Этапы метода флюоресцентной гибридизации in situ. FISH-тест: быстрая диагностика рака. Смотреть что такое "Флюоресцентная гибридизация in situ" в других словарях

FISH - один из удивительнейших «инструментов» молекулярной биологии XXI века. В преимплантационной диагностике исследовательская техника FISH применяется для выявления хромосомных аномалий или нарушений парности хромосом в клетках эмбриона, только что полученного методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Если аномалий или признаков анеуплоидии (нарушения парности, нехватки хромосомных пар) не обнаружено, то «искусственный» эмбрион признается жизнеспособным. Его можно имплантировать в матку будущей матери.

FISH позволяет также проследить половые признаки в наборе хромосом эмбриона. Это дает возможность определить пол будущего ребенка еще до фактического наступления беременности (если считать ее началом имплантацию внетелесно зачатого эмбриона в матку).

Что такое FISH?

Аббревиатура расшифровывается так: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, или флюоресцирующая гибридизация in-situ. Расшифровка, скорей всего, ничего не говорит несведущему читателю. Поэтому разберем сложное понятие по частям, оставив недопереведенное «in-situ» напоследок.

Гибридизация

В молекулярной биологии у этого термина совершенно особое значение, не имеющее ничего общего со скрещиванием видов в «обычной» биологии.

Гибридизация - это молекулярно-генетический прием, применяемый для оценки состояния ДНК и РНК исследуемых клеток. Он основан на соединении отдельных цепочек нуклеиновых кислот в единую молекулу. Таким образом проверяется комплементарность (взаимное соответствие) молекул или их фрагментов друг другу. При полной комплементарности цепочки легко и быстро объединяются в общую молекулу. Медленное объединение говорит о недостаточной комплементарности. Некомплементарность цепочек как раз и обусловлена хромосомными аномалиями (нарушениями порядка расположения хромосом на тех или иных участках), непарностью хромосом или отсутствием некоторых пар.

«Инструментом» для измерения комплементарности является температура, при которой цепочки ДНК гибридизируются в общую молекулу. Для этого требуется сначала нагреть препарат нуклеиновой кислоты, а затем, смешав его с другим нагретым препаратом, охладить. При нагреве водородные связи между цепочками ДНК или РНК исчезают, образуются одноцепочечные фрагменты молекул. Смешанные препараты двух ДНК или РНК (или ДНК - РНК) охлаждаются. При охлаждении водородные связи между комплементарными основаниями быстро восстанавливаются, образуется единая, гибридная молекула ДНК (РНК или ДНК - РНК). При недостатке комплементарности процесс идет дольше, некомплементарные фрагменты остаются неприсоединенными. Следовательно, чем выше температура гибридизации, тем гармоничней и правильней хромосомные строения клеток. Чем ниже температура, тем больше аномалий в хромосомах. На основе анализа некомплементарных остатков можно установить конкретные аномалии или участки анеуплоидии.

Флюоресцентная маркировка

Для анализа комплементарности гибридизирующей молекулы ДНК (или РНК) применяются особые генетические зонды (или ДНК-зонды), которые, конечно же, тоже имеют мало общего со своими «тезками», используемыми, например, в хирургии.

Генетические зонды это синтезированные и специально помеченные одноцепочечные ДНК (реже РНК) с заранее установленными свойствами комплементарности. При гибридизации они сливаются с определенными генетическими фрагментами, подтверждая таким образом их комплементарность. Расположение зондов в гибридизированной молекуле свидетельствует о нормальном или дефектном строении первоначального хромосомного материала, из которого собрано это «искусственное сооружение».

Генетические зонды помечают, в частности, светящимися (флюоресцирующими) веществами, что делает их заметными под объективом специального флюоресцентного микроскопа.

Применение различных красителей для нескольких зондов позволяет производить одновременный анализ различных генетических структур, например, выявлять участки хромосом с двумя наложенными друг на друга генами и прочие аномалии.

В настоящее время при проведении единого анализа генетические зонды метят пятью-шестью различными красителями, иногда даже семью.

In-situ значит «у себя дома»

Первоначальная техника гибридизации была громоздкой. Извлеченные ДНК денатурировались в особых термобуферах, смешивались в центрифуге с другими денатурированными фрагментами. Гибридизация также проводилась лабораторно, «в химической посуде».

Современная техника позволяет проводить анализы in-situ, то есть «на месте», «у себя дома», в первоначальных генетических структурах, а не в лабораторно изготовленных препаратах. Объектами исследования стали сами ядра клеток (извлеченных при биопсии полярных телец, бластомеров, поверхностных клеток бластоцисты).

Наблюдение за генетическим материалом прямо в ядрах клеток ускоряет процесс, делает его более «чистым», свободным от внешних влияний и повреждений, которые не исключены при изготовлении лабораторных препаратов.

Существуют, однако, и проблемы, указывающие на непреодолимые границы данного метода. Единой гибридизацией невозможно «охватить» весь набор хромосом в клетках. Необходимы обычно две-три последовательные гибридизации, позволяющие исследовать 12-15 хромосомных пар (а их у человека 23). Способность к дальнейшей гибридизации у цепочек ДНК после каждой их регибридизации постепенно снижается. Это не позволяет проводить гибридизацию «сколько угодно раз», для исчерпывающего анализа одного и того же генетического материала.

Техника FISH — Fluorescent in situ hybridization, разработана в середине 1980-х годов и используется для детекции присутствия или отсутствия специфических ДНК-последовательностей на хромосомах, а также альфа-сателлита ДНК, локализованного на центромере хромосомы 6, CEP6(6р11.1-q11.1).

Это дало существенный сдвиг в диагностике онкологических заболеваний меланоцитарного генеза произошел в связи с обнаружением опухолевых антигенов. На фоне злокачественной определяется мутация в трех антигенах: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) и CMM1(1p). В связи с этим возможность объективной дифференциальной диагностики, основанной на определении генетических характеристик меланоцитарных опухолей кожи, имеет большое значение в ранней диагностике меланомы и ее предшественников.В ядре с нормальным набором исследуемых генов и хромосомы 6 наблюдается два гена RREB1, окрашенных красным, два гена MYB, окрашенных желтым, два гена CCND1, выделенных зеленым цветом, и две центромеры хромосомы 6, обозначенные голубым цветом. С диагностической целью используются флуоресцентные пробы.

Оценка результатов реакции: проводится подсчет количества красного, желтого, зеленого и голубого сигналов в 30 ядрах каждого образца, выявляются четыре параметра различных вариантов генетических нарушений, при которых образец генетически соответствует меланоме. Например, образец соответствует меланоме, если среднее количество гена CCND1 на ядро ≥2,5. По этому же принципу производится оценка копийности других генов. Препарат считается FISH-положительным, если выполняется хотя бы одно из четырех условий. Образцы, в которых все четыре параметра ниже пограничных значений, расцениваются как FISH-отрицательные.

Определение специфических ДНК-последовательностей на хромосомах проводят на срезах биоптатов или операционного материала. В практическом исполнении FISH-реакция выглядит следующим образом: исследуемый материал, содержащий ДНК в ядрах меланоцитов, подвергается обработке для частичного разрушения ее молекулы с целью разрыва двухцепочной структуры и тем самым облегчения доступа к искомому участку гена. Пробы классифицируются по месту присоединения к молекуле ДНК. Материалом для FISH-реакции в клинической практике служат парафиновые срезы тканей, мазки и отпечатки.

FISH-реакция позволяет находить изменения, произошедшие в молекуле ДНК в результате увеличения числа копий гена, потери гена, изменения числа хромосом и качественных изменений — перемещения локусов генов как в одной и той же хромосоме, так и между двумя хромосомами.

Для обработки полученных данных при применении FISH-реакции и изучения зависимости между копийностью генов трех исследумых групп используется коэффициент корреляции Спирмена.

Для меланомы характерно увеличение копийности по сравнению с невусом и диспластическим невусом.

Простой невус по сравнению с диспластическим невусом имеет меньше нарушений в копийности (т.е. больше нормальных копийностей).

Для построения решающих правил, позволяющих предсказать, относится ли образец к тому или иному классу (дифференциальная диагностика простых и диспластических невусов), используется математический аппарат «деревьев решений» (decision trees). Данный подход хорошо зарекомендовал себя на практике, а результаты применения указанного метода (в отличие от многих других методов, например нейронных сетей) могут быть наглядно интерпретированы для построения решающих правил для дифференциации простого, диспластического невусов и меланомы. Исходными данными во всех случаях являлись копийности четырех генов.

Задачу по построению решающего правила для дифференциальной диагностики разбивают на несколько этапов. На первом этапе дифференцируют меланому и невус, не учитывая тип невуса. На следующем этапе строят решающее правило для разделения простого и диспластического невусов. Наконец на последнем этапе возможно построение «дерева решений» для определения степени дисплазии диспластического невуса.

Подобное разделение задачи классификации невусов на подзадачи позволяет достичь высокой точности предсказаний на каждом из этапов. Входными данными для построения «дерева решений» служат данные о копийности четырех генов для пациентов с диагнозом «меланома» и пациентов с диагнозом «не меланома» (пациенты с различными типами невуса — простым и диспластическим). Для каждого пациента имеются данные о копийности генов для 30 клеток.

Таким образом, разделение задачи предсказания диагноза на несколько этапов позволяет строить высокоточные решающие правила не только для дифференцирования между меланомой и невусами, но и для определения типа невусов и предсказания степени дисплазии для диспластического невуса. Построенные «деревья решений» являются наглядным способом предсказания диагноза по сведениям о копийностях генов и легко могут быть использованы в клинической практике при дифференциации доброкачественных, предзлокачественных и злокачественных меланоцитарных новообразований кожи. Предлагаемый дополнительный метод дифференциальной диагностики особенно важен при иссечении гигантских врожденных пигментных невусов и диспластических невусов у пациентов детского возраста, поскольку при обращении таких пациентов в медицинские учреждения отмечается высокий процент диагностических ошибок. Результаты использования описанного метода высокоэффективны, целесообразно его использовать при диагностике пигментных опухолей кожи, особенно у пациентов с FAMM-cиндромом.

Во всех без исключения случаях образование и рост связано с деятельностью гена типа HER2. Именно он отвечает за то, какое количество белков будет выделено женскому организму для развития тканей молочной железы. Когда перерождаются первые здоровые клетки в злокачественные, в рецепторы гена поступает информация о том, что требуется дополнительное деление клеточного материала.

Ген запускает программу наращивания дополнительных тканей внутри груди, хотя на самом деле этот клеточный материал будет использован опухолью для своего роста и развития. Так, карцинома, по сути, обманывает организм, и заставляет его питать рак за счет своих же ресурсов.

Задача фиш анализа при раке молочной железы, как раз и заключается в том, чтобы выявить неправильную работу гена HER2, и предпринять соответствующие меры реагирования в части назначения адекватного медицинского лечения.

Если своевременно не провести фиш тест при раке молочной железы, то даже в случае применения в процессе лечения тех или иных препаратов - это может привести к тому, что опухоль и дальше будет агрессивно развиваться, охватывать все новые ткани груди. Это так званые, последствия не правильно назначенной терапии из-за отсутствия объективных данных о функционировании HER2 гена.

В процессе прохождения фиш анализа врачом вводится в кровь пациентки специальные вещества, содержащие окрашивающие элементы, которые способны визуаллизировать картину хромосомных нарушений. Таким образом, доктор способен наглядно увидеть, а в дальнейшем изучить генетические аномалии в геноме женщины, которые привели к развитию онкологии груди.

Если отклонения в работе гена HER2 подтверждаются, то назначается соответствующее лечение. Если же нет, то врач с помощью других анализов устанавливает иную причину развития РМЖ.

Еще одним важным достоинством фиш анализа является то, что уже через пару дней пациент получает комплексный отчет о генетической предрасположенности к развитию того или иного онкологического заболевания. С помощью данного медицинского тестирования можно одновременно диагностировать патологию не только молочной железы, но и всех органов брюшной полости.

Информативное видео

Подобно тому, как в ходе Саузерн-блоттинга нуклеотидные зонды используют для идентификации фрагментов ДНК, цитогенетики могут применять подобные зонды для анализа хромосомных аберраций. Для этого гибридизируют меченные флюоресцентным красителем зонды с ДНК, содержащейся в фиксированных хромосомах на предметных стеклах.

Эта техника называется Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH ), поскольку , содержащаяся в интерфазном хроматине или в метафазных хромосомах, фиксирована и денатурируется на стекле в одном месте (т.е. in situ), для обработки меченым зондом, гибридизирующимся с хромосомной ДНК. Зонд флюоресцирует при освещении хромосом светом с длиной волны, возбуждающей флюоресцентный краситель. Положение гибридизационного сигнала и, таким образом, позицию сегмента ДНК с гибридизированным зондом определяют микроскопически.

Обычно для FISH-анализа используют зонды - фрагменты ДНК, имеющие уникальное положение в хромосоме. Такие зонды проходят гибридизацию и помечают место в каждой гомологичной хромосоме, соответствующее нормальному положению последовательности зонда. FISH-зонд также может быть сложной смесью ДНК, полученной из всего плеча или даже целой хромосомы. В зависимости от состава зонда, при гибридизации с ним помечается вся хромосома или ее часть.

Такие смеси зондов известны как хромосомные зонды. Наконец, можно объединить 24 различных хромосомных зонда, меченных различными комбинациями флюоресцентных красителей, испускающих свечение разной длины волны, для каждой из 24 хромосом человека. Каждая хромосома помечается зондом с собственной характерной комбинацией длин световой волны. Все 24 хромосомных зонда объединяют и используют для FISH-анализа метафазных хромосом. Эта техника известна как спектральное кариотипирование (SKY).

Поскольку каждый хромосомоспецифичный зонд имеет флюоресценцию с собственной комбинацией длин волн, мутантные хромосомы, состоящие из частей различных хромосом, при SKY-анализе хорошо различаются, а хромосомы, включенные в перестройку, могут быть легко идентифицированы. FISH, использующий единичную непрерывную последовательность нуклеотидов, хромосомоспецифические зонды и SKY-метод с комбинацией зондов для всех хромосом, широко применяют в клинической цитогенетике для обнаружения хромосомных аберраций, таких как делеции, инсерции и транслокализации.

Флюоресцентная гибридизация in situ

Флюоресце́нтная гибридиза́ция in situ , или метод FISH (англ. Fluorescence in situ hybridization - FISH ) - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ . Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани . В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Зонды

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды , меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин - при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3-4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР -реакции, меченые олигонуклеотиды , а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции .

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

Схема эксперимента по флюоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс п.о), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида , что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов - эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

Литература

• Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2006. 152 с.

• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий. Глава в книге «Введение в молекулярную диагностику» Т. 2. «Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний» / Под ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. Учебная литература для студентов медицинских вузов. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Примечания

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Флюоресцентная гибридизация in situ" в других словарях:

У этого термина существуют и другие значения, см. гибридизация. Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности… … Википедия