Dom » Homeopatija » Izvještaj: Genetski inženjering - sadašnjost i budućnost. Šta radi genetski inženjering

Izvještaj: Genetski inženjering - sadašnjost i budućnost. Šta radi genetski inženjering

GENETIČKI INŽENJERING, skup metoda biohemije i molekularne genetike, uz pomoć kojih se vrši usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. Genetski inženjering omogućava prevazilaženje prirodnih međuvrstnih barijera koje onemogućavaju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama, te stvaranje ćelija i organizama s kombinacijama gena kojih u prirodi nema, sa datim nasljednim svojstvima. Glavni objekt uticaja genetskog inženjeringa je nosilac genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čiji se molekul obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost uparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog fundamentalne sličnosti strukture molekula DNK u svim vrstama organizama, a stvarna univerzalnost genetskog koda osigurava ekspresiju stranih gena (njihova manifestacija funkcionalna aktivnost) u svim tipovima ćelija. Tome je doprinijelo i akumuliranje znanja iz oblasti hemije nukleinskih kiselina, identifikacija molekularnih karakteristika organizacije i funkcionisanja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnost podređivanja gena delovanju gena). stranih” regulatornih elemenata), razvoj metoda sekvenciranja DNK, otkriće lančane reakcije polimeraze, koja je omogućila brzu sintetizaciju bilo kojeg dijela DNK. Važni preduvjeti za nastanak genetskog inženjeringa bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijelaz iz jedne bakterijske ćelije u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagima, što je omogućilo formuliranje koncepta. vektora: molekuli nosioci gena. Od velikog značaja u razvoju metodologije genetskog inženjeringa bili su enzimi uključeni u transformaciju nukleinskih kiselina: restrikcijski enzimi (prepoznaju striktno definisane sekvence u molekulima DNK - mjesta - i "presijeku" dvostruki lanac na tim mjestima), DNK ligaze (kovalentno se vežu pojedinačni fragmenti DNK), reverzna transkriptaza (sintetizuje komplementarnu kopiju DNK, ili cDNK, na RNK šablonu) itd. Tek uz njihovo prisustvo, stvaranje veštačkih struktura postalo je tehnički izvodljiv zadatak. Enzimi se koriste za dobijanje pojedinačnih DNK fragmenata (gena) i stvaranje molekularnih hibrida - rekombinantne DNK (recDNA) zasnovane na DNK plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u ćeliju domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju (kloniranje) i formiranje konačnog genskog proizvoda (njegovu ekspresiju) tamo.

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNK. Termin "genetski inženjering" postao je raširen nakon što su P. Berg i njegovi suradnici prvi put dobili rekombinantnu DNK 1972. godine, koja je bila hibrid u kojem su fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njenog virusa (bakteriofaga λ) i DNK virusa majmuna SV40 su spojeni (sl. 1). 1973. S. Cohen i saradnici su koristili plazmid pSC101 i restrikcijski enzim (EcoRI), koji ga razbija na jednom mjestu na način da se na krajevi dvolančane DNK molekule. Zvali su ih "ljepljivi" jer se mogu pariti (nekako da se drže zajedno) jedno s drugim. Kada se takva DNK pomiješa sa stranim DNK fragmentima tretiranim istim restrikcijskim enzimom i koji imaju iste ljepljive krajeve, dobijeni su novi hibridni plazmidi, od kojih svaki sadrži najmanje jedan strani fragment DNK umetnut u EcoRI mjesto plazmida (slika 2). Postalo je očigledno da se u takve plazmide mogu ubaciti fragmenti različitih stranih DNK dobijenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Glavna trenutna strategija za dobijanje recDNK je sljedeća:

1) fragmenti DNK koji pripadaju drugom organizmu koji sadrže određene gene ili vještački dobijene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača se ubacuju u DNK plazmida ili virusa koji se može razmnožavati nezavisno od hromozoma;

2) dobijeni hibridni molekuli se uvode u osjetljive prokariotske ili eukariotske ćelije, gdje se repliciraju (množe, pojačavaju) zajedno sa fragmentima DNK koji su ugrađeni u njih;

3) odabrati ćelijske klonove u obliku kolonija na posebnim hranjivim podlogama (ili viruse u obliku čistih zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih stanica ili kultura životinjskog tkiva) koji sadrže željene vrste recDNA molekula i podvrgnuti ih sveobuhvatnu strukturnu i funkcionalnu studiju. Da bi se olakšala selekcija ćelija u kojima je prisutna recDNK, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (selekcija stanica koje sadrže recDNK vrši se prema njihovoj sposobnosti rasta u prisustvu jednog ili drugog antibiotika). RecDNK koje nose željene gene se biraju i uvode u ćelije primaoca. Od ovog trenutka počinje molekularno kloniranje - dobijanje kopija recDNK, a samim tim i kopija ciljnih gena u njegovom sastavu. Samo ako je moguće odvojiti sve transficirane ili inficirane stanice, svaki klon će biti predstavljen zasebnom ćelijskom kolonijom i sadržavati određenu recDNK. U završnoj fazi vrši se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Zasnovan je na činjenici da umetanje u recDNK određuje neko jedinstveno svojstvo ćelije koja ga sadrži (na primjer, ekspresioni proizvod umetnutog gena). U eksperimentima sa molekularnim kloniranjem, primjećuju se 2 osnovna principa: nijedna ćelija u kojoj se kloniranje recDNK ne smije primiti više od jednog molekula plazmida ili virusne čestice; potonji mora biti u stanju da se replicira.

Širok spektar plazmidne i virusne DNK se koristi kao vektorski molekul u genetskom inženjeringu. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markera i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restriktaze. Takve zahtjeve, na primjer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruiran od originalnog plazmida koji se pojavljuje u prirodi korištenjem metoda koje se koriste pri radu sa recDNK; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, kao i jedno mjesto prepoznavanja za 19 različitih restriktaza. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresioni vektori, koji uz amplifikaciju osiguravaju ispravnu i efikasnu ekspresiju stranih gena u ćelijama primaocima. U nekim slučajevima, molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNK u genom ćelije ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka genetskog inženjeringa je stvaranje sojeva bakterija ili kvasca, staničnih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgeni organizmi), koji bi osigurali efikasnu ekspresiju gena kloniranih u njima. Visoki nivo proizvodnja proteina se postiže ako se geni kloniraju u višekopijskim vektorima, jer u ovom slučaju, ciljni gen će biti prisutan u ćeliji u velikom broju. Važno je da sekvenca koja kodira DNK bude pod kontrolom promotora koji je efektivno prepoznat od ćelijske RNK polimeraze i da rezultirajuća mRNA bude relativno stabilna i efikasno translativna. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primatelja ne bi trebao biti podvrgnut brzoj degradaciji unutarćelijskih proteaza. Prilikom stvaranja transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija uvedenih ciljnih gena.

Budući da je genetski kod univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisustvom u njegovom sastavu signala za inicijaciju i završetak transkripcije i translacije, koje ćelija domaćin pravilno prepoznaje. Budući da većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu strukturu egzon-intron, kao rezultat transkripcije takvih gena, formira se prekursor RNK (pre-mRNA) iz kojeg se, tokom naknadnog spajanja, nekodirajuće sekvence - introni se cijepaju i formira se zrela mRNA. Takvi geni se ne mogu eksprimirati u bakterijskim ćelijama kojima nedostaje sistem spajanja. Kako bi se prevladala ova prepreka, kopija DNK (cDNA) se sintetiše na zrelim mRNA molekulima pomoću reverzne transkriptaze, na koju se drugi lanac dovršava pomoću DNK polimeraze. Takvi fragmenti DNK koji odgovaraju kodirajućoj sekvenci gena (više nisu razdvojeni intronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući aminokiselinsku sekvencu ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, dobivši takozvani ekvivalentni gen, i ubaciti ga u odgovarajući ekspresijski vektor. Prilikom kreiranja ekvivalentnog gena obično se uzima u obzir svojstvo degeneracije genetskog koda (20 aminokiselina je kodirano 61 kodonom) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u onim stanicama u koje je ovaj gen planiran. treba uvesti, budući da se sastav kodona može značajno razlikovati u različitim organizmima. Pravilno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u ćeliji primaocu.

Vrijednost genetskog inženjeringa. Genetski inženjering je uvelike proširio eksperimentalne granice molekularne biologije, jer je postalo moguće uvesti stranu DNK u različite vrste ćelija i proučavati njene funkcije. To je omogućilo otkrivanje općih bioloških obrazaca organizacije i izražavanja genetskih informacija u različitim organizmima. Ovaj pristup je otvorio izglede za stvaranje fundamentalno novih mikrobioloških bioloških proizvođača aktivne supstance, kao i životinje i biljke koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mnogi ranije nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uključujući interferone, interleukine, peptidnih hormona, faktori krvi, počeli su se proizvoditi u velikim količinama u ćelijama bakterija, kvasca ili sisara i široko se koriste u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju himerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti genetskog inženjeringa su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i Bacilltis subtilis (bacil sijena), pekarski kvasac Saccharomices cerevisiae, različite ćelijske linije sisara. Spektar objekata uticaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju pravci istraživanja stvaranja transgenih biljaka i životinja. Najnovije generacije cjepiva protiv različitih infektivnih agensa kreirane su metodama genetskog inženjeringa (prva od njih stvorena je na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein humanog virusa hepatitisa B). Velika pažnja posvećena je razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisara i njihovoj upotrebi za stvaranje živih polivalentnih vakcina za potrebe veterine i medicine, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju kancerogenih tumora i nasljednih bolesti. Razvijena je metoda za direktno unošenje recDNK u ljudske i životinjske organizme, koja usmjerava proizvodnju antigena različitih infektivnih agenasa u njihovim stanicama (DNK vakcinacija). Najnoviji trend u genetskom inženjeringu je stvaranje jestivih vakcina na bazi transgenih biljaka kao što su paradajz, šargarepa, krompir, kukuruz, zelena salata, itd., koje proizvode imunogene proteine infektivnih agenasa.

Strahovi povezani s provođenjem eksperimenata genetskog inženjeringa. Ubrzo nakon prvih uspješnih eksperimenata na dobivanju recDNK, grupa naučnika predvođena P. Bergom predložila je ograničavanje brojnih eksperimenata genetskog inženjeringa. Ovi strahovi su se zasnivali na činjenici da je teško predvidjeti svojstva organizama koji sadrže strane genetske informacije. Mogu dobiti neželjene znakove, poremetiti ekološku ravnotežu, dovesti do pojave i širenja neobičnih bolesti kod ljudi, životinja i biljaka. Osim toga, uočeno je da je ljudska intervencija u genetski aparat živih organizama nemoralna i može izazvati nepoželjne društvene i etičke posljedice. 1975. o ovim problemima se raspravljalo na međunarodnoj konferenciji u Asilomaru (SAD). Učesnici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti s korištenjem metoda genetskog inženjeringa, ali uz obavezno poštivanje određenih pravila i preporuka. Naknadno su ova pravila, uspostavljena u nizu zemalja, značajno opuštena i svedena na metode uobičajene u mikrobiološka istraživanja, stvaranje posebnih zaštitnih uređaja koji sprečavaju širenje bioloških agenasa u okruženje, korištenje sigurnih vektora i stanica primatelja koje se ne razmnožavaju u prirodi.

Često se genetski inženjering shvata samo kao rad sa recDNK, a pojmovi „molekularno kloniranje“, „kloniranje DNK“, „kloniranje gena“ koriste se kao sinonimi za genetski inženjering. Međutim, svi ovi koncepti odražavaju sadržaj samo pojedinačnih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu "genetski inženjering". U Rusiji se izraz "genetski inženjering" široko koristi kao sinonim za genetski inženjering. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je drugačiji: genetski inženjering ima za cilj stvaranje organizama sa novim genetskim programom, dok termin "genetski inženjering" objašnjava kako se to radi - manipulacijom genima.

Lit.: Shchelkunov S. N. Kloniranje gena. Novosib., 1986; on je. genetski inženjering. 2. izd., Novosib., 2004; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Rekombinantna DNK. M., 1986; Kloniranje DNK. Metode. M., 1988; Novo u kloniranju DNK: Metode. M., 1989.

Uz pomoć kojih se provodi usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. Genetski inženjering (GE) omogućava prevazilaženje prirodnih međuvrstnih barijera koje onemogućavaju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama i stvaranje ćelija i organizama s kombinacijama gena kojih u prirodi nema, sa zadatim nasljednim svojstvima.

Glavni objekt uticaja genetskog inženjeringa je nosilac genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čiji se molekul obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost uparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog fundamentalne sličnosti u strukturi molekula DNK u svim vrstama organizama i stvarne univerzalnosti genetike. Kod omogućava ekspresiju stranih gena (ispoljavanje njihove funkcionalne aktivnosti) u bilo kojoj vrsti ćelije. Tome je doprinijelo i akumuliranje znanja iz oblasti hemije, identifikacija molekularnih karakteristika organizacije i funkcioniranja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnost podređivanja gena djelovanju "stranih"). regulatorni elementi), razvoj metoda sekvenciranja DNK, otkriće lančane reakcije polimeraze koja je omogućila brzu sintetizaciju bilo kojeg dijela DNK.

Važni preduslovi za pojavu G. i. bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijelaz iz jedne bakterijske ćelije u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagama, što je omogućilo formuliranje koncepta vektora - molekula nosača gena.

Od velikog značaja u razvoju metodologije G.I. igraju enzime uključene u transformaciju nukleinskih kiselina: restrikcijske enzime (prepoznaju striktno definirane sekvence (mjesta) u molekulama DNK i "presijeku" dvostruki lanac na tim mjestima), DNK ligaze (kovalentno vezuju pojedinačne fragmente DNK), reverznu transkriptazu (sintetizuju na RNA šablonu komplementarnu kopiju DNK, ili cDNK), itd. Samo ako su dostupne, stvaranje umjetnosti. konstrukcije je postao tehnički izvodljiv zadatak. Enzimi se koriste za dobijanje pojedinačnih DNK fragmenata (gena) i stvaranje molekularnih hibrida - rekombinantne DNK (recDNA) zasnovane na DNK plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u ćeliju domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju (kloniranje) i formiranje konačnog genskog proizvoda (njegovu ekspresiju) tamo.

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNK

Termin „G. i." postao široko rasprostranjen nakon što su 1972. P. Berg et al. Po prvi put je dobijena rekombinantna DNK, koja je bila hibrid u kojoj su povezani fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njenog virusa (bakteriofaga λ) i DNK virusa majmuna SV40. Godine 1973. S. Cohen et al. korišteni plazmid pSC101 i restrikcijski enzim ( Eko RI), koji ga razbija na jednom mjestu na način da se na krajevima dvolančane DNK molekule formiraju kratki komplementarni jednolančani "repovi" (obično 4-6 nukleotida). Zvali su ih "ljepljivi" jer se mogu pariti (nekako da se drže zajedno) jedno s drugim. Kada se takva DNK pomiješa s fragmentima strane DNK tretirane istim restrikcijskim enzimom i koji imaju iste ljepljive krajeve, dobijeni su novi hibridni plazmidi, od kojih je svaki sadržavao najmanje jedan fragment strane DNK umetnut u Eko RI mjesto plazmida. Postalo je očigledno da se u takve plazmide mogu ubaciti fragmenti različitih stranih DNK dobijenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Glavna trenutna strategija za dobijanje recDNK je sljedeća:

u DNK plazmida ili virusa sposobnog za reprodukciju neovisno o hromozomu, ubacuju se fragmenti DNK koji pripadaju drugom organizmu, koji sadrže odre. geni ili umjetno dobivene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača;
nastali hibridni molekuli se uvode u osjetljive prokariotske ili eukariotske stanice, gdje se repliciraju (množe, pojačavaju) zajedno sa fragmentima DNK ugrađenim u njih;
ćelijski klonovi se biraju u obliku kolonija na posebnim hranjivim podlogama (ili virusi - u obliku čistih zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih stanica ili kultura životinjskog tkiva) koje sadrže željene vrste recDNA molekula i podvrgavaju se njihovom raznovrsna strukturalna i funkcionalna studija.

Da bi se olakšala selekcija ćelija u kojima je prisutna recDNK, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (selekcija stanica koje sadrže recDNK vrši se prema njihovoj sposobnosti rasta u prisustvu jednog ili drugog antibiotika). RecDNK koje nose željene gene se biraju i uvode u ćelije primaoca. Od ovog trenutka počinje molekularno kloniranje – dobijanje kopija recDNK, a time i kopija ciljnih gena u njenom sastavu. Samo ako je moguće odvojiti sve transficirane ili inficirane ćelije, svaki klon će biti predstavljen zasebnom ćelijskom kolonijom i sadržavati određeni broj ćelija. recDNA. U završnoj fazi vrši se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Zasniva se na činjenici da umetanje u recDNK određuje neko jedinstveno svojstvo ćelije koja ga sadrži (npr. produkt ekspresije umetnutog gena). U eksperimentima na molekularnom kloniranju primjećuju se 2 glavna principa:

nijedna ćelija u kojoj se vrši kloniranje recDNK ne bi trebalo da primi više od jednog molekula plazmida ili virusne čestice;
potonji mora biti u stanju da se replicira.

Kao vektorski molekuli u G.I. koristi se širok spektar plazmidne i virusne DNK. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markeri i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restrikcije. Ovaj zahtev, na primer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruisan od plazmida koji se pojavljuje u prirodi korišćenjem metoda koje se koriste u radu sa recDNK; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, sadrži jedno mjesto prepoznavanja za 19 različitih restriktaza. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresioni vektori, koji uz amplifikaciju osiguravaju ispravnu i efikasnu ekspresiju stranih gena u ćelijama primaocima. U nekim slučajevima, molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNK u genom ćelije ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka G.I. - stvaranje sojeva bakterija ili kvasca, ćelijskih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgeni organizmi), koji bi osigurali efikasnu ekspresiju gena kloniranih u njima. Visok nivo proizvodnje proteina postiže se ako se geni kloniraju u višekopijskim vektorima, jer u ovom slučaju, ciljni gen će biti prisutan u ćeliji u velikom broju. Važno je da sekvenca koja kodira DNK bude pod kontrolom promotora koji je efektivno prepoznat od ćelijske RNK polimeraze i da rezultirajuća mRNA bude relativno stabilna i efikasno translativna. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primatelja ne bi trebao biti podvrgnut brzoj degradaciji unutarćelijskih proteaza. Prilikom stvaranja transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija uvedenih ciljnih gena.

Jer genetski kod je univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisustvom u njegovom sastavu signala za inicijaciju i završetak transkripcije i translacije, koje pravilno prepoznaje ćelija domaćina. Jer većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu ekson-intron strukturu; kao rezultat transkripcije takvih gena nastaje prekursor RNK (pre-mRNA) iz kojeg se prilikom naknadnog spajanja cijepaju nekodirajuće sekvence, introni, i formira se zrela mRNA. Takvi geni se ne mogu eksprimirati u bakterijskim ćelijama kojima nedostaje sistem spajanja. Kako bi se prevladala ova prepreka, kopija DNK (cDNA) se sintetiše na zrelim mRNA molekulima pomoću reverzne transkriptaze, na koju se drugi lanac dovršava pomoću DNK polimeraze. Takvi fragmenti DNK koji odgovaraju kodirajućoj sekvenci gena (više nisu razdvojeni intronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući sekvencu aminokiselina ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, čime se dobija tzv. ekvivalentnog gena i ubaciti ga u odgovarajući ekspresijski vektor. Prilikom stvaranja ekvivalentnog gena obično se uzima u obzir svojstvo genetske degeneracije. kod (20 aminokiselina je kodirano sa 61 kodonom) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u onim stanicama u koje se planira uvesti ovaj gen, tk. sastav kodona može značajno varirati u različitim organizmima. Pravilno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u ćeliji primaocu.

Značaj genetskog inženjeringa

G.i. značajno proširio eksperimentalne granice, jer je omogućio ulazak u dekomp. tipove stanica stranoj DNK i istražiti njene funkcije. To je omogućilo identifikaciju općih bioloških obrasci organizacije i izražavanja genet. informacije u raznim organizmi. Ovaj pristup je otvorio izglede za stvaranje fundamentalno novih mikrobioloških sistema. proizvođači biološki aktivnih supstanci. kao i životinje i biljke koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mn. ranije nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uklj. interferoni, interleukini, peptidni hormoni, krvni faktori počeli su se proizvoditi u velikim količinama u ćelijama bakterija, kvasca ili sisara, te se široko koriste u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju himerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti G.I. su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i bacil subtilis (štapić sijena), pekarski kvasac Saharomije cerevisiae, diff. ćelijske linije sisara. Spektar objekata uticaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju pravci istraživanja stvaranja transgenih biljaka i životinja. Metode G.I. stvaraju se najnovije generacije vakcina protiv raznih infektivnih agenasa (prva je stvorena na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein humanog virusa hepatitisa B). Velika pažnja posvećena je razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisara i njihovoj upotrebi za stvaranje živih polivalentnih vakcina za potrebe veterine i medicine, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju kancerogenih tumora i nasljednih bolesti. Razvijena je metoda za direktno uvođenje recDNK u ljudsko i životinjsko tijelo, koja usmjerava proizvodnju raspadajućih antigena u njihovim stanicama. infektivni agensi (DNK vakcinacija). Najnoviji pravac G.i. je stvaranje jestivih vakcina na bazi transgenih biljaka kao što su paradajz, šargarepa, krompir, kukuruz, zelena salata, itd., koje proizvode imunogene proteine infektivnih agenasa.

Zabrinutost u vezi s provođenjem eksperimenata genetskog inženjeringa

Ubrzo nakon prvih uspješnih eksperimenata na dobivanju recDNK, grupa naučnika predvođena P. Bergom predložila je ograničavanje brojnih eksperimenata genetskog inženjeringa. Ovi strahovi su se zasnivali na činjenici da svojstva organizama sadrže tuđu genetiku. informacije je teško predvidjeti. Mogu dobiti neželjene znakove, narušiti ekološki. ravnoteže, dovode do pojave i širenja neobičnih bolesti ljudi, životinja, biljaka. Osim toga, uočeno je da je ljudska intervencija u genetskoj aparat živih organizama je nemoralan i može izazvati nepoželjne društvene i etičke posljedice. O ovim problemima se 1975. raspravljalo na međunarodnoj. konferencija u Asilomaru (SAD). Njegovi sudionici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti koristiti G.I. metode. ali uz obavezno poštovanje pravila i preporuke. Naknadno su ova pravila, uspostavljena u nizu zemalja, značajno opuštena i svedena na uobičajene metode u mikrobiologiji. istraživanja, stvaranje specijal zaštitni uređaji koji sprečavaju širenje bioloških. uzročnike u okolišu, korištenje sigurnih vektora i stanica primatelja koje se ne razmnožavaju u prirodi.

Često pod G. i. razumiju samo rad sa recDNK, ali kao sinonime za G.I. koriste se izrazi "molekularno kloniranje", "kloniranje DNK", "kloniranje gena". Međutim, svi ovi koncepti odražavaju sadržaj samo pojedinačnih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu G.I. U Rusiji, kao sinonim za G.i. izraz "genetski inženjering" se široko koristi. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je drugačiji: G.i. ima za cilj stvaranje organizama s novom genetikom. programa, dok termin "genetski inženjering" objašnjava kako se to radi, tj. kroz manipulaciju genima.

Književnost

Shchelkunov S.N. Kloniranje gena. Novosibirsk, 1986; Watson J., Ace J.,Kurtz D. Rekombinantna DNK: Kratak kurs. M., 1986; Kloniranje DNK. Metode M., 1988; Novo u kloniranju DNK: Metode M., 1989. Shchelkunov S.N. genetski inženjering. 2. izdanje, Novosibirsk, 2004.

Ekonomski značaj

Genetski inženjering služi za dobijanje željenih kvaliteta modifikovanog ili genetski modifikovanog organizma. Za razliku od tradicionalnog uzgoja, tokom kojeg se genotip mijenja samo indirektno, genetski inženjering vam omogućava da direktno ometate genetski aparat, koristeći tehniku molekularnog kloniranja. Primjeri primjene genetskog inženjeringa su proizvodnja novih genetski modificiranih sorti usjeva, proizvodnja humanog inzulina korištenjem genetski modificiranih bakterija, proizvodnja eritropoetina u ćelijskoj kulturi ili nove rase eksperimentalnih miševa za naučna istraživanja.

Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska ćelija. Ćelije neophodne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim kriterijumima, od kojih je najvažniji sposobnost da proizvedu, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeno jedinjenje - aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organske kiseline. Ponekad je potrebno imati mikroorganizam koji može, na primjer, iskoristiti ulje ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine koji su sasvim prikladni za dodatke hrani. Ponekad su potrebni organizmi koji mogu rasti na povišenim temperaturama ili u prisustvu supstanci koje su nesumnjivo smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

Zadatak dobijanja ovakvih industrijskih sojeva je veoma važan, za njihovu modifikaciju i selekciju razvijene su brojne metode aktivnog uticaja na ćeliju - od tretmana snažnim otrovima do radioaktivnog zračenja. Svrha ovih tehnika je ista - postići promjenu nasljednog, genetskog aparata ćelije. Njihov rezultat je proizvodnja brojnih mutantnih mikroba, od kojih na stotine i hiljade naučnici potom pokušavaju odabrati najprikladnije za određenu svrhu. Stvaranje tehnika za hemijsku ili radijacijsku mutagenezu bilo je izvanredno dostignuće u biologiji i široko se koristi u modernim biotehnologija.

Ali njihove mogućnosti su ograničene prirodom samih mikroorganizama. Nisu u stanju da sintetiziraju niz vrijednih tvari koje se akumuliraju u biljkama, prvenstveno ljekovito i eterično ulje. Ne mogu sintetizirati tvari koje su vrlo važne za život životinja i ljudi, brojne enzime, peptidne hormone, imune proteine, interferone i još mnogo jednostavnije uređenih spojeva koji se sintetiziraju u životinjama i ljudima. Naravno, mogućnosti mikroorganizama su daleko od toga da su iscrpljene. Od obilja mikroorganizama, nauka, a posebno industrija, koristi samo mali dio. Za potrebe selekcije mikroorganizama od velikog su interesa, na primjer, anaerobne bakterije koje mogu živjeti u nedostatku kisika, fototrofi koji koriste svjetlosnu energiju poput biljaka, kemoautotrofi, termofilne bakterije koje mogu živjeti na temperaturi, kako je nedavno otkriveno. , od oko 110°C, itd.

Pa ipak, ograničenja "prirodnog materijala" su očigledna. Pokušavali su i pokušavaju zaobići ograničenja uz pomoć ćelijskih kultura i tkiva biljaka i životinja. Ovo je veoma važan i obećavajući način, koji se takođe primenjuje u biotehnologija. Tokom proteklih nekoliko decenija, naučnici su razvili metode pomoću kojih se pojedinačne ćelije biljnog ili životinjskog tkiva mogu učiniti da rastu i razmnožavaju se odvojeno od tela, poput ćelija bakterija. Ovo je bilo važno postignuće - dobivene ćelijske kulture se koriste za eksperimente i za industrijsku proizvodnju određenih tvari koje se ne mogu dobiti bakterijskim kulturama.

Istorija razvoja i dostignuti nivo tehnologije

U drugoj polovini 20. veka došlo je do nekoliko važnih otkrića i izuma koji su u osnovi genetski inženjering. Višegodišnji pokušaji "čitanja" bioloških informacija koje su "zabilježene" u genima uspješno su završeni. Ovaj rad započeli su engleski naučnik F. Sanger i američki naučnik W. Gilbert (Nobelova nagrada za hemiju). Kao što znate, geni sadrže informacije-instrukcije za sintezu RNA molekula i proteina u tijelu, uključujući enzime. Da bi se stanica natjerala da sintetizira nove, za nju neobične tvari, potrebno je da se u njoj sintetiziraju odgovarajući skupovi enzima. A za to je potrebno ili namjerno promijeniti gene u njemu, ili u njega uvesti nove, ranije odsutne gene. Promjene gena u živim stanicama su mutacije. Nastaju pod uticajem, na primer, mutagena - hemijskih otrova ili zračenja. Ali takve promjene se ne mogu kontrolirati niti usmjeravati. Stoga su naučnici svoje napore koncentrirali na pokušaje da razviju metode za uvođenje u ćeliju novih, vrlo specifičnih gena koji su potrebni osobi.

Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

1. Dobivanje izolovanog gena. 2. Uvođenje gena u vektor za prijenos u organizam. 3. Transfer vektora sa genom u modifikovani organizam. 4. Transformacija tjelesnih ćelija. 5. Selekcija genetski modifikovanih organizama ( GMO) i eliminisanje onih koji nisu uspješno modificirani.

Proces sinteze gena je trenutno vrlo dobro razvijen i čak u velikoj mjeri automatiziran. Postoje posebni uređaji opremljeni kompjuterima, u čijoj se memoriji pohranjuju programi za sintezu različitih nukleotidnih sekvenci. Takav aparat sintetiše DNK segmente dužine do 100-120 azotnih baza (oligonukleotida). Tehnika je postala široko rasprostranjena koja omogućava korištenje lančane reakcije polimeraze za sintezu DNK, uključujući mutantnu DNK. U njemu se za sintezu šablonske DNK koristi termostabilni enzim DNK polimeraza, koji se koristi kao sjeme za umjetno sintetizirane komade nukleinske kiseline - oligonukleotide. Enzim reverzne transkriptaze omogućava da se pomoću takvih prajmera (prajmera) sintetiše DNK na matriksu RNK izolovane iz ćelija. DNK sintetizirana na ovaj način naziva se komplementarna (RNA) ili cDNK. Izolovani, "hemijski čist" gen se takođe može dobiti iz biblioteke faga. Ovo je naziv preparata bakteriofaga, u čiji genom se ubacuju nasumični fragmenti genoma ili cDNK, koje fag reprodukuje zajedno sa svom svojom DNK.

Tehnika uvođenja gena u bakterije razvijena je nakon što je Frederick Griffith otkrio fenomen bakterijske transformacije. Ovaj fenomen se zasniva na primitivnom seksualnom procesu, koji je u bakterijama praćen razmjenom malih fragmenata nehromozomske DNK, plazmida. Plazmidne tehnologije bile su osnova za uvođenje umjetnih gena u bakterijske stanice.

Značajne poteškoće bile su povezane s uvođenjem gotovog gena u nasljedni aparat biljnih i životinjskih stanica. Međutim, u prirodi postoje slučajevi kada je strana DNK (virusa ili bakteriofaga) uključena u genetski aparat ćelije i uz pomoć svojih metaboličkih mehanizama počinje sintetizirati "vlastiti" protein. Naučnici su proučavali karakteristike unošenja stranog DNK i koristili ga kao princip za uvođenje genetskog materijala u ćeliju. Ovaj proces se naziva transfekcija.

Ako se modificiraju jednoćelijski organizmi ili kulture višećelijskih stanica, tada u ovoj fazi počinje kloniranje, odnosno selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su prošli modifikaciju. Kada je zadatak nabavke višećelijskih organizama, zatim se ćelije sa promijenjenim genotipom koriste za vegetativno razmnožavanje biljaka ili se ubrizgavaju u blastociste surogat majke kada su životinje u pitanju. Kao rezultat, mladunci se rađaju sa promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se biraju i križaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

Primjena u naučnim istraživanjima

Iako u malom obimu, genetski inženjering se već koristi kako bi se ženama s nekim vrstama neplodnosti dala šansa da zatrudne. Za to se koriste jaja. zdrava žena. Dijete kao rezultat nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke.

Međutim, mogućnost uvođenja značajnijih promjena u ljudski genom suočava se s nizom ozbiljnih etičkih problema.

Ekonomski značaj

Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska ćelija. Ćelije potrebne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim kriterijima, od kojih je najvažniji sposobnost da proizvedu, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeno jedinjenje - aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organsku kiselinu. . Ponekad je potrebno imati mikroorganizam koji može, na primjer, iskoristiti ulje ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine koji su sasvim prikladni za dodatke hrani. Ponekad su potrebni organizmi koji mogu rasti na povišenim temperaturama ili u prisustvu supstanci koje su nesumnjivo smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

Istorija razvoja i dostignuti nivo tehnologije

Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

Ako se modificiraju jednoćelijski organizmi ili kulture višećelijskih stanica, tada u ovoj fazi počinje kloniranje, odnosno selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su prošli modifikaciju. Kada se postavi zadatak dobijanja višećelijskih organizama, ćelije sa izmenjenim genotipom se koriste za vegetativno razmnožavanje biljaka ili se ubrizgavaju u blastociste surogat majke kada su u pitanju životinje. Kao rezultat, mladunci se rađaju sa promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se biraju i križaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

Primjena u naučnim istraživanjima

Iako u malom obimu, genetski inženjering se već koristi kako bi se ženama s nekim vrstama neplodnosti dala šansa da zatrudne. Da biste to učinili, koristite jaja zdrave žene. Dijete kao rezultat nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke.

Međutim, mogućnost uvođenja značajnijih promjena u ljudski genom suočava se s nizom ozbiljnih etičkih problema.

Podijeli: