Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях. Поэтому, для того чтобы определенное количество вируса было лишено гемагглютинирующей способности, требуется определенный минимум антител, а так как один из компонентов РТГА всегда неизвестен, приходится реакцию ставить в ряду пробирок с различными дозами антител и одинаковыми дозами вируса или наоборот. Это достигается тем, что берут или разные разведения сыворотки и одно и то же разведение вируса, или разные разведения вируса и одно и то же разведение сыворотки.

РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток: РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА состоит в следующем:

– готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл);

– к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

– смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса ньюкаслской болезни 40–60 мин при комнатной температуре);

– ко всем смесям добавляют равные объемы 1%-ной суспензии отмытых эритроцитов;

– после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Использование в вирусологии реакции гемадсорбции.

РГАд. Гемадсорбция – соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток – впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках.

Методика РГАд состоит в следующем. На 3–4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2–3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5–10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной.

В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким:

– эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы свиней);

– эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа);

– эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).

Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов.

Серологическая диагностика вирусных болезней по приросту титра антител в парных сыворотках крови.

Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА), механизм, компоненты и применение реакций.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.

Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению.

Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки

Основные компоненты РП:

А) растворимый антиген,

Б) Специфические антитела (сыворотка)

(РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.
основана на блокаде, подавлении ан-тигенов вирусов антителами иммунной сы-воротки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

РТГА применяют для диагностики мно-гих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещево-го энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Механизм. Типирование вируса проводят в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса А с антигенами H0N1, H1N1, Н2N2, H3N2 и др.

могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов.

Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.
В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами.

Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела.

Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов.

Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами.

После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум.

Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

Реакция торможения гемагглютинации - серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими видами вирусов (аденовирусами, арбовирусами, некоторыми энтеровирусами, вирусами гриппа и парагриппа, кори, реовирусами).

Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов.

В последнее время реакция широко используется в лабораториях клинической вирусологии для определения титров специфических антител к тем или иным вирусам, а также для серологической идентификации и типирования изолятов вирусов из клинического материала от больных.

Используют несколько ограничено в силу наличия в сыворотке крови людей неспецифических ингибиторов вирусов, а также естественных антител - агглютининов.

Реакция нейтрализации - реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

РТГА применяется:
-для серотипирования вирусов;
-для серодиагностики инфекций.
Выделяют два способа постановки:
— капельный способ на стекле (ориентировочная реакция), применяется для серо копирования вирусов;
— развернутый в пробирках.

Механизм .

У некоторых вирусов (например, гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных, в зависимости от вида вируса.

При наличии в сыворотке антител - антигемагглютининов наблюдаются ингибирования активности вирусов.
РТГА.
Цель: серотипирование вируса гриппа А

Компоненты:
1. Исследуемый материал - аллантоисная жидкость куриного эмбриона,
2. Диагностические противогриппозные типоспецифические сыворотки,
3. 5 % взвесь куриных эритроцитов.
4.

Физиологический раствор.

Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).

Предыдущая31323334353637383940414243444546Следующая

Характеристика вирусов гриппа. Эпидемиология и диагностика гриппа. Использование РТГА для серотипирования вирусов гриппа. Препараты для специфической профилактики и лечения.

Грипп или инфлюэнца — острое инфекционное заболевание, характеризующееся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, лихорадкой, общей интоксикацией, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем.

Грипп отличается склонностью к эпидемическому и пандемическому распространению благодаря высокой контагиозности и изменчивости возбудителя.

Характеристика возбудителей. Возбудители — вирусы гриппа относится к сем. Orthomyxoviridae, родам Influenzavirus А, В и Influenzavirus С. Вирусы гриппа — это РНК- вирусы. Вирус гриппа типа А был выделен в 1933 г. У. Смитом, К. Эндрюсом, П. Лейдлоу. В 1940 г. Т.

Применение метода гемагглютинации в вирусологии.

Френсис и Р. Меджилл выделили вирусы гриппа типа В, в 1949 г. Р. Тейлор — типа С. В России первые вирусы гриппа были выделены в 1936 г. А. А. Смородинцевым и отнесены к типу А. Морфология. Вирусы гриппа имеют сферическую форму (форму шара) — 80 — 120 нм, реже имеют нитевидную форму. Состоят из: 1) сердцевина — нуклеокапсид спирального типа симметрии (однонитчатая линейная «-» -нить РНК + белковый капсид); 2) базальная мембрана — наружная липопротеидная оболочка — суперкапсид.

На поверхности оболочки находятся гликопротеиды (в виде шипов и ворсинок) 2-х типов: 1) гемагглютинин — способствует прикреплению к рецепторам клетки; 2) нейраминидаза - способствует освобождению вируса из клетки. Культивирование. Для культивирования используют куриные эмбрионы, первично трипсинизированные культуры клеток, иногда лабораторных животных.

Самой удобной моделью являются куриные эмбрионы 10-12 -дневного возраста. Она позволяет получить большие количества вируса, что необходимо при производстве вакцин и бакпрепаратов.

Заражение производят в аллонтоисную полость, на хорион-аллонтоисную оболочку, в амниотическую полость, в амнион. Наличие вируса в курином эмбрионе выявляют в реакции гемагглютинации. Антигенная структура. Вирусы имеют внутренний антиген — S и поверхностные антигены: НА-гемагглютинин и NA-нейраминидаза. S-антиген — группоспецифический, общий для целого типа, по этому антигену вирусы гриппа делятся на типы А, В и С. Это комплементсвязывающий, стабильный (неизменяющийся) антиген.

НА и NA-антигены — это специфические антигены. НА-антиген вызывает образование вируснейтрализующих антител и склеивание эритроцитов.

NA-антиген вызывает образование антител, частично нейтрализующих вирусы.

Вирус типа В менее изменчив, а тип С отличается высокой стабильностью.

Токсические свойства. Токсическое действие вируса на организм (головная боль, мышечные боли, температура, катаральные явления) обусловлено белками вируса (самой вирусной частицей). Это действие строго специфично и нейтрализуется только иммунной сывороткой соответствующего типа или подтипа или сывороткой переболевших. Резистентность. Вирусы гриппа чувствительны к действию УФ-лучей, дез.веществам (формалину, спирту, фенолу, хлорамину) и к жирорастворителям.

В жидкой среде погибают при, температуре 50 — 60°С в течение нескольких минут. При комнатной температуре в воздухе вирусы сохраняют инфекционные свойства несколько часов. Долго сохраняются в высушенном виде, а в замороженном состоянии (- 70°С) не только долго сохраняются, но и не теряют вирулентности.

Восприимчивость животных. В естественных условиях вирусы типа А поражают человека и животных (болеют лошади, свиньи), а вирусы типов В и С — только человека. Среди лабораторных животных к вирусам чувствительны белые мыши, африканские хорьки, сирийские хомяки, обезьяны.

Заболевание у животных характеризуется поражением легких, лихорадочным состоянием и может закончиться гибелью животных. Эпидемиология заболевания. Источник инфекции — больной человек с клинически выраженной или бессимптомной формой. Больной человек выделяет вирус в окружающую среду при кашле, разговоре, чиханье с каплями слюны, слизи, мокроты уже в инкубационный период.

Больной становится заразным за 24 часа до появления основных симптомов и представляет эпидемическую опасность в течение 48 часов после их исчезновения.

Механизм передачи — аэрогенный. Путь передачи — воздушно-капельный. Восприимчивость людей к гриппу очень высокая. Болеют все возрастные группы, преимущественно в зимнее время. Наиболее восприимчивы дети и лица преклонного возраста. В названии заболевания отражены особенности эпидемиологии: грипп от франц. gripper — хватать, инфлюэнца — от итал. Influenza di freddo — влияние холода.

Из всех острых респираторных заболеваний грипп — наиболее массовое и тяжелое заболевание. Пандемии и эпидемии гриппа охватывают до 30- 50% и более населения земного шара, нанося огромный ущерб здоровью и экономике стран. Первые описания эпидемий гриппа относятся к 12-14 в. Возникновение пандемий и крупных эпидемий вызывает вирус гриппа типа А, что обусловлено высокой изменчивостью вируса и связано с появлением нового подтипа в результате шифта антигенов.

Между пандемиями каждые 1,5-2 года возникают эпидемические вспышки, что связано с антигенным дрейфом вирусов. В 1918 г. пандемию гриппа «испанки» (заболело 1,5 млрд. чел., умерло 20 млн. чел.) вызвал вирус гриппа типа А1 Первично зарегистрированная в Испании, эта пандемия охватила практически все население Земли; заболевание характеризовалось развитием исключительно тяжелых геморрагических пневмоний с рекордным показателем смертности (до 1% от всех случаев).

В 1957 г. «азиатскую» пандемию (заболело 2 млрд. чел.) вызвал новый подтип — подтип А2. В 1968 г. «гонконгская» пандемия (заболел 1 млрд. чел.) была вызвана вновь возникшим подтипом — подтипом А3. Как правило, новый вариант вируса вытесняет из человеческой популяции раннее циркулировавшую разновидность.

Но в 1977 г. после 20-летнего перерыва неожиданно «возвратился» тип А1, что привело к возникновению крупной эпидемии. Следовательно, вытесненные варианты вируса гриппа сохраняются и через определенные промежутки времени могут снова вызвать эпидемию. Вирус типа В вызывает локальные эпидемии, а тип С эпидемий не вызывает. Патогенез и клиника заболевания. Входные ворота — верхние дыхательные пути. Вирус внедряется в эпителиальные клетки слизистой оболочки и размножается в них.

Воздействие вируса на эпителиальные клетки вызывает их некроз и слущивание (отторжение) эпителия, в результате чего слизистая оболочка становится проницаемой для вирусов и бактерий. Они проникают в кровь и распространяются по всему организму» Вирусемия сопровождается множественными поражениями эндотелия капилляров с повышением их проницаемости.

В тяжелых случаях наблюдаются обширные кровоизлияния в легких, миокарде, паренхиматозных органах. Продукты распада поврежденных клеток и вирусные белки оказывают токсическое действие на различные органы и системы органов. Токсины вируса сильно угнетают ЦНС, и, хотя процесс длится недолго(3 — 5 дней), больной человек еще долго остается ослабленным и к ослабленному организму присоединяется какая-либо вторичная инфекция и возникают ос-ложнения: гриппозные пневмонии, острый отек легких, поражение почек, сердца, бронхов.

Частое осложнение гриппа — бактериальные пневмонии (стрептококки группы В). Во время пандемии «испанки» люди умирали, в основном, от вторичных бактериальных пневмоний.

В патогенезе гриппа имеет значение не только интоксикация, но и аллергизация, а также нарушение функциональных свойств иммуннокомпетентных клеток с развитием иммунодефицита. Инкубационный период — несколько часов — 1-3 суток. Характерно острое начало, повышение температуры до 37,5 — 38°С, общая интоксикация, выражающаяся в недомогании, головной боли, боли в глазных яблоках, воспалительных процессах дыхательных путей различной степени тяжести (риниты, ларингиты, трахеиты, фарингиты).

Лихорадочное состояние при гриппе без осложнений длится 5-6 дней. Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется типоспецифический и штаммоспецифический иммунитет, который обеспечивается специфическими и неспецифическими клеточными и гуморальными факторами. Большое значение имеют антитела Ig А. Перекрестного иммунитете не развивается, после перенесения гриппа типа А1, можно заболеть гриппом типа А2 и т.д. После вируса типа иммунитет -1-2 года, после вируса типа В — 3 - 5 лет.

Пассивный естественный иммунитет — у детей до 8 — 11 мес. Из-за высокой антигенной изменчивости вируса выздоровление не приводит к развитию стойкой невосприимчивости к повторным заражениям.

Лабораторная диагностика. Исследуемый материал: мазки-отпечатки со слизистой носовой полости, отделяемое носоглотки, кусочки легких, мозга при летальных исходах.

Методы диагностики: 1) метод циториноскопии — обнаружение внутриклеточных включений, специфических для вируса — при окраске пиоктанином под микроскопом видны ярко-красные включения вируса гриппа в клетках ресничного эпителия; 2) вирусологический метод — выделение вируса гриппа из организма человека путем заражения куриных эмбрионов смывом из носоглотки больного; индикацию (присутствие) вируса проводят при помощи РГА (вирусы гриппа агглютинируют эритроциты человека и различных животных), идентификацию вируса проводят поэтапно: тип определяют в РСК, подтип гемагглютинина — в РТГА, а подтип нейраминидазы — в реакции ингибирования активности фермента; 3) серологический метод — обнаружение нарастания титра (в 4 раза) специфических антител в сыворотке крови больного с помощью РСК, РТГА, РН в культуре клеток, реакции преципитации в геле, ИФА; 4) биологический метод — интраназальное заражение мышей — введение материала в легкие под эфирным наркозом; мыши погибают через 2 - 3 дня в результате пневмонии; 5)экспересс-диагностика — выявление вирусного антигена с помощью РИФ.

Лечение и профилактика.

Для профилактики и лечения в первые дни болезни применяют человеческий лейкоцитарный интерферон (интраназально). В лечебных целях используют противовирусные препараты — ремантадин (грипп типа А), адапромин, виразол и иммуномодулирующие препараты — дибазол, продигиозан, левомизол.

При тяжелом течении гриппа, особенно у детей, применяют донорский противогриппозный иммуноглобулин, а также препараты — ингибиторы клеточных протеаз (гордокс, контрикал, аминокапроновая кислота).

Спецпрофилактика. Используются перечисленные противовирусные препараты и иммуномодуляторы, а также вакцины — живые и инактивированные: 1) живые моновакцины для перорального применения – аттенуированные штаммы вирусов, циркулирующих в настоящее время (А1, А3 и В); проявляют наибольшую иммуногенность; 2) цельновирионные вакцины из вирулентных штаммов, инактивированных формальдегидом или УФ-лучами; 3) субъединичные гриппозные вакцины только из поверхностных антигенов — НА и NA-антигенов (обладают минимальной реактогенностью).

Для получения вакцин вирусы культивируют в куриных эмбрионах и на культуре клеток куриных эмбрионов.

При введении вакцин формируется местный и гуморальный иммунитет. Вакцинацию осуществляют в периоды наибольшего риска развития эпидемий. Она в большей степени показана лицам младшего и преклонного возраста. Применение убитых вакцин требует ежегодной ревакцинации; их эффективность не превышает 60 — 70%.

Т.к. часто наблюдаются антигенные вариации возбудителя, то набор антигенов соответствующего вируса для иммунизации может быть определен только после начала вспышки заболевания.

Билет 15.

Реакция гемагглютинации (РГА).

В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами).

Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не

антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками.

Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.

Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки.

Реакция торможения гемагглютинации

При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле.

Интенсивность реакции выражают знаками «+». Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.

е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл’1-2% взвеси эритроцитов.

Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» — нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» — вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» — сыворотка нейтрализовала вирус.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.

Постановка реакции.

Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 — 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.

Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой.

В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.

Контрольные вопросы.

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку?

Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.

Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что’ специфический комплекс антиген — антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РКС-сложная серологическая реакция.

В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.

Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной.

В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой, то во второй системе гемолиза не будет- т.к.

нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").

Компоненты, реакции связывания комплемента:

Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен,

реже взвесь микроорганизмов.

2. Антитело — сыворотка больного.

3. Комплемент — сыворотка морских свинок.

Антиген — эритроциты барана.

5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана.

6. Изотонический раствор.

Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,

они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена.

В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами.

  Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;

• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты.

  Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа.

Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вконтакте

Одноклассники

В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела.

Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунопогического состояния привитых. У больных туляремией aнтитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:100000- 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80.

Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный).

Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат — 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат — высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах — в 0,5%-ноq концентрации.

Техника постановки РПГА.

Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град.С в течение 30 минут.

Реакция гемагглютинации (РГА) и

После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием.

Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.

Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины.

При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6-лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок).

После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном — с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов.

Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов.

Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.

Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме:

1) резко положительная реакция (++++) — эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев;

2) положительная реакция (+++) — эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки;

3) слабоположительная реакция (++) — агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;

4) сомнительная реакция (+) — вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината;

5) отрицательная (-) — на дне лунки эритроциты оседают в виде «пуговки» или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).

Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА необходимо проследить за его нарастанием.

РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

Техника постановки РПГА в микрообъемах.

РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е.

в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки — капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку.

Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума.

Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе.

Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.

Учет реакции производят по следующей схеме:

1) «+» – полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», занимающего не менее 2/3 дна;

2) «+-« — частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера;

3) «-« – отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой пуговки или колечка с ровным краем.

Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции – реакции mторможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Техника постановки РТПГА.

Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок.

Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титровании Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда — по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий.

Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз.

Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола.

Учет производят через 2-3 часа.

Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена.

Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.

Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи.

Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забивают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремиймого антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй — 25 мкл разводящей жидкости.

Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного зритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации).

Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.

Дата публикования: 2015-02-03; Прочитано: 3176 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.003 с)…

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ

гемагглютина́ция (от греч. háima — кровь и лат. agglutinatio — склеивание), склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием бактерий, вирусов, токсинов и др., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также гемагглютининов. Эритроциты одного животного могут агглютинироваться сывороткой другого вследствие наличия в ней нормальных изогемагглютининов (антител). С помощью реакции Г. устанавливают . Феномен Г. используется при микробиологическом и иммунологическом исследованиях.

Различают прямую, или активную, и непрямую, или пассивную, Г. Прямая Г. обусловлена непосредственным воздействием бактериальных и вирусных агентов на эритроциты. При этом гемагглютинины с помощью фермента муциназы взаимодействуют с расположенными на поверхности эритроцитов рецепторами мукопротеазной природы, вызывая адсорбцию антигена. В результате взвесь эритроцитов (например, курицы) образует широкий осадок в форме зонтика с неровными краями. Эта реакция не является специфической, протекает без участия иммунной сыворотки. Прямую Г. применяют в серологических исследованиях, в частности при определении рабочего разведения антигена, используемого в реакции торможения Г. , в основе которой лежит задержка гемагглютинирующего действия антигена иммунной специфической сывороткой. Прямую Г. используют также для ориентировочной диагностики некоторых вирусных болезней (инфлюэнцы лошадей, чумы птиц, ньюкаслской болезни, гриппа уток). Непрямая Г. (РНГА) основана на способности сенсибилизированных эритроцитов (путём адсорбции на них антигена) агглютинироваться гомологичными антителами иммунной сыворотки. Благодаря высокой чувствительности и специфичности непрямой Г. её применяют для диагностики многих вирусных, бактериальных и риккетсиозных заболеваний. Существует несколько модификаций непрямой Г. — реакции торможения, задержки, нейтрализации антител и др. С помощью РНГА и её модификаций могут быть выявлены как антитела в сыворотке крови животных и человека (при использовании эритроцитов, сенсибилизированных известным антигеном), так и антиген (при использовании эритроцитов, сенсибилизированных определёнными антителами). Для реакции применяют отмытые эритроциты разных видов животных (наиболее часто эритроциты барана и курицы). Способность эритроцитов к адсорбции крупномолекулярных антигенов белковой природы повышается после обработки их танином. Для повышения срока хранения эритроцитов их консервируют формалином. Полученные из формализированных эритроцитов диагностикумы могут длительное время сохранять свою активность. При наличии готовых эритроцитарных диагностикумов постановка реакции значительно упрощается. В ветеринарной практике РНГА применяют для диагностики некоторых (преимущественно вирусных) болезней животных — классической чумы птиц ньюкаслской болезни, оспы коров, инфлюэнцы лошадей, гриппа свиней и уток, пуллороза — тифа птиц и др. См. также , .

Литература:
Лабораторные исследования в ветеринарии, М., 1971;
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера 2 изд., М., 1973.

Ветеринарный энциклопедический словарь. - М.: "Советская Энциклопедия" . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

Синонимы :

Смотреть что такое "ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ" в других словарях:

гемагглютинация - гемагглютинация … Орфографический словарь-справочник

гемагглютинация - скучивание, агглютигация Словарь русских синонимов. гемагглютинация сущ., кол во синонимов: 2 агглютигация (3) … Словарь синонимов

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ - (от гемо... и лат. agglutinatio склеивание) склеивание и выпадение в осадок взвешенных в жидкости эритроцитов под воздействием различных агентов, напр., антител, бактерий или вирусов. Реакция гемагглютинации применяется для диагностики… … Большой Энциклопедический словарь

Гемагглютинация - процесс склеивания эритроцитов в видимые невооруженным глазом агрегаты. Г. вызывают: 1) Ат к эритроцитарным и гетерофильным Аг; 2) Ат к чужеродным для эритроцитов Аг, адсорбированным на их поверхности (см. Гемагглютина ции реакция пассивная); 3) … Словарь микробиологии

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ - ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ, аглютинация (ску чивание) эритроцитов при смешивании с гомологичными сыворотками. Если человеческие эритроциты сменить с сывороткой того же лица, то при встряхивании получится равномерная взвесь. Если эритроциты одного лица… … Большая медицинская энциклопедия

гемагглютинация - Феномен, лежащий в основе способа определения антител, основанного на агглютинации ими эритроцитов в результате связывания либо с антигенами самих эритроцитов, либо с другими антигенами, искусственно присоединенными к поверхности эритроцитов.… … Справочник технического переводчика - (гем + агглютинация) агглютинация эритроцитов … Большой медицинский словарь

Гемагглютинация - от греч. haima кровь и лат. agglutinatio склеивание), процесс склеивания и последующего осаждения эритроцитов крови; вызывается гемагглютининами (См. Гемагтлютинины), бактериями и вирусами, агентами, способными адсорбироваться на… … Большая советская энциклопедия

гемагглютинация - склеивание (агглютинация) эритроцитов. Развивается, в том числе и при переливании несовместимой крови.

Реакция прямой агглютинации микробов (РА). В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютаногены). Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации). По характеру образующегося агглютината различают зернистую и хлопьевидную агглютинацию. Зернистая агглютинация происходит при склеивании микробов, содержащих О-антиген. Бактерии, имеющие жгутики (Н-антиген), агглютинируются с образованием крупных хлопьев.

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки. Их получают гипериммунизацией лабораторных животных взвесью бактерий. Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена. Однако из-за сложности антигенной структуры бактерий, агглютинирующие сыворотки содержат антитела не только к видоспецифическим, но и к групповым антигенам и могут давать групповую агглютинацию с родственными видами бактерий. Титры антител к видоспецифическим антигенам в сыворотке всегда выше, чем к групповым. Для удаления группоспецифических антител в сыворотку последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые антигены (метод Кастеллани). Таким методом получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микроба.

Методы реакции агглютинации. Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. В этой реакции используют сыворотки с небольшим разведением или неразведенные. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов. На стекло наносят каплю сыворотки, в которую петлей вносят неизвестную культуру бактерий, перемешивают и через 2-3 минуты наблюдают появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации. Для контроля используют каплю физиологического раствора, в которой после внесения бактерий наблюдается помутнение. При использовании неадсорбированных сывороток реакция на стекле имеет только ориентировочное значение.

Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин. При этом диагностическую сыворотку разводят до титра и вносят одинаковые количества антигена. При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок в виде " зонтика", при отрицательном - осадок в виде " пуговицы". Поскольку титры группоспецифических антител в сыворотке значительно ниже, чем титр видоспецифических, групповые реакции наблюдаются лишь в небольших разведениях сыворотки. Если агглютинация происходит до титра или до половины титра сыворотки, она является видоспецифэтеской.

Для определения антител в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум, содержащий взвесь известных микробов или их антигенов. В этом случае также можно ставить пластинчатую и развернутую РА.

Реакция прямой агглютинации клеток. Для определения групп крови используют стандартные сыворотки крови доноров, содержащие известные анти-А или анти-В антитела. Реакции ставят на стекле или пластинах. При наличии на эритроцитах А (2-я группа крови), В (3-я группа крови) или обоих антигенов (4-я группа крови) соответствующие сыворотки агглютинируют эритроциты. Применяется также проба на совместимость крови, когда капли крови донора и реципиента смешивают и оценивают агглютинацию.

В клиниках применяют реакцию агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и других клеток для выявления аутоантител, а также для определения антигенов на этих клетках.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение . РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов.

· Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами.

· После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению.

· Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум.

· Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки.

· Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

· Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции - харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями

Реакция коагглютинации.

В основу этой реакции положено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fc-фрагментами IgG и IgM.

При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предметное стекло наносят каплю 2%-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30-60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Требования к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации клеток стафилококка, и проведение процесса сенсибилизации . Для получения коагглютинирующего реагента взвесь стафилококков следует обработать иммунной сывороткой против искомого антигена. Сыворотка должна быть взята от животного, IgG которого обладает сродством к белку А. Наибольшим сродством к нему обладают иммуноглобулины человека, свиньи, собаки и морской свинки, меньшим - осла и кролика, a IgG овцы, лошади, крысы и мыши взаимодействуют с ним очень слабо.

Помимо строгой специфичности к искомому антигену сыворотка, используемая в РКОА, не должна содержать антител к стафилококку, чтобы избежать агглютинации стафилококкового реагента, обусловленной специфическим воздействием антигена и антител, которая в системе IgG - белок А должна быть исключена. Контроль проводят путем смешивания на стекле одной капли сыворотки и 10%-й суспензии стафилококкового реагента. Если по истечении 3…5 мин не образуются хлопья агглютината, то сыворотку считают пригодной для реакции.

Если имеющиеся образцы сывороток к этому антигену агглютинируют стафилококк, то можно провести их адсорбцию взвесью стафилококковых клеток, не имеющих белка А (например, штаммы Wood-46). Таким путем удаляют антитела, реагирующие со стафилококком за счет Fab-фрагментов.

Таким образом, сыворотка, применяемая для приготовления коагглютинирующего реагента, должна отвечать следующим требованиям:

• получена от животного-продуцента, IgG которого обладает сродством к белку А;
• должна обладать специфичностью по отношению к искомому антигену;
• быть свободна от противостафилококковых антител.

· Приготовление диагностикума . Приготовленный 10%-й стафилококковый реагент соединяют с равным объемом иммунной сыворотки в определенном ранее оптимальном рабочем разведении. Смесь встряхивают в течение 60 мин при 40…42 °С в шутгель-аппарате при 90 колебаниях в 1 мин. Затем через 15 мин дважды отмывают ФБР, ресуспензируют до 2%-й взвеси и консервируют мертиолатом натрия (1: 10 000).

Реакция гемагглютинации (РГА)

РГА основана на том, что некоторые виды бактерий и вирусов обладают способностью адсорбироваться на поверхности эритроцитов разных видов животных (и птиц), вызывая их склеивание и образование агглютината (прямая РГА).

Адсорбция антигена (бактерий, вирусов) на поверхности эритроцитов не всегда проявляется образованием видимого осадка; кроме того, РГА неспецифична, потому что эритроциты одного и того же вида животного могут адсорбировать различные антигены.

Специфической является реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА). Для ее постановки предварительно готовят эритроцитарный диагностикум (эритроциты, на которых адсорбирован антиген). С этой целью стерильно получают кровь барана (или петуха), дефибринируют ее и несколько раз отмывают в фосфатно-буферном растворе (pH 7,2) с помощью 3-5-кратного центрифугирования. Над- осадочную жидкость удаляют, концентрацию эритроцитов доводят до 2,5% (1:40). К 2,5%-й взвеси эритроцитов добавляют в равном объеме (по 1 мл или по 0,5 мл) взвесь бактерий исследуемого вида микроба в концентрации 5-10 млрд клеток в 1 мл. Эритроциты легко адсорбируют антиген полисахаридной природы. Для адсорбции антигена белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином в разведении 1:20 000. Эритроциты в комплексе с добавленным антигеном оставляют для сенсибилизирования (адсорбции) на 2 ч в термостате (37 °С), затем вновь центрифугируют при 3-4 тыс. об/мин в течение 5 мин с фосфатно-буферным раствором (рис. 9.13).

Полученный эритроцитарный диагностикум помещают в пробирки (или лунки в плексигласовой доске) и добавляют к нему стандартную иммунную сыворотку.

В положительных случаях произойдет РГА - выпадение эритроцитов в виде характерного хлопьевидного или зернистого осадка, распределенного по всей поверхности дна пробирки (гемагглютинат). Значит, исследуемый вид микроба (антиген) специфичен антителам иммунсыворотки. В отрицательных случаях несклеенные эритроциты осядут на дно в виде небольшого ровного кружочка.

Для большей достоверности результатов РПГА проводят реакцию задержки (торможения) феномена гемагглютинации (РЗГА) или ее модификацию - реакцию нейтрализации антител (РИА).

Рис. 9.13. Реакция пассивной гемагглютинации (схема): Эр - эритроциты: АГ - антиген: АТ - антитело

Сущность РЗГА заключается в том, что реакцию агглютинации ставят со специфической диагностической сывороткой и испытуемым антигеном (исследуемый вид микроба используют как антиген). Эту смесь выдерживают 1-2 ч при 37 °С, затем добавляют эритроциты. Если испытуемый антиген гомологичен антителам диагностической сыворотки, они взаимодействуют друг с другом и добавленные эритроциты не агглютинируют - результат реакции положительный. Если испытуемый антиген не гомологичен антителам сыворотки или он не содержится в материале, то добавленные эритроциты адсорбируют антиген и происходит РГА - результат РЗГА отрицательный, вид испытуемого микроба (антигена) не установлен.

Методика постановки PH А заключается в том, что берут в равных объемах и смешивают диагностическую иммунную сыворотку с различными разведениями исследуемого материала (искомого антигена), оставляют для контакта на 1-2 ч, затем добавляют эритроциты, сенсибилизированные определенным (известным) антигеном, специфическим по отношению к антителам сыворотки (эритроцитарный диагностикум). Когда искомый антиген вступает в реакцию с антителами сыворотки, происходит их нейтрализация и добавленные эритроциты не агглютинируют, РГА не происходит - результат РНА положительный. Если в исследуемом материале не содержится антиген, специфический к антителам используемой сыворотки, нейтрализации антител не будет. Поэтому при добавлении эритроцитарного диагнос- тикума проявляется агглютинация эритроцитов (гемагглютинация), а результат РНА - отрицательный. Реакция нейтрализации антител - высокочувствительный метод обнаружения антигена не только во взвеси живых (или убитых) бактерий, но и во взвеси растертой ткани различных органов, нативных и гретых секретах и экскретах больного организма.

Реакция Видаля . Со второй недели заболевания в крови больных накапливаются антитела против возбудителя инфекции. Для их выявления исследуют сыворотку крови больного в реакции агглютинации. В качестве антигена используют убитые культуры сальмонелл - диагностикумы.

Для постановки реакции Видаля используют сыворотку больного, набор диагностикумов, изотонический раствор натрия хлорида.

Кровь (2-3 мл) из мякоти пальца или локтевой вены собирают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию. В лаборатории пробирку ставят в термостат на 20-30 мин для образования сгустка, затем пастеровской пипеткой обводят сгусток, чтобы отделить от стенки пробирки, и ставят на 30-40 мин на холод. Отделившуюся сыворотку отсасывают и используют для постановки реакции агглютинации с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифов. Для получения сыворотки кровь можно отцентрифугировать.

При возникновении инфекционного процесса - брюшного тифа или паратифов - в организме вырабатываются О- и Н-антитела к одноименным антигенам возбудителя.

О-антитела появляются первыми и исчезают довольно быстро. Н-антитела сохраняются долго. То же самое происходит и при вакцинации, поэтому положительная реакция Видаля с О- и Н-антигенами свидетельствует о наличии заболевания, а реакция только с Н-антигенами может быть и у переболевших (анамнестическая реакция), и у привитых (прививочная). Исходя из этого, реакцию Видаля ставят раздельно с О- и Н-антигенами (диагностикумы).

Так как клинически брюшной тиф и паратифы А и В сходны, то для выявления природы заболевания сыворотку больного испытывают одновременно с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифа А и В.

Реакцию Видаля широко используют, так как она проста и не требует специальных условий.

Поставить реакцию можно двумя способами: капельным и объемным (см. главу 12). В практике чаще используют объемный метод. При постановке линейной реакции агглютинации количество рядов должно соответствовать количеству антигенов (диагностикумы). Возбудителем заболевания считают микроорганизм, диагностикум из которого агглютинировался сывороткой больного. Иногда отмечают групповую агглютинацию, так как возбудители тифа и паратифов обладают общими групповыми антигенами. В этом случае положительным считают результат реакции в ряду, в котором агглютинацию отмечают в большем разведении сыворотки (табл. 36).

Таблица 36. Возможный результат реакции агглютинации

Примечание. В практике реакцию Видаля ставят с четырьмя диагностикумами: брюшного тифа "О" и "Н", а паратифов А и В - с диагностикумами "ОН".

Если агглютинация возникает только в небольших разведениях сыворотки - 1:100, 1:200, то для отличия реакции при заболевании от прививочной или анамнестической прибегают к повторной постановке реакции агглютинации через 5-7 дней. У больного титр антител повышается, а у привитого или переболевшего не изменяется. Таким образом, нарастание титра антител в сыворотке крови служит показателем заболевания.

В ответ на внедрение в организм возбудителей брюшного тифа, обладающих Vi-антигеном, в крови больного появляются Vi-агглютинины. Их определяют со 2-й недели болезни, но титр их обычно не превышает 1:10. Обнаружение Vi-антител связывают с наличием в организме возбудителей брюшного тифа, поэтому определение этих антител имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет выявить бактерионосителей.

Реакция Vi-гемагглютинации . Это наиболее чувствительная реакция для выявления антител.

Принцип реакции заключается в том, что эритроциты человека (I группы) или барана после специальной обработки могут адсорбировать на своей поверхности Vi-антиген и приобретают при этом способность агглютиниповаться соответствующими Vi-антителами.

Эритроциты с адсорбированными на поверхности антигенами называют эритроцитарными диагностикумами.

Для постановки реакции Vi-гемагглютинации берут:

1) сыворотку крови больного (1-2 мл); 2) эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум; З) Vi-сыворотку; 4) О-сыворотку; 5) изотонический раствор натрия хлорида.

Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в пластмассовых пластинах с лунками.

Кровь у больного берут так же, как для реакции Видаля. Получают сыворотку. Из сыворотки готовят двукратные серийные разведения, начиная с 1:10 до 1:160.

По 0,5 мл каждого разведения вносят в лунку и прибавляют по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию ставят в объеме 0,75 мл.

Контролем служат: 1) стандартная агглютинирующая монорецепторная сыворотка + диагностикум - реакция должна быть положительной до титра сыворотки; 2) диагностикум в изотоническом растворе натрия хлорида (контроль) - реакция должна быть отрицательной.

Содержимое лунок тщательно перемешивают, ставят в термостат на 2 ч и оставляют при комнатной температуре до следующего дня (на 18-24 ч).

Учет начинают с контроля. Реакцию оценивают в зависимости от степени агглютинации диагностикума.

Результаты учитывают по четырехкрестной системе:

Эритроциты полностью агглютинированы - осадок на дне лунки в виде "зонтика";

+++ "зонтик" меньше, не все эритроциты агглютинировались;

++ "зонтик" маленький, на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов;

Реакция отрицательная; эритроциты не агглютинировались и осели на дно лунки в виде пуговки.

Контрольные вопросы

1. В какой период заболевания ставят реакцию Видаля?

2. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции Видаля?

3. С какими диагностикумами ставят реакцию Видаля?

4. Какая из серологических реакций является самой чувствительной при диагностике тифопаратифозных инфекций?

5. Каким диагностикумом пользуются при постановке реакции Vi-гемагглютинации?

6. Какой сывороткой определяют наличие Vi-антигена у исследуемой культуры?

7. Какое значение имеет определение Vi-фаготипа?

Возьмите у преподавателя О- и Н-диагностикумы из сальмонелл тифа, паратифа А и паратифа В и сыворотку больного. Поставьте реакцию Видаля.

Питательные среды

Среды ЭМС, Плоскирева, висмут-сульфитный агар выпускаются медицинской промышленностью в виде сухого порошка. Их готовят согласно указаниям на этикетке: отвешивают определенное количество порошка, наливают соответствующее количество воды, кипятят и разливают в стерильные чашки Петри.

Среда Рассела . В 950 мл дистиллированной воды добавляют 40 г сухой питательной среды и прибавляют 5 г питательного агара. Нагревают до кипения и растворения порошков. В 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г х. ч. глюкозы и добавляют к приготовленной смеси. Среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл, стерилизуют текучим паром (2 дня по 2 мин) и скашивают так, чтобы оставался столбик. Среду Рассела с маннитом и сахарозой готовят так же.

Среда Олькеницкого из сухого агара . 2,5 г сухого питательного агара расплавляют в 100 мл дистиллированной воды. В остуженный до 50° С агар прибавляют все ингредиенты, указанные в рецептуре (этикетке). Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром (3 дня по 20 мин) и затем скашивают. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета.