Una manifestazione della reazione di agglutinazione è. Reazione di agglutinazione (RA), meccanismo e modalità di presa. Ingredienti e come ottenerli. L'uso della RA nella diagnosi delle malattie infettive. Possibili tipi di agglutinazione nella determinazione del gruppo sanguigno
La reazione di agglutinazione si basa sull'interazione specifica degli anticorpi (agglutinine) con intere cellule microbiche o di altro tipo. Come risultato di questa interazione, si formano particelle-agglomerati che precipitano (agglutinato). Batteri, protozoi, funghi, lieviti, rickettsia, eritrociti e altre cellule, sia vive che uccise, possono partecipare alla reazione di agglutinazione. La reazione procede in due fasi: la prima è la combinazione specifica dell'antigene e dell'anticorpo, la seconda è aspecifica, cioè la formazione di un agglutinato visibile. La precipitazione dell'agglutinato si verifica in presenza di elettroliti, come il cloruro di sodio. I microrganismi nell'agglutinato rimangono vivi, ma perdono la loro mobilità.
La reazione di agglutinazione è ampiamente utilizzata per la diagnosi sierologica di malattie infettive e per la determinazione della struttura antigenica di microbi isolati. Per stabilire la struttura antigenica di un agente patogeno isolato dal corpo di un paziente o portatore, viene utilizzato un siero immunitario specifico ottenuto immunizzando animali (coniglio, asino, montone) con determinati microrganismi. L'identificazione del microbo viene effettuata nella reazione di agglutinazione su vetro con sieri adsorbiti o monorecettori o in provette con sieri agglutinanti specifici. I sieri adsorbiti contengono anticorpi solo contro antigeni specifici di un dato microbo e i sieri monorecettori contengono anticorpi solo contro un antigene specifico del patogeno.
I sieri di specie contengono anticorpi contro tutti gli antigeni di un particolare microbo.
L'affiliazione della coltura isolata di un microrganismo a questa specie è determinata dall'agglutinazione con il suo siero noto al titolo anticorpale indicato sull'etichetta della fiala di siero. Il titolo degli anticorpi sierici è considerato l'ultima diluizione di esso, in cui si osserva ancora l'agglutinazione della coltura di microbi utilizzata per immunizzare l'animale. I sieri adsorbiti e monorecettori vengono solitamente utilizzati non diluiti nella reazione di agglutinazione su vetro.
Quando si determina la presenza di anticorpi nel siero del sangue del paziente, viene diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio, a partire da una diluizione da 1: 50 a 1: 800 o più. Ad ogni diluizione viene aggiunta una sospensione di microbi vivi o uccisi. I preparati contenenti microbi uccisi dal calore o dalla formalina sono chiamati diagnosticum. I diagnosticum ottenuti riscaldando colture di microrganismi contengono solo antigeni somatici. Quando viene utilizzata solo la formalina, anche gli antigeni flagellari vengono conservati nei microbi.
In presenza di anticorpi nel sangue del paziente, il diagnosticum prelevato nella reazione si attacca e si forma un precipitato (agglutinato) in due provette. In questo caso, i risultati della reazione di agglutinazione sono considerati positivi. Nella provetta di controllo, dove vengono aggiunti la soluzione isotonica di cloruro di sodio e il diagnosticum, la sospensione dei microbi deve essere omogenea (reazione di agglutinazione negativa).
La contabilizzazione dei risultati della reazione di agglutinazione in alcune malattie, come la leptospirosi, viene eseguita solo al microscopio nel campo visivo oscuro del microscopio (microagglutinazione). Per fare una diagnosi sierologica di una malattia, viene presa in considerazione la malattia diagnostica. Di solito corrisponde a una diluizione del siero di 1:100 o 1:200.
Gli anticorpi nel siero del sangue del paziente che utilizzano la reazione di agglutinazione possono essere rilevati in caso di febbre tifoide e paratifo (reazione di Vidal), brucellosi (reazione di Wright), tularemia, ecc.
Reazione Castellani. Con alcune malattie infettive o immunizzazione con microrganismi che hanno antigeni di gruppo nella loro composizione, oltre agli anticorpi specifici per questo tipo, nel siero del sangue compaiono anche anticorpi di gruppo. In questo caso, le specie batteriche correlate saranno agglutinate dai sieri risultanti.
Castellani ha proposto un metodo per l'adsorbimento di anticorpi di gruppo dai sieri immuni, basato sulla loro rimozione con l'aiuto di microrganismi di specie affini che hanno antigeni di gruppo, ma mancano di specifici. La coltura di tali microrganismi, aggiunta al siero, assorbe anticorpi di gruppo non specifici e, dopo la rimozione del complesso antigene-anticorpo mediante centrifugazione, nel siero rimangono solo immunoglobuline specifiche. I sieri trattati secondo il metodo Castellani possono essere utilizzati nella reazione di agglutinazione in quanto altamente specifici.
reazioni immunitarie. L'uso delle risposte immunitarie nella diagnosi delle malattie infettive.
PIANO:
Tipi di reazioni immunitarie.
Condizioni per condurre reazioni sierologiche.
Requisiti di siero.
Il concetto di risultati positivi e negativi.
CONTENUTO PRINCIPALE:
Tipi di reazioni immunitarie.
Reazione immunologica – questa è l'interazione di un antigene con un anticorpo, che è determinata dall'interazione specifica dei centri attivi dell'anticorpo (paratopo) con gli epitopi dell'antigene.
Classificazione generale delle reazioni immunologiche:
reazioni sierologiche – reazioni tra antigeni (Ag) e anticorpi (Ig)
in vitro ;
reazioni cellulari con la partecipazione di cellule immunocompetenti;
test allergici - rilevamento di ipersensibilità.
Reazioni sierologiche: 1) definizione, 2) fasi, 3) definizione degli obiettivi, 4) classifica generale.
1) Definizione
Metodi di ricerca sierologica (dal lat. Siero - siero e loghi - insegnamento) utilizzando una reazione antigene-anticorpo.
2) Fasi
2 fasi di interazione:
IO. specifico (visibile) - arriva rapidamente, gli anticorpi si combinano con i loro antigeni corrispondenti. In questa fase interagiscono gruppi determinanti di antigeni (AG) e centri attivi di anticorpi (AT).
Le forze coinvolte nella formazione del complesso AG + AT sono:
Coulomb;
Van der Waal
Legami di idrogeno.
Non ci sono cambiamenti visibili in questa fase. Al microscopio elettronico, il complesso AG + AT sotto forma di un reticolo.
II. Non specifico - arriva lentamente, il complesso antigene-anticorpo formato reagisce con un ulteriore fattore non specifico dell'ambiente in cui si verifica la reazione, e questo è visibile all'occhio - incollaggio, dissoluzione, precipitazione di scaglie, ecc. In presenza di un elettrolita, la carica diminuisce, la solubilità diminuisce, si formano conglomerati visibili precipitati (agglutinato).
3) Stabilire obiettivi :
a) per identificare l'antigene (siero noto per la diagnosi di anticorpi):
identificazione sierologica (identificazione di specie);
sierotipizzazione (determinazione di un sierotipo) - determinazione di un ceppo;
in materiale patologico (diagnostica espressa);
in pura cultura:
b) per rilevare gli anticorpi (Ig) (antigene noto-diagnosticum):
presenza (reazioni qualitative);
quantità (aumento del titolo - il metodo dei "sieri accoppiati").
4) Classifica generale reazioni sierologiche :
a) semplice (2 componenti: Ag + Ig):
reazioni di agglutinazione RA (con antigene corpuscolare);
Reazioni di precipitazione RP (con antigene solubile);
b) complesso (3 componenti: Ag + Ig + C);
c) utilizzando un'etichetta.
Varianti della reazione di agglutinazione e precipitazione
Reazione di agglutinazione :
La reazione di agglutinazione (RA) è una reazione immunitaria dell'interazione di una sospensione di AG (eritrociti, batteri) con AT in una soluzione fisiologica.
Durante l'agglutinazione, le particelle di AT si uniscono formando un precipitato flocculante.
La reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA) è un tipo di reazione di agglutinazione in cui viene utilizzato un anticorpo o un diagnosticum antigenico degli eritrociti (eritrociti con AT o AG adsorbiti sulla loro superficie).
Gli eritrociti in questa reazione agiscono come vettori passivi.
La valutazione dei risultati dell'RPGA viene effettuata come segue:
- a reazione positiva eritrociti incollati passivamente coprono il fondo del foro a forma di U o V con uno strato uniforme con bordi smerlati ("ombrello");
- a contraccolpo (mancanza di agglutinazione), gli eritrociti si accumulano nella rientranza centrale del foro, formando un "bottone" compatto con bordi nettamente definiti.
Il test di inibizione dell'emoagglutinazione (HITA) viene utilizzato nella diagnosi delle infezioni virali. Alcuni virus contengono la proteina emoagglutinina sulla loro superficie, che unisce i globuli rossi. L'aggiunta di anticorpi antivirali specifici blocca l'emoagglutinina virale - non c'è emoagglutinazione.
La reazione di emoagglutinazione indiretta (RIHA), o reazione di Coombs, viene utilizzata per determinare gli anticorpi incompleti. L'aggiunta di siero antiglobulina (AT contro Ig umane) migliora i risultati della reazione. RNGA viene utilizzato per determinare il fattore Rh.
Per impostare una reazione di agglutinazione (RA), sono necessari tre componenti:
1) antigene (agglutinogeno) AG;
2) anticorpo(agglutinina) AT;
3)
elettrolita
(soluzione isotonica di cloruro di sodio).
Ag + AT + elettrolita = agglutinato
Agglutinazione (dal latino agglutinatio - incollaggio) - incollaggio di corpuscoli (batteri, eritrociti, ecc.) Con anticorpi in presenza di elettroliti - cloruro di sodio.
L'AR si manifesta sotto forma di fiocchi o sedimenti, costituiti da corpuscoli (ad esempio batteri, eritrociti), "incollati insieme" da anticorpi.
RA è usato per:
Reazione di agglutinazione diretta di microbi (RA).
In questa reazione, gli anticorpi (agglutinine) agglutinano direttamente gli antigeni corpuscolari (agglutinogeno).
Solitamente sono rappresentati da una sospensione di microrganismi inattivati (reazione di agglutinazione microbica).
utilizzato per determinare il tipo di microrganismoagglutinante diagnostico standard siero ( noto AT ).
I più comuni sono lamellare (indicativo) e dispiegato RA.
Lamellare RA è posto su vetro. Viene utilizzato come metodo accelerato per rilevare gli anticorpi o identificare i microrganismi.
Componenti:
1. sieri agglutinanti diagnostici standard (AT);
2. testare la coltura pura del paziente;
3. soluzione salina.
Nella coltura pura studiata, gli antigeni (AG) sono sotto forma di particelle (cellule microbiche, eritrociti e altri antigeni corpuscolari), che sono attaccati insieme da anticorpi e precipitano.
Esempio:
messa in scena indicativo reazioni di agglutinazione (RA ) su vetro per identificare i batteri del gruppo intestinale.
Le gocce vengono applicate su un vetrino:
1
dissenteria
;
2
-esima goccia: - siero agglutinante ai patogenitifo
;
(1-2 sieri diagnostici)
3
-esima goccia: - soluzione salina (controllo).
La coltura pura di batteri testata viene aggiunta a ogni goccia. Agitare.
Risultato
:
positivo
- la presenza di scaglie di agglutinato,
negativo
- senza scaglie di agglutinato
Conclusione:I batteri studiati sono gli agenti causali della febbre tifoide (sono stati determinati gli antigeni).
Per determinare gli anticorpi nel siero del paziente (diagnosi sierologica), un microbico standarddiagnostico contenente sospensionefamoso microbi o loro antigeniAG .
Determinazione dei gruppi sanguigni del sistema ABO (reazione di emoagglutinazione (RHA)) - eritrociti agglutinati.
Componenti di reazione:
1. sangue per test AG (globuli rossi).
2. AT (eritrotest - tsolicloni)
Set di zoliclone:
Reagente Tsoliklon anti-A (rosa)
Reagente Tsoliklon anti-B (blu)
Reagente anti-AB Zoliclone (incolore)
3. elettrolita (soluzione salina)
Tecnica di definizione:
1
.
Una goccia (0,1 ml) di tsoliklon anti-A, anti-B e anti-AB (per il controllo) viene applicata ai pozzetti della compressa.
2.
Una piccola goccia (0,05-0,01 ml) del sangue del test viene applicata accanto a ciascuna goccia del reagente.
Quindi una goccia di tsoliklon viene mescolata con una goccia di sangue con una singola bacchetta di vetro pulita.
3.
La reazione di agglutinazione si sviluppa durante i primi 3-5 secondi quando la piastra viene fatta oscillare delicatamente.
I risultati della reazione vengono presi in considerazione 2,5 - 3 minuti dopo la miscelazione delle gocce. Da sinistra a destra nei pozzetti anti-A, anti-B, anti-AB.
Un risultato positivo è la comparsa di un precipitato granulare (agglutinato).
RA positivo (+)
Negativo - nessun sedimento.
RA negativo(-)
4.
Analisi dei risultati.
o(io) α β – nessuna agglutinazione
UN(II) β – agglutinazione con anti-A
B(III) α – agglutinazione con anti-B
AB(IV)O - agglutinazione con anti-A, con anti-B
Rappresentazione schematica dell'agglutinazione.
Antigeni AH sugli eritrociti (rilevati) + anticorpoA(tsoliclone) siero diagnostico
Contabilità dell'agglutinazione in lastre
Reazione di precipitazione:
La reazione di precipitazione è una reazione immunitaria dell'interazione di AG allo stato solubile con AT in soluzione salina.
Durante la precipitazione si verifica la formazione di un complesso immunitario macromolecolare, che si manifesta con la transizione di una soluzione colloidale trasparente in una sospensione opaca o precipitato.
La quantità di entrambi i reagenti deve essere in rapporti rigorosamente definiti, poiché un eccesso di uno di essi riduce il risultato.
Esistono vari modi per impostare una reazione di precipitazione.
1. La reazione di precipitazione ad anello viene messa in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. AG e AT si mescolano a causa del movimento termico delle molecole e interagiscono. Con esito positivo si forma un anello di precipitato opaco al confine delle due soluzioni.
2. La reazione di doppia immunodiffusione di Ouchterlony viene eseguita in un gel di agar, nei cui pozzetti viene aggiunta una soluzione di AG o una soluzione di AT secondo lo schema. AG e AT si diffondono nel gel l'uno verso l'altro e, se la reazione è positiva, formano immunocomplessi, visibili come linee di precipitazione.
Reazione di precipitazione -questa formazionee precipitazione del complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, detto precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti.
Componenti RA:
siero precipitante (noto come AT-precipitina);
siero del test (AG-precipitinogeno sconosciuto);
fisico Soluzione.
La reazione di precipitazione viene posta in o in speciali provette strette (reazione di precipitazione ad anello) o in piastre Petri in gel, mezzi nutritivi, ecc.
Reazione di precipitazione ad anello
Rendicontazione e contabilizzazione dei risultati della reazioneprecipitazione anulareper rilevare l'agente eziologico dell'antrace (reazione di Ascoli).
messa in scena .
1. Il materiale di prova (pelle, lana, feltro, setole, stoffa, carne, terra, feci animali, ecc.) viene fatto bollire in soluzione fisiologica per 5-45 minuti. per ottenere un estratto isotonico (estratto). Filtro.
2. Versare il siero anti-antrace precipitante nella provetta.
3. Stratificare con cura il materiale di prova (estratto).
Contabilità .
Entro i prossimi 10 min. al confine tra il siero e l'estratto, nei casi positivi, compare un anello di torbidità (precipitazione ad anello). La reazione di Ascoli è molto sensibile e specifica
Con il suo aiuto, è possibile identificare rapidamente i materiali infetti dall'antrace.
Reazione di precipitazione in agar
Rendicontazione e contabilizzazione dei risultatireazioni di precipitazione dell'agarper determinare la tossigenicità dei corinebatteri (agenti causali della difterite)
messa in scena
Posto su agar fosfato-peptone in una capsula di Petri.
1. Una striscia di carta da filtro sterile inumidita consiero antitossico.
2. Dopo l'asciugatura, a una distanza di 1 cm dal bordo della striscia, vengono seminate placche con un diametro di 10 mmcolture isolate.
In una tazza puoi seminare da 3 a 10 raccolti, uno dei quali,controllo, deve essere conosciutotossigeno.
I raccolti sono posti in un termostato.
Contabilità
L'analisi viene effettuata dopo 24-48-72 ore.
Risultato positivo - (culturatossica) - a una certa distanza dalla striscia di carta sorgonolinee precipitate, « frecce a viticcio”, che sono chiaramente visibili in luce trasmessa.
La figura mostra la reazione di precipitazione in agar per determinare la tossigenicità dei bacilli difterici. Le colture medie non hanno formato "antenne a freccia", non sono agenti patogeni tossicogeni.
I ceppi dell'agente eziologico della difterite possono essere tossici (che producono esotossina) e non tossici. La formazione dell'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago che trasporta il gene tox che codifica per la formazione dell'esotossina.
In caso di malattia, tutti i patogeni della difterite vengono testati per la tossigenicità: la produzione di esotossina difterica utilizzando una reazione di precipitazione in agar
Reazioni sierologiche complesse ( 3 componenti: Ag + Ig + C):
Reazione di fissazione del complemento (RSC).
La reazione viene condotta in due fasi.
Nella prima fase, gli anticorpi interagiscono con AG e complemento; nella seconda fase viene aggiunto un indicatore: il sistema emolitico (una miscela di eritrociti e siero antieritrocitario).
Con un risultato positivo, nella prima fase, AT forma un immunocomplesso con AG, che lega il complemento della miscela di reazione.
In questo caso, gli eritrociti del sistema emolitico aggiunti al secondo stadio non vengono distrutti.
Altrimenti, il complemento non legato provoca la lisi dei globuli rossi indicatori.
Richiede cinque ingredienti: AG, AT e complemento (primo sistema), eritrociti di montone e siero emolitico (secondo sistema) (Fig. 1).
La reazione procede in due fasi (Fig. 3).
Prima fase - l'interazione di antigene e anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento.
Secondo - identificazione dei risultati della reazione mediante un sistema emolitico indicatore (eritrociti di pecora e siero emolitico). La distruzione degli eritrociti da parte del siero emolitico si verifica solo in caso di attacco del complemento al sistema emolitico. Se il complemento è stato adsorbito in precedenza sul complesso antigene-anticorpo, l'emolisi degli eritrociti non si verifica (Fig.).
Il risultato dell'esperienza
valutare (Fig. 2), rilevando la presenza o assenza di emolisi in tutte le provette. La reazione è considerata positiva con un completo ritardo nell'emolisi, quando il liquido nella provetta è incolore e gli eritrociti si depositano sul fondo, negativo - con completa lisi degli eritrociti, quando il liquido è intensamente colorato (sangue "lacca") .
Il grado di ritardo dell'emolisi è stimato in base all'intensità del colore del liquido e alla quantità di sedimento eritrocitario sul fondo (++++, +++, ++, +).
Riso. 4. Dichiarazione e risultato di RSC.
Conclusione:Gli anticorpi sono stati rilevati nel siero studiato.
RSK consente di rilevare gli anticorpi contro qualsiasi ceppo dello stesso sierotipo virale.
Il valore diagnostico è:
un aumento di quattro volte del titolo anticorpale nei sieri accoppiati (durante un'epidemia di influenza);
un duplice aumento del siero del sangue di pazienti con un quadro clinico caratteristico.
Etichetta reazioni :
Questi metodi sono altamente sensibili. Coloranti, isotopi radioattivi, enzimi, ecc. sono usati come etichette per antigeni o anticorpi.
RIF - reazione di immunofluorescenza
La reazione di immunofluorescenza si basa sull'indicazione luminosa del complesso antigene-anticorpo
Saggio di immunoassorbimento collegato.
Un moderno studio di laboratorio, durante il quale si ricercano anticorpi specifici nel sangue o antigeni per malattie specifiche al fine di identificare non solo l'eziologia, ma anche lo stadio della malattia.
I risultati ELISA possono essere emessi qualitativamente e quantitativamente.
Attualmente, l'ELISA viene utilizzato nelle seguenti situazioni:
1) ricerca di anticorpi specifici per qualsiasi malattia infettiva;
2) ricerca di antigeni di eventuali malattie (malattie infettive, veneree);
3) studio dello stato ormonale del paziente;
4) esame per marcatori tumorali;
5) esame per la presenza di malattie autoimmuni.
Nella figura, ELISA in fase solida - antigeni noti (a sinistra) sono adsorbiti sul pozzetto della piastra, (a destra) sui pozzetti della piastra sono noti anticorpi
Vantaggi del metodo ELISA:
1) Elevata specificità e sensibilità del metodo ELISA (oltre il 90%).
2) La capacità di determinare la malattia e tracciare la dinamica del processo, ovvero confrontare la quantità di anticorpi in diversi intervalli di tempo.
3) Disponibilità della diagnostica ELISA in qualsiasi istituto medico.
Carenza relativa: rilevamento di una risposta immunitaria (anticorpi), ma non dell'agente patogeno stesso, coniugata con un'etichetta enzimatica.
Impostazione ELISA (meccanismo generale):
La base del test di immunoassorbimento enzimatico è la reazione immunitaria di un antigene e di un anticorpo con la formazione di un complesso immunitario: un antigene-anticorpo, che si traduce in un cambiamento nell'attività enzimatica di etichette specifiche sulla superficie degli anticorpi.
Componenti di reazione:
1. AG(AT) noto - sul pozzetto della compressa.
2. AT (AG) indagato.
3. AT con un enzima specifico del complesso AT(AG)-AG(AT).
4.substrato cromogenico che interagisce con l'enzima
5. fermare la soluzione
Le fasi principali dell'ELISA
1. Sulla superficie dei pozzetti della compressa c'è un antigene purificato di un patogeno specifico. A loro viene aggiunto il materiale biologico del paziente, si verifica una reazione specifica tra questo antigene e l'anticorpo desiderato (immunoglobulina). Si forma un complesso.
2. Viene aggiunto un coniugato - AT con un enzima. Il coniugante è specifico del complesso AT-AG del primo stadio. L'enzima è attivato.
3. Viene aggiunto un substrato e l'enzima attivo interagisce con esso, cambiando il colore incolore della soluzione.
4. Viene aggiunta una soluzione di arresto per interrompere l'interazione enzima-substrato.
Contabilità.
Un risultato positivo è un cambiamento di colore, nella figura: giallo.
Analisi immunocromatografica
Il metodo di analisi immunocromatografica (ICA, test rapidi) è un metodo preliminare di screening qualitativo che consente di analizzare rapidamente, in pochi minuti, in qualsiasi condizione, incl. "campo".
I vantaggi dell'ICA includono:
Velocità e facilità d'uso;
Piccoli volumi di campione, nessuna preparazione del campione;
Economicità per il produttore e il consumatore;
Capacità di produrre test in grandi volumi;
Facilità di lettura e interpretazione del risultato;
Alta sensibilità e riproducibilità;
Possibilità di determinazione quantitativa;
La possibilità di utilizzare lettori portatili compatibili con un computer;
Possibilità di multianalisi.
Componenti (applicati sulla striscia reattiva):
1. Coniugato marcato con oro colloidale - specifico per l'AG determinato.
2. AT della linea di prova - specifico per il complesso AT-AG
3. Gli addominali della linea di controllo sono specifici del coniugato.
Impostazione IHA:
1. Applicazione del campione all'area di partenza designata della striscia.
2. Ottenere un risultato sotto forma di comparsa di bande colorate al posto delle linee di prova e di controllo.
Contabilità
Positivo: durante la colorazione della linea del test.
Negativo - in assenza di colorazione della linea del test.
Non valido - in assenza di colorazione della linea di controllo.
Meccanismo generale dell'IHA:
1. Il campione viene posizionato sul campo di partenza (campione pad) e legato al coniugato (corpo specifico con segno colorato) situato sul coniugato pad. Di conseguenza, si forma un complesso colorato.
2. Il complesso immunitario colorato risultante si muove sotto l'azione delle forze capillari lungo la membrana di nitrocellulosa e interagiscecon linea di prova AT.Il risultato è un'unica striscia rosa-rossa colorata.
3. Abs non legato sulla banda del test (coniugato)avanza e raggiunge la linea di controllo, si lega all'AT della linea di controllo.Di conseguenza, appare una seconda fascia colorata.Se l'analisi viene eseguita correttamente, dovrebbe apparire sempre la linea di controllo, indipendentemente dalla presenza dell'antigene indagato (anticorpo) nel campione di fluido biologico.
2. Condizioni per condurre reazioni sierologiche.
1. La presenza di omologo - corrispondente l'un l'altro antigene e anticorpo.
2. Piatti puliti e asciutti.
3. Un certo rapporto di farmaci (il più delle volte uguale).
4. Presenza obbligatoria di elettrolita (soluzione isotonica di NaCl).
5. pH neutro o vicino a leggermente alcalino.
6. Temperatura + 37 ° С o temperatura ambiente (necessariamente positiva).
7. Vengono eseguiti il controllo dell'antigene e il controllo del siero (anticorpi).
3 Requisiti del siero
Il siero deve essere completamente limpido senza alcuna miscela di cellule.
Solitamente ottenuto alla settimana 2 della malattia, quando gli anticorpi sono già presenti.
Il sangue viene prelevato nella quantità di 3-5 ml a stomaco vuoto o 6 ore dopo un pasto.
Per ottenere il siero, il sangue viene lasciato per 1 ora a temperatura ambiente o centrifugato. Il siero viene aspirato con molta attenzione per non catturare gli elementi formati.
I sieri immunitari sono ottenuti dal sangue di persone o animali (solitamente conigli e cavalli) immunizzati secondo un determinato schema con l'antigene corrispondente (vaccino). Il siero di latte viene solitamente preparato in produzione.
4. Il concetto di risultati positivi e negativi.
RA.
Con una reazione positiva, gli eritrociti incollati passivamente coprono il fondo del pozzo con uno strato uniforme con bordi smerlati ("ombrello"); in assenza di agglutinazione, gli eritrociti si accumulano nella cavità centrale del pozzo, formando un "bottone" compatto con bordi nettamente definiti (vedi figure sopra).
RP.
Con esito positivo si forma un anello lattiginoso al confine delle due soluzioni (vedi figure sopra).
ELISA.
Un cambiamento nel colore della soluzione si verifica con una reazione positiva.
RSK.
Ritardo dell'emolisi: la reazione è positiva; se il complemento è libero, si osserva l'emolisi - la reazione è negativa(vedi foto sopra).
Risultati della reazione di Wasserman:
a - ritardo completo dell'emolisi (+ + ++);
b - pronunciato ritardo nell'emolisi (+ ++);
c - ritardo parziale dell'emolisi (++);
d - debole ritardo dell'emolisi (+);
e - emolisi completa (-).
La reazione è positiva con un ritardo dell'emolisi parziale, pronunciato e completo, determinato dal grado di colorazione del contenuto delle provette da rosa chiaro a rosso brillante, gli eritrociti non emolizzati successivamente formano un precipitato rosso.
Compiti a casa:
1. Studia il materiale
Prendi 3 note sul video
13.1. Reazioni antigene-anticorpo e loro usi
Quando viene iniettato un antigene, nel corpo si formano anticorpi. Gli anticorpi sono complementari all'antigene che ne ha causato la sintesi e sono in grado di legarsi ad esso. Il legame degli antigeni agli anticorpi consiste in due fasi. La prima fase è specifica, in cui vi è un rapido legame del determinante antigenico al centro attivo del frammento Fab di anticorpi. Va notato che il legame è dovuto alle forze di van der Waals, all'idrogeno e alle interazioni idrofobiche. La forza di legame è determinata dal grado di corrispondenza spaziale tra il sito attivo dell'anticorpo e l'epitopo dell'antigene. Dopo la fase specifica, ne inizia una più lenta, aspecifica, che si manifesta con un fenomeno fisico visibile (ad esempio la formazione di scaglie durante l'agglutinazione, ecc.).
Le reazioni immunitarie sono interazioni tra anticorpi e antigeni e queste reazioni sono specifiche e altamente sensibili. Sono ampiamente utilizzati nella pratica medica. Con l'aiuto delle reazioni immunitarie, è possibile risolvere i seguenti compiti:
Determinazione di anticorpi sconosciuti mediante antigeni noti (antigenic diagnosticum). Tale compito è quando è necessario determinare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente (sierodiagnosi). Trovare gli anticorpi permette di confermare la diagnosi;
Determinazione di antigeni sconosciuti mediante anticorpi noti (siero diagnostico). Questo studio viene effettuato per identificare la coltura dell'agente patogeno isolato dal materiale del paziente (sierotipizzazione), nonché per rilevare
antigeni di microbi e loro tossine nel sangue e in altri fluidi biologici. Esistono molti tipi di reazioni immunitarie che differiscono nella tecnica di impostazione e nell'effetto registrato. Si tratta di reazioni di agglutinazione (RA), precipitazione (RP), reazioni che coinvolgono il complemento (RCC), reazioni che utilizzano componenti etichettati (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reazione di agglutinazione
La reazione di agglutinazione (RA) è una reazione immunitaria dell'interazione di un antigene con anticorpi in presenza di elettroliti e l'antigene è in uno stato corpuscolare (eritrociti, batteri, particelle di lattice con antigeni adsorbiti). Durante l'agglutinazione, gli antigeni corpuscolari vengono incollati insieme da anticorpi, che si manifesta con la formazione di un precipitato flocculante. La formazione di fiocchi avviene a causa del fatto che gli anticorpi hanno due centri attivi e gli antigeni sono polivalenti, ad es. hanno più determinanti antigenici. L'AR viene utilizzato per identificare l'agente patogeno isolato dal materiale del paziente, nonché per rilevare anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente (ad esempio, le reazioni di Wright e Huddleson nella brucellosi, la reazione di Vidal nella febbre tifoide e nella febbre paratifoide ).
Il modo più semplice per impostare l'AR è una reazione sul vetro, si tratta di un RA approssimativo, che viene utilizzato per determinare l'agente patogeno isolato dal paziente. Quando si imposta la reazione su un vetrino, viene applicato un siero agglutinante diagnostico (a una diluizione di 1:10 o 1:20), quindi viene introdotta una coltura del paziente. La reazione è positiva se nella goccia compare un precipitato flocculante. Nelle vicinanze viene posizionato un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Se il siero agglutinante diagnostico non è adsorbito 1, viene diluito (al titolo - la diluizione a cui dovrebbe verificarsi l'agglutinazione), ad es. mettere l'AR espanso in provette con l'aumento
1 Il siero agglutinante non adsorbito può agglutinare batteri correlati che hanno antigeni comuni (che reagiscono in modo incrociato). Pertanto, divertitisieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi cross-reattivi sono stati rimossi mediante adsorbimento da parte dei batteri correlati. In tali sieri rimangono anticorpi specifici solo per questo batterio.
diluizioni di siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione del patogeno isolato dal paziente. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di chiarificazione del liquido nelle provette. La reazione è considerata positiva se si nota agglutinazione in una diluizione prossima al titolo del siero diagnostico. La reazione è accompagnata da controlli: il siero, diluito con soluzione isotonica di cloruro di sodio, deve essere trasparente, la sospensione di microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.
Per determinare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente, viene utilizzato un RA espanso. Quando viene messo nelle provette, il siero del sangue del paziente viene diluito e alle provette viene aggiunta una quantità uguale di sospensione diagnostica (sospensione dei microbi uccisi). Dopo l'incubazione, viene determinata la più alta diluizione del siero alla quale si è verificata l'agglutinazione, cioè si è formato un precipitato (titolo di siero). In questo caso, la reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal riscaldamento, che trattengono un antigene O termostabile) si verifica sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formalina, che trattengono l'antigene H flagellare termolabile) è a grana grossa e procede più velocemente.
La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva).(RNGA o RPGA) è un tipo di RA. Questo metodo è altamente sensibile. Con l'aiuto di RNGA, possono essere risolti due compiti: determinare gli anticorpi nel siero del sangue del paziente, a cui viene aggiunto un diagnosticum antigenico degli eritrociti, che sono gli eritrociti su cui vengono adsorbiti antigeni noti; determinare la presenza di antigeni nel materiale di prova. In questo caso, la reazione è talvolta chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa (RONGA). Durante la stadiazione, al materiale del test viene aggiunto un anticorpo diagnostico eritrocitario (eritrociti con anticorpi adsorbiti sulla loro superficie). Gli eritrociti in questa reazione agiscono come vettori e sono coinvolti passivamente nella formazione di aggregati immunitari. Con una reazione positiva, gli eritrociti incollati passivamente coprono il fondo del pozzo con uno strato uniforme con bordi smerlati ("ombrello"); in assenza di agglutinazione, gli eritrociti si accumulano nella rientranza centrale del foro, formando un "bottone" compatto con bordi nettamente definiti.
Reazione di coagulazione utilizzato per rilevare cellule patogene (antigeni) utilizzando anticorpi adsorbiti Staphylococcus aureus, contenente la proteina A. La proteina A ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline. A causa di ciò, gli anticorpi si legano allo stafilococco indirettamente attraverso il frammento Fc e i frammenti Fab sono orientati verso l'esterno e sono in grado di interagire con i microbi corrispondenti isolati dai pazienti. In questo caso si formano dei fiocchi.
Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HITA) utilizzato nella diagnosi di infezioni virali e solo infezioni causate da virus emoagglutinanti. Questi virus contengono sulla loro superficie una proteina - emoagglutinina, che è responsabile della reazione di emoagglutinazione (RHA) quando viene aggiunta ai virus degli eritrociti. L'RTGA consiste nel bloccare gli antigeni virali con gli anticorpi, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi.
Reazione di Coomb - RA per il rilevamento di anticorpi incompleti. In alcune malattie infettive, come la brucellosi, nel siero del paziente circolano anticorpi incompleti contro l'agente patogeno. Gli anticorpi incompleti sono chiamati bloccanti perché hanno un sito di legame dell'antigene e non due, come gli anticorpi completi. Pertanto, quando viene aggiunto un diagnosticum antigenico, gli anticorpi incompleti si legano agli antigeni, ma non li uniscono. Per manifestare la reazione, viene aggiunto siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane), che porterà all'agglutinazione degli immunocomplessi (diagnostico antigenico + anticorpi incompleti) formati nella prima fase della reazione.
La reazione indiretta di Coombs è usata nei pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti si riscontrano anticorpi monovalenti anti-Rhesus incompleti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non causano la loro agglutinazione. Pertanto, il siero antiglobulina viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti. Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio la malattia emolitica del neonato dovuta al conflitto di Rhesus.
RA per la determinazione dei gruppi sanguigniè basato su agglutinazione di erythrocytes da anticorpi di siero immunitario ad antigeni di gruppi sanguigni A (II), B (III). Il controllo è siero che non contiene anticorpi, ad es. gruppi sanguigni sierici AB (IV) e antigeni di eritrociti dei gruppi A (P) e B (III). Gli eritrociti del gruppo 0(I) sono usati come controllo negativo perché non hanno antigeni.
Per determinare il fattore Rh vengono utilizzati sieri anti-Rh (almeno due serie differenti). In presenza dell'antigene Rh sulla membrana degli eritrociti studiati, si verifica l'agglutinazione di queste cellule.
13.3. reazione di precipitazione
RP è una reazione immunitaria dell'interazione di anticorpi con antigeni in presenza di elettroliti e l'antigene è in uno stato solubile. Durante la precipitazione, gli antigeni solubili vengono precipitati dagli anticorpi, che si manifesta con torbidità sotto forma di bande di precipitazione. La formazione di un precipitato visibile si osserva quando entrambi i reagenti vengono miscelati in rapporti equivalenti. Un eccesso di uno di essi riduce la quantità di immunocomplessi precipitati. Esistono vari modi per impostare una reazione di precipitazione.
Reazione di precipitazione ad anello posti in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. Con esito positivo si forma un anello lattiginoso al confine delle due soluzioni. La reazione di precipitazione ad anello, che determina la presenza di antigeni negli organi e nei tessuti, i cui estratti vengono bolliti e filtrati, è chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli per la determinazione di un antigene termostabile dell'antrace).
Ouchterlony doppia reazione di immunodiffusione. Questa reazione viene condotta su un gel di agar. I pozzetti vengono ritagliati in uno strato di gel di spessore uniforme a una certa distanza l'uno dall'altro e riempiti rispettivamente di antigene e siero immunitario. Successivamente, antigeni e anticorpi si diffondono nel gel, si incontrano e formano immunocomplessi, che precipitano nel gel e diventano visibili come linee di precipitazione.
nutrizione. Questa reazione può essere utilizzata per rilevare antigeni o anticorpi sconosciuti, nonché per verificare la somiglianza tra antigeni diversi: se gli antigeni sono identici, le linee di precipitazione si uniscono; se gli antigeni non sono identici, le linee di precipitazione si intersecano; se gli antigeni sono parzialmente identico, si forma uno sperone.
Reazione di immunodiffusione radiale. Gli anticorpi vengono aggiunti al gel di agar fuso e il gel viene applicato in uno strato uniforme sul vetrino. I pozzetti vengono ritagliati nel gel e in essi viene introdotto un volume standard di soluzioni di antigene di varie concentrazioni. Durante l'incubazione, gli antigeni si diffondono radialmente fuori dal pozzetto e, incontrando gli anticorpi, formano un anello di precipitazione. Finché c'è un eccesso di antigene nel pozzetto, c'è un graduale aumento del diametro dell'anello di precipitazione. Questo metodo viene utilizzato per determinare antigeni o anticorpi nella soluzione in esame (ad esempio, per determinare la concentrazione di immunoglobuline di diverse classi nel siero del sangue).
Immunoelettroforesi. La miscela di antigeni viene preliminarmente separata mediante elettroforesi, quindi l'antisiero precipitante viene introdotto nel solco che corre lungo la direzione del movimento della proteina. Antigeni e anticorpi si diffondono nel gel l'uno verso l'altro; interagendo, formano linee arcuate di precipitazione.
reazione di flocculazione(secondo Ramon) - una sorta di reazione di precipitazione, che viene utilizzata per determinare l'attività del siero o del tossoide antitossico. La reazione viene condotta in provette. In una provetta in cui il tossoide e l'antitossina sono in un rapporto equivalente, si osserva torbidità.
13.4. Reazione di fissazione del complemento
Gli anticorpi, interagendo con l'antigene corrispondente, legano il complemento aggiunto (1° sistema). L'indicatore della fissazione del complemento sono gli eritrociti sensibilizzati dal siero emolitico, ad es. anticorpi contro gli eritrociti (2° sistema). Se il complemento non è fisso nel 1° sistema, cioè la reazione antigene-anticorpo non si verifica, quindi i globuli rossi sensibilizzati vengono completamente lisati (reazione negativa). Quando il complemento è legato dagli immunocomplessi del 1° sistema, dopo l'aggiunta di eritrociti sensibilizzati, si ha emolisi
assente (reazione positiva). La reazione di fissazione del complemento viene utilizzata per diagnosticare malattie infettive (gonorrea, sifilide, influenza, ecc.).
13.5. Reazione di neutralizzazione
I microbi e le loro tossine hanno un effetto dannoso sugli organi e sui tessuti del corpo umano. Gli anticorpi sono in grado di legarsi a questi agenti dannosi e bloccarli, ad es. neutralizzare. La reazione di neutralizzazione diagnostica si basa su questa caratteristica degli anticorpi. Viene effettuato introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (coltura cellulare, embrioni). Ad esempio, per rilevare le tossine nel materiale del paziente, agli animali del 1° gruppo viene iniettato il materiale del paziente. Agli animali del 2° gruppo viene iniettato un materiale simile, pretrattato con l'apposito antisiero. Gli animali del 1° gruppo muoiono in presenza di tossine nel materiale. Il secondo gruppo di animali sopravvive, l'effetto dannoso della tossina non si manifesta, poiché viene neutralizzato.
13.6. Reazioni utilizzando anticorpi o antigeni marcati
13.6.1. Reazione di immunofluorescenza (RIF, metodo Koons)
Questo metodo viene utilizzato per la diagnostica rapida. Può rilevare sia gli antigeni microbici che gli anticorpi.
Metodo RIF diretto- una reazione immunitaria dell'interazione degli anticorpi con gli antigeni e gli anticorpi sono etichettati con un fluorocromo - una sostanza in grado di emettere quanti di luce di una certa lunghezza d'onda quando colpiti dalla luce di una certa lunghezza d'onda. La particolarità dell'impostazione di questo metodo è la necessità di rimuovere i componenti non reagiti al fine di escludere il rilevamento di luminescenza non specifica. Per fare ciò, eseguire il lavaggio degli anticorpi non reagiti. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano su uno sfondo scuro lungo la periferia della cellula.
Metodo RIF indiretto usato più del precedente. Questa reazione viene condotta in due fasi. Nella prima fase, gli antigeni si scambiano reciprocamente
interagiscono con gli anticorpi corrispondenti, formando immunocomplessi. Tutti i componenti che non hanno reagito (cioè non fanno parte degli immunocomplessi) devono essere rimossi mediante lavaggio. Nella seconda fase, il complesso antigene-anticorpo formato viene rilevato utilizzando siero antiglobulina fluorocromo. Di conseguenza, si forma un microbo complesso + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi contro immunoglobuline di coniglio marcate con fluorocromo. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.
13.6.2. Test immunologico o test
L'ELISA è il metodo moderno più comune utilizzato per diagnosticare infezioni virali, batteriche, da protozoi, in particolare per diagnosticare l'infezione da HIV, l'epatite virale, ecc.
Ci sono molte modifiche ELISA. L'ELISA non competitivo in fase solida è ampiamente utilizzato. Si effettua in piastre di polistirene da 96 pozzetti (fase solida). Durante la reazione, è necessario lavare via i componenti non reagiti in ogni fase. Quando si determinano gli anticorpi, i pozzetti su cui vengono adsorbiti gli antigeni vengono riempiti con il siero del sangue in studio, quindi il siero antiglobulina marcato con l'enzima. Mostra la reazione aggiungendo un substrato per l'enzima. In presenza dell'enzima, il substrato cambia e il complesso enzima-substrato viene selezionato in modo tale che il prodotto formato nella reazione sia colorato. Pertanto, con una reazione positiva, si osserva un cambiamento nel colore della soluzione. Per determinare gli antigeni, un vettore in fase solida viene sensibilizzato con anticorpi, quindi vengono introdotti in sequenza il materiale del test (antigeni) e il siero dell'antigene marcato con enzima. Per la manifestazione della reazione, viene introdotto un substrato per l'enzima. Un cambiamento nel colore della soluzione si verifica con una reazione positiva.
13.6.3. Immunoblotting
Questo metodo si basa su una combinazione di elettroforesi ed ELISA. Quando si esegue l'immunoblotting (blotting dall'inglese. macchia- spot) una complessa miscela di antigeni viene prima sottoposta a elettroforesi in un gel di poliacrilammide. Il risultante anti-
i peptidi genici vengono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. Le macchie vengono quindi trattate con anticorpi marcati con enzima contro l'antigene specifico, i. condurre una macchia ELISA. L'immunoblotting viene utilizzato nella diagnosi di infezioni come l'HIV.
13.6.4. Microscopia elettronica immunitaria
Il metodo consiste nella microscopia al microscopio elettronico di virus (raramente altri microbi), preventivamente trattati con un appropriato siero immunitario marcato con preparazioni elettro-otticamente dense, ad esempio ferritina, una proteina contenente ferro.
13.7. citometria a flusso
Le cellule del sangue sono differenziate in base alla citofluorimetria laser. Per fare ciò, le cellule desiderate vengono colorate con anticorpi monoclonali fluorescenti contro antigeni CD. Un campione di sangue dopo il trattamento con anticorpi marcati viene fatto passare attraverso un tubo sottile e un raggio laser viene fatto passare attraverso di esso, che eccita la luminescenza del fluorocromo. L'intensità della fluorescenza è correlata alla densità degli antigeni sulla superficie cellulare e può essere quantificata utilizzando un fotomoltiplicatore. I risultati ottenuti vengono convertiti in un istogramma.
La citometria a flusso viene utilizzata per determinare lo stato immunitario (il contenuto delle principali popolazioni di linfociti, il contenuto di citochine intracellulari ed extracellulari, l'attività funzionale delle cellule NK, l'attività della fagocitosi, ecc.).
No. 29 Reazione di agglutinazione. Componenti, meccanismo, modalità di impostazione. Applicazione.
Reazione di agglutinazione- una semplice reazione in cui gli anticorpi legano antigeni corpuscolari (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi, nonché aggregati macromolecolari). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.
Vengono utilizzate varie varianti della reazione di agglutinazione: espansa, approssimativa, indiretta, ecc. La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti (cellule "incollate" da anticorpi che hanno due o più centri di legame dell'antigene - Fig. 13.1) . RA è usato per:
1) rilevamento degli anticorpi nel siero del sangue di pazienti, ad esempio, con brucellosi (reazioni di Wright, Heddelson), febbre tifoide e paratifo (reazione di Vidal) e altre malattie infettive;
2) definizioni dei patogeni isolato dal paziente;
3) determinazione dei gruppi sanguigni utilizzando anticorpi monoclonali contro alloantigeni eritrocitari.
Per determinare gli anticorpi del paziente mettere una reazione di agglutinazione dettagliata: alle diluizioni del siero del sangue del paziente viene aggiunto un diagnosticum (sospensione dei microbi uccisi) e dopo diverse ore di incubazione a 37 ° C, si nota la massima diluizione del siero (titolo del siero), in cui si è verificata l'agglutinazione, ovvero un precipitato formato.
La natura e il tasso di agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e anticorpi. Un esempio sono le caratteristiche dell'interazione dei diagnosticum (antigeni O e H) con anticorpi specifici. La reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal riscaldamento, trattenendo un antigene O termostabile) si verifica sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formalina, che trattengono l'antigene H flagellare termolabile) è a grana grossa e procede più velocemente. Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, inserire orientare la reazione di agglutinazione, utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), ovvero viene eseguita la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione approssimativa viene eseguita su un vetrino. Ad una goccia di siero agglutinante diagnostico in una diluizione di 1:10 o 1:20 aggiungere una coltura pura del patogeno isolato dal paziente. Nelle vicinanze viene posizionato un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Quando in una goccia appare un sedimento flocculante con siero e microbi, viene eseguita una reazione di agglutinazione dettagliata in provette con diluizioni crescenti di siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce della sospensione del patogeno. L'agglutinazione è presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di chiarificazione del liquido. La reazione è considerata positiva se si nota agglutinazione in una diluizione prossima al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, una sospensione di microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.
Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, che
rende difficile identificarli. Pertanto, vengono utilizzati sieri agglutinanti adsorbiti, da cui
anticorpi a reazione crociata per adsorbimento ai batteri correlati. Questi sieri contengono anticorpi
specifico per questo batterio.
Reazione di agglutinazione
Agglutinazione (lat. agglutinazione- incollaggio) - incollaggio (connessione) di particelle corpuscolari portatrici di antigene (cellule intere, particelle di lattice, ecc.) con molecole di anticorpi specifici in presenza di elettroliti, che termina con la formazione di scaglie o sedimenti (agglutinato) visibili al occhio nudo. La natura del sedimento dipende dalla natura dell'antigene: i batteri flagellari danno un sedimento a scaglie larghe, flagellare e senza capsule - a grana fine, capsulare - fibroso. Distinguere l'agglutinazione diretta, in cui l'interazione con anticorpi specifici ha coinvolto direttamente i propri antigeni di un batterio o di qualsiasi altra cellula, come gli eritrociti; e indiretto, o passivo, in cui cellule batteriche o eritrociti, o particelle di lattice sono portatori non propri, ma di antigeni estranei (o anticorpi) adsorbiti su di essi per rilevare anticorpi (o antigeni) ad essi specifici. La reazione di agglutinazione coinvolge principalmente anticorpi appartenenti alle classi IgG e IgM. Procede in due fasi: in primo luogo, c'è una specifica interazione del centro attivo degli anticorpi con il determinante dell'antigene, questa fase può verificarsi in assenza di elettroliti e non è accompagnata da cambiamenti visibili nel sistema reattivo. La seconda fase, la formazione dell'agglutinato, richiede la presenza di elettroliti che riducano la carica elettrica dei complessi antigene + anticorpo e accelerino il processo del loro incollaggio. Questa fase si conclude con la formazione dell'agglutinato.
Le reazioni di agglutinazione vengono posizionate su lastre di vetro o di cartone liscio o in provette di agglutinazione sterili. Le reazioni di agglutinazione (dirette e passive) su vetro sono solitamente utilizzate come metodo accelerato per rilevare anticorpi specifici nel siero del paziente (ad esempio nella brucellosi) o per l'identificazione sierologica dell'agente patogeno. In quest'ultimo caso, vengono solitamente utilizzati sieri diagnostici ben purificati (adsorbiti), contenenti solo anticorpi monorecettori o il loro set a vari antigeni. L'indubbio vantaggio della reazione di agglutinazione su vetro è la semplicità della sua formulazione e il fatto che impiega diversi minuti o addirittura secondi, poiché entrambi i componenti sono utilizzati in esso in forma concentrata. Tuttavia, ha solo un valore qualitativo ed è meno sensibile della provetta. Un test di agglutinazione espansa in provetta fornisce risultati più accurati, perché consente di determinare il contenuto quantitativo di anticorpi nel siero (impostarne il titolo) e, se necessario, registrare il fatto di un aumento del titolo anticorpale, che è diagnostico valore. Per avviare la reazione, si introduce nell'agglutinazione del siero diluito con una soluzione di NaCl allo 0,85% in un certo modo e un volume uguale (solitamente 0,5 ml) di una sospensione di un diagnosticum standard (o coltura di prova) contenente 1 miliardo di batteri in 1 ml tubi. La contabilizzazione dei risultati della reazione di agglutinazione viene effettuata preliminare dopo 2 ore di incubazione delle provette ad una temperatura di 37°C ed infine dopo 20-24 ore secondo due segni: la presenza e la dimensione del precipitato e il grado di trasparenza del supernatante. La valutazione viene effettuata secondo il sistema dei quattro incroci. La reazione è necessariamente accompagnata dal controllo del siero e dell'antigene. Nei casi in cui un test di agglutinazione dettagliato in provetta viene utilizzato per l'identificazione sierologica del patogeno, ha valore diagnostico se la reazione è valutata positiva quando il siero diagnostico è diluito con almeno la metà del suo titolo.
Va tenuto presente che quando si mescolano soluzioni di antigeni e anticorpi omologhi, non si osservano sempre manifestazioni visibili della reazione di agglutinazione. Un precipitato si forma solo a determinati rapporti ottimali di entrambi i componenti di reazione. Al di fuori di questi limiti, con un eccesso significativo di antigene o anticorpi, non si osserva alcuna reazione. Questo fenomeno è chiamato "fenomeno prozona". Si osserva sia nella reazione di agglutinazione che nella reazione di precipitazione. La comparsa del prozone nelle reazioni immunitarie è spiegata dal fatto che gli antigeni coinvolti in esse sono generalmente polideterminanti e le molecole di anticorpi IgG hanno due centri attivi. Con un eccesso di anticorpi, la superficie di ciascuna particella di antigene è ricoperta di molecole di anticorpi in modo che non rimangano gruppi determinanti liberi, quindi il secondo centro attivo di anticorpi non legato non può interagire con un'altra particella antigenica e legarli tra loro. Anche la formazione di un agglutinato o precipitato visibile viene soppressa con un eccesso di antigene, quando non c'è un solo sito attivo libero di anticorpi, e quindi i complessi antigene + anticorpo + antigene non possono più essere ingranditi.