Главная » Гомеопатия » Доклад: Генная инженерия - настоящее и будущее. Чем занимается генная-инженерия

Доклад: Генная инженерия - настоящее и будущее. Чем занимается генная-инженерия

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, совокупность методов биохимии и молекулярной генетики, с помощью которых осуществляется направленное комбинирование генетической информации любых организмов. Генетическая инженерия позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удалёнными видами организмов, и создавать клетки и организмы с не существующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами. Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности - взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактическая универсальность генетические кода обеспечивает экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии нуклеиновых кислот, выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в том числе установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК. Важными предпосылками для появления генетической инженерии явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции - переноса некоторых генов бактериофагами, что позволило сформулировать представление о векторах: молекулах - переносчиках генов. Огромное значение в развитии методологии генетической инженерии сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определённые последовательности - сайты - и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусственных структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов - рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов. Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).

Принципы создания рекомбинантных молекул ДНК. Термин «генетическая инженерия» получил распространение после того, как в 1972 году П. Бергом с сотрудниками впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, её вируса (бактериофага λ) и ДНК обезьяньего вируса SV40 (рис. 1). В 1973 году С. Коэн с сотрудниками использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (EcoRI), которая разрывает её в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4-6 нуклеотидов). Их назвали «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала, по крайней мере, один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в EcoRI-сайт плазмиды (рис. 2). Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.

Основной современной стратегии получения рекДНК сводится к следующему:

1) в ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы, встраивают принадлежащие другому организму фрагменты ДНК, содержащие определённые гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;

2) образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;

3) отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов в виде зон просветления - бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению. Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клеток, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование - получение копий рекДНК, а следовательно, и копий целевых генов в её составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определённую рекДНК. На заключительном этапе производится идентификация (поиск) клонов, в которых заключён нужный ген. Она основывается на том, что вставка в рекДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (например, продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа: ни одна из клеток, где происходит клонирование рекДНК, не должна получить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы; последние должны быть способны к репликации.

В качестве векторных молекул в генетической инженерии используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетических маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованиям, например, лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).

Одна из важнейших задач генетической инженерии - создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных (смотри Трансгенные организмы), которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.

Поскольку генетический код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т. к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК-предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности - интроны и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие, на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделённой нитронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.

Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив так называемый ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетического кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, так как состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.

Значение генетической инженерии. Генетическая инженерия значительно расширила экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку стало возможным вводить в различные типы клеток чужеродную ДНК и исследовать её функции. Это позволило выявлять общебиологические закономерности организации и выражения генетической информации в различных организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологических продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Многие ранее недоступные биологически активные белки человека, в том числе интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови, стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Всё это дало мощный импульс к развитию биотехнологии.

Главными объектами генетической инженерии являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacilltis subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cerevisiae, различные линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами генетической инженерии создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса гепатита В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов млекопитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм человека и животных рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов различных инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением генетической инженерии является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций.

Опасения, связанные с проведением генно-инженерных экспериментов. Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекДНК группа учёных во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетическую информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологическое равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того, отмечалось, что вмешательство человека в генетический аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 году эти проблемы обсуждались на международной конференции в Асиломаре (США). Её участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов генетической инженерии, но при обязательном соблюдении определённых правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приёмам, обычным в микробиологических исследованиях, созданию специальных защитных устройств, препятствующих распространению биологических агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.

Часто под генетической инженерией понимают только работу с рекДНК, а как синонимы генетической инженерии используются термины «молекулярное клонирование», «клонирование ДНК», «клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину «генетическая инженерия». В России как синоним генетической инженерии широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: генетическая инженерия ставит целью создание организмов с новой генетической программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет, как это делается - путём манипуляции с генами.

Лит.: Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосиб., 1986; он же. Генетическая инженерия. 2-е изд., Новосиб., 2004; Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. М., 1986; Клонирование ДНК. Методы. М., 1988; Новое в клонировании ДНК: Методы. М., 1989.

С помощью которых осуществляется направленное комбинирование генетической информации любых организмов. Генетическая инженерия (Г. и.) позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удалёнными видами организмов и создавать клетки и организмы с несуществующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами.

Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности - взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактическая универсальность генетич. кода делает возможной экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии , выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в т.ч. установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК.

Важными предпосылками для появления Г.и. явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции - переноса некоторых генов бактериофагами , что позволило сформулировать представление о векторах - молекулах-переносчиках генов.

Огромное значение в развитии методологии Г.и. сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определенные последовательности (сайты) и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусств. структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов - рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов . Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).

Принципы создания рекомбинантных молекул ДНК

Термин «Г. и.» получил распространение после того, как в 1972 П. Бергом с сотр. впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, её вируса (бактериофага λ) и ДНК обезьяньего вируса SV40. В 1973 С. Коэн с сотр. использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (Eco RI), которая разрывает её в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4-6 нуклеотидов). Их назвали «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала по крайней мере один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в Eco RI-сайт плазмиды. Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.

Основная современная стратегия получения рекДНК сводится к следующему:

в ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы , встраивают принадлежащие др. организму фрагменты ДНК, содержащие определ. гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;
образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;
отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов - в виде зон просветления - бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению.

Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клеток, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование - получение копий рекДНК, а значит и копий целевых генов в её составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определ. рекДНК. На заключительном этапе производится идентификация (поиск) клонов, в который заключён нужный ген. Она основывается на том, что вставка в рекДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (напр., продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа:

ни одна из клеток, где происходит клонирование рекДНК, не должна получить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы;
последние должны быть способны к репликации.

В качестве векторных молекул в Г.и. используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетич. маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованием, напр., лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, содержит по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).

Одна из важнейших задач Г.и. - создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных (см. Трансгенные организмы), которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.

Поскольку генетич. код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т.к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК-предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности - интроны, и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделённой интронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.

Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив т.н. ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетич. кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, т.к. состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.

Значение генетической инженерии

Г.и. значительно расширила экспериментальные границы , поскольку позволила вводить в разл. типы клеток чужеродную ДНК и исследовать её функции. Это позволило выявлять общебиологич. закономерности организации и выражения генетич. информации в разл. организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологич. продуцентов биологически активных веществ. а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Мн. ранее недоступные биологически активные белки человека, в т.ч. интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих, и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Все это дало мощный импульс к развитию биотехнологии .

Глвными объектами Г.и. являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacillus subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cerevisiae , разл. линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами Г.и. создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса гепатита В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов мле-копитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм человека и животных рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов разл. инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением Г.и. является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций.

Опасения, связанные с проведением генно-инженерно экспериментов

Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекДНК группа учёных во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетич. информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологич. равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того отмечалось, что вмешательство человека в генетич. аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 эти проблемы обсуждались на междунар. конференции в Асиломаре (США). Её участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов Г.и. но при обязательном соблюдении определ. правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приёмам обычным в микробиологич. исследованиях, созданию спец. защитных устройств, препятствующих распространению биологич. агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.

Часто под Г.и. понимают только работу с рекДНК, а как синонимы Г.и. используются термины «Молекулярное клонирование», «Клонирование ДНК», «Клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину Г.и. В России как синоним Г.и. широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: Г.и. ставит целью создание организмов с новой генетич. программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет как это делается, т.е. путём манипуляции с генами.

Литература

Щелкунов С.Н. Клонирование генов. Новосибирск, 1986; Уотсон Дж ., Туз Дж ., Курц Д. Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. М., 1986; Клонирование ДНК. Методы М., 1988; Новое в клонировании ДНК: Методы М., 1989. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 2-е изд., Новосибирск, 2004.

Экономическое значение

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма . В отличие от традиционной селекции , в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования . Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии .

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы , способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как обнаружилось недавно, около 110 °C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии . За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

История развития и достигнутый уровень технологии

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии . Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом (Нобелевская премия по химии г.). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Основные этапы решения генноинженерной задачи следующие:

1. Получение изолированного гена. 2. Введение гена в вектор для переноса в организм. 3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм. 4. Преобразование клеток организма. 5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО ) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК , в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию . Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК , в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК . Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага , в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК .

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации . В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК , плазмидами . Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция .

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование , то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом , среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем

Экономическое значение

История развития и достигнутый уровень технологии

Основные этапы решения генноинженерной задачи следующие: