por su invento, siete años después cuando él y sus compañeros de Cetus pusieron en práctica su propuesta por primera vez. Sin embargo, sigue existiendo cierta controversia sobre las contribuciones intelectuales y prácticas de otros científicos al trabajo de Mullis y si él fue el único inventor del principio de PCR.

El método de PCR se basa en el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de resistir las altas temperaturas de >90 °C (194 °F) requeridas para escindir las dos hebras de ADN en la doble hélice de ADN después de cada ciclo de replicación. Las polimerasas de ADN, utilizadas originalmente para experimentos in vitro, presagiadas por la PCR, no pudieron soportar temperaturas tan altas. Por lo tanto, los primeros procedimientos de replicación del ADN eran muy ineficientes y requerían mucho tiempo, y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa y un procesamiento continuo durante todo el proceso.

Descubrimiento en 1976 de Taq polimerasa, una ADN polimerasa aislada de una bacteria termófila, Termoacuático, que naturalmente vive en ambientes cálidos (50 a 80 °C (122 a 176 °F)) como aguas termales, allanó el camino para una mejora espectacular en el método de PCR. ADN polimerasa aislada de tAcuático, es estable a altas temperaturas y permanece activo incluso después de la desnaturalización del ADN, eliminando así la necesidad de agregar nuevas ADN polimerasas después de cada ciclo. Esto hizo posible automatizar el proceso de amplificación de ADN basado en un termociclador.

Guerras de patentes

El método de PCR propuesto fue patentado por Carey Mullis y se acredita a Cetus Corporation, donde Mullis trabajó cuando inventó la técnica en 1983. La enzima polimerasa Taq también ha sido protegida por patentes. Ha habido varias demandas de alto perfil relacionadas con la metodología, incluida una demanda fallida presentada por DuPont. La empresa farmacéutica Hoffmann-La Roche adquirió los derechos de las patentes en 1992 y actualmente posee las que aún están protegidas.

Una batalla de patentes similar sobre la enzima polimerasa Taq todavía está en marcha en algunas jurisdicciones de todo el mundo entre Roche y Promega. Los argumentos legales fueron más allá de los términos de las patentes originales de PCR y polimerasa Taq, que expiraron el 28 de marzo de 2005.

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