Aglütinasyon reaksiyonunun bir tezahürüdür. Aglütinasyon reaksiyonu (RA), mekanizma ve sertleşme yöntemleri. Malzemeler ve nasıl elde edilir. Enfeksiyöz hastalıkların tanısında RA kullanımı. Kan grubunu belirlemede olası aglütinasyon türleri
Aglütinasyon reaksiyonu, antikorların (aglütininler) tüm mikrobiyal veya diğer hücrelerle spesifik etkileşimine dayanır. Bu etkileşimin bir sonucu olarak, çöken (aglutinat) parçacıklar-aglomeralar oluşur. Bakteriler, protozoalar, mantarlar, mayalar, riketsiya, eritrositler ve hem canlı hem de öldürülmüş diğer hücreler aglütinasyon reaksiyonuna katılabilir. Reaksiyon iki aşamada ilerler: ilki antijen ve antikorun spesifik kombinasyonudur, ikincisi spesifik değildir, yani görünür bir aglütinatın oluşumu. Aglütinat çökelmesi, sodyum klorür gibi elektrolitlerin varlığında meydana gelir. Aglütinattaki mikroorganizmalar canlı kalır, ancak hareketliliklerini kaybederler.
Aglütinasyon reaksiyonu, enfeksiyon hastalıklarının serolojik teşhisinde ve izole edilen mikropların antijenik yapısının belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bir hasta veya taşıyıcının vücudundan izole edilen bir patojenin antijenik yapısını oluşturmak için hayvanların (tavşan, eşek, koç) belirli mikroorganizmalarla aşılanmasıyla elde edilen spesifik bir bağışıklık serumu kullanılır. Mikrop tanımlaması, adsorbe edilmiş veya monoreseptör serumlu cam üzerindeki aglütinasyon reaksiyonunda veya spesifik aglütinasyon serumlu test tüplerinde gerçekleştirilir. Adsorplanan serum, yalnızca belirli bir mikroba özgü antijenlere karşı antikorlar içerir ve monoreseptör serumlar, patojenin yalnızca bir spesifik antijenine karşı antikorlar içerir.
Tür serumları, belirli bir mikropun tüm antijenlerine karşı antikorlar içerir.
Bir mikroorganizmanın izole edilmiş kültürünün bu türe bağlanması, bilinen serumu ile serum ampulünün etiketinde belirtilen antikor titresine aglütinasyon yoluyla belirlenir. Serum antikorlarının titresi, hayvanı immünize etmek için kullanılan mikrop kültürünün aglütinasyonunun hala gözlemlendiği son seyreltme olarak kabul edilir. Adsorplanmış ve monoreseptör serumlar genellikle cam üzerindeki aglütinasyon reaksiyonunda seyreltilmeden kullanılır.
Hastanın kan serumunda antikorların varlığını belirlerken, 1: 50 ila 1: 800 veya daha fazla bir seyreltme ile başlayarak izotonik bir sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilir. Her seyreltmeye bir canlı veya öldürülmüş mikrop süspansiyonu eklenir. Isı veya formalin ile öldürülen mikropları içeren müstahzarlara teşhis denir. Mikroorganizma kültürlerinin ısıtılmasıyla elde edilen teşhisler sadece somatik antijenler içerir. Sadece formalin kullanıldığında, kamçılı antijenler de mikroplarda korunur.
Hastanın kanında antikorların varlığında, reaksiyonda alınan tanı birbirine yapışır ve iki test tüpünde bir çökelti (aglütinat) oluşturulur. Bu durumda, aglütinasyon reaksiyonunun sonuçları pozitif olarak kabul edilir. İzotonik sodyum klorür solüsyonu ve diagnostik eklenen kontrol tüpünde mikropların süspansiyonu homojen olmalıdır (negatif aglütinasyon reaksiyonu).
Leptospirosis gibi bazı hastalıklarda aglütinasyon reaksiyonunun sonuçlarının hesaplanması, mikroskobun karanlık görüş alanında (mikroaglutinasyon) sadece mikroskobik olarak gerçekleştirilir. Bir hastalığın serolojik teşhisini yapmak için teşhis hastalığı dikkate alınır. Genellikle 1:100 veya 1:200 serum dilüsyonuna karşılık gelir.
Tifo ateşi ve paratifo ateşi (Vidal reaksiyon), bruselloz (Wright reaksiyonu), tularemi vb. durumlarda aglütinasyon reaksiyonu kullanılarak hastanın kan serumundaki antikorlar tespit edilebilir.
Castellani reaksiyonu. Bazı bulaşıcı hastalıklarda veya bileşimlerinde grup antijenleri bulunan mikroorganizmalarla bağışıklamada, bu tipe özgü antikorlara ek olarak, kan serumunda grup antikorları da ortaya çıkar. Bu durumda ilgili bakteri türleri ortaya çıkan serumlarla aglütine olacaktır.
Castellani, grup antijenlerine sahip olan ancak spesifik olanları olmayan ilgili türlerin mikroorganizmalarının yardımıyla bunların uzaklaştırılmasına dayalı olarak, immün serumdan grup antikorlarının adsorpsiyonu için bir yöntem önerdi. Seruma eklenen bu tür mikroorganizmaların kültürü, spesifik olmayan grup antikorları adsorbe eder ve antijen-antikor kompleksinin santrifüjleme ile çıkarılmasından sonra, serumda sadece spesifik immünoglobulinler kalır. Castellani yöntemine göre muamele edilen serum, aglütinasyon reaksiyonunda oldukça spesifik olarak kullanılabilir.
bağışıklık reaksiyonları. Bulaşıcı hastalıkların tanısında immün yanıtların kullanımı.
PLAN:
Bağışıklık reaksiyonlarının türleri.
Serolojik reaksiyonların yürütülmesi için koşullar.
Serum gereksinimleri.
Olumlu ve olumsuz sonuçlar kavramı.
ANA İÇERİK:
Bağışıklık reaksiyonlarının türleri.
immünolojik reaksiyon – bu, bir antijenin, antikorun aktif merkezlerinin (paratop) antijen epitopları ile spesifik etkileşimi ile belirlenen bir antikor ile etkileşimidir.
İmmünolojik reaksiyonların genel sınıflandırması:
serolojik reaksiyonlar – antijenler (Ag) ve antikorlar (Ig) arasındaki reaksiyonlar
laboratuvar ortamında ;
hücresel reaksiyonlar immünokompetan hücrelerin katılımıyla;
alerjik testler - aşırı duyarlılığın tespiti.
Serolojik reaksiyonlar: 1) tanım, 2) aşamalar, 3) hedef belirleme, 4) genel sınıflandırma.
1) Tanım
Bir antijen-antikor reaksiyonu kullanarak serolojik araştırma yöntemleri (lat. Serum - serum ve logolar - öğretim).
2) Aşamalar
2 etkileşim aşaması:
BEN. özel (görünür) - hızla gelir, antikorlar karşılık gelen antijenleriyle birleşir. Belirleyici antijen grupları (AG) ve aktif antikor merkezleri (AT) bu aşamada etkileşime girer.
AG + AT kompleksinin oluşumunda yer alan kuvvetler şunlardır:
Coulomb;
van der Waals
Hidrojen bağları.
Bu aşamada gözle görülür bir değişiklik yoktur. Elektron mikroskobu altında, bir kafes şeklinde karmaşık AG + AT.
II. Spesifik olmayan - yavaş gelir, oluşan antijen-antikor kompleksi, reaksiyonun meydana geldiği ortamın spesifik olmayan ek bir faktörü ile reaksiyona girer ve bu gözle görülebilir - yapıştırma, çözünme, pulların çökelmesi vb. elektrolit, yük azalır, çözünürlük azalır, çökelmiş (aglütinat) görünür konglomeralar oluşur.
3) Hedef belirleme :
a) antijeni tanımlamak için (antikor bilinen tanı serumu):
serolojik tanımlama (tür tanımlama);
serotiplendirme (serovarın belirlenmesi) - bir suşun belirlenmesi;
patolojik materyalde (ekspres teşhis);
saf kültürde:
b) antikorları (Ig) saptamak için (antijen bilinen-diagnostikum):
mevcudiyet (niteliksel reaksiyonlar);
miktar (titrede artış - "eşleştirilmiş sera" yöntemi).
4) Genel sınıflandırma serolojik reaksiyonlar :
a) basit (2 bileşenli: Ag + Ig):
RA aglütinasyon reaksiyonları (korpüsküler antijen ile);
RP çökelme reaksiyonları (çözünür antijen ile);
b) kompleks (3 bileşenli: Ag + Ig + C);
c) bir etiket kullanarak.
Aglütinasyon ve çökelme reaksiyonunun varyantları
aglütinasyon reaksiyonu :
Aglütinasyon reaksiyonu (RA), fizyolojik bir solüsyonda bir AG süspansiyonunun (eritrositler, bakteriler) AT ile etkileşiminin bir immün reaksiyonudur.
Aglütinasyon sırasında, AT partikülleri, bir flokülent çökelti oluşumu ile birbirine yapışır.
Pasif hemaglütinasyon reaksiyonu (RPHA), bir antikor veya antijenik eritrosit diagnostiğinin (yüzeylerinde adsorbe edilmiş AT veya AG'li eritrositler) kullanıldığı bir aglütinasyon reaksiyonu türüdür.
Bu reaksiyondaki eritrositler pasif taşıyıcılar olarak hareket eder.
RPGA sonuçlarının değerlendirilmesi şu şekilde yapılır:
- de pozitif reaksiyon pasif olarak yapıştırılmış eritrositler, U veya V şeklindeki deliğin altını, taraklı kenarlı ("şemsiye") eşit bir tabaka ile kaplar;
- de ters tepki (aglütinasyon eksikliği), eritrositler deliğin merkezi girintisinde birikir ve keskin bir şekilde tanımlanmış kenarları olan kompakt bir "düğme" oluşturur.
Viral enfeksiyonların tanısında hemaglütinasyon inhibisyon testi (HITA) kullanılır. Bazı virüsler, yüzeylerinde kırmızı kan hücrelerini birbirine yapıştıran hemaglutinin proteini içerir. Spesifik antiviral antikorların eklenmesi viral hemaglutinin'i bloke eder - hemaglutinasyon yoktur.
Dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonu (RIHA) veya Coombs reaksiyonu, eksik antikorları belirlemek için kullanılır. Antiglobulin serumunun (insan Ig'sine karşı AT) eklenmesi reaksiyonun sonuçlarını geliştirir. Rh faktörünün belirlenmesinde RNGA kullanılır.
Bir aglütinasyon reaksiyonu (RA) oluşturmak için üç bileşen gereklidir:
1) antijen (aglütinojen) AG;
2) antikor(aglütinin) AT;
3)
elektrolit
(izotonik sodyum klorür çözeltisi).
Ag + AT + elektrolit = aglutinat
Aglütinasyon (Latince aglutinatio - yapıştırmadan) - elektrolitlerin varlığında antikorlarla korpüsküllerin (bakteri, eritrositler, vb.) Yapıştırılması - sodyum klorür.
RA, antikorlar tarafından "birbirine yapıştırılmış" olan korpüsküllerden (örneğin bakteri, eritrositler) oluşan pul veya tortu şeklinde kendini gösterir.
RA aşağıdakiler için kullanılır:
Mikropların (RA) doğrudan aglütinasyonunun reaksiyonu.
Bu reaksiyonda, antikorlar (aglütininler) doğrudan korpüsküler antijenleri (aglütinojenler) aglütine eder.
Genellikle inaktive edilmiş mikroorganizmaların bir süspansiyonu ile temsil edilirler (mikrobiyal aglütinasyon reaksiyonu).
Mikroorganizma türünü belirlemek için kullanılırstandart tanı aglütinasyonu serum ( bilinen AT ).
En yaygın olanları katmanlı (gösterge) ve konuşlandırılmış RA'dır.
Lamellar RA cam üzerine yerleştirilir. Antikorları tespit etmek veya mikroorganizmaları tanımlamak için hızlandırılmış bir yöntem olarak kullanılır.
Bileşenler:
1. standart tanısal aglütinasyon serumu (AT);
2. hastadan alınan saf kültürü test edin;
3. tuzlu su çözeltisi.
İncelenen saf kültürde antijenler (AG), antikorlar tarafından birbirine yapışan ve çökeltilen partiküller (mikrobiyal hücreler, eritrositler ve diğer korpüsküler antijenler) formundadır.
Örnek:
sahneleme gösterge aglütinasyon reaksiyonları (RA ) cam üzerinde bağırsak grubunun bakterilerini tanımlamak için.
Damlalar bir cam slayta uygulanır:
1
dizanteri
;
2
-th damla: - patojenlere aglütinasyon serumuTifo
;
(1-2 teşhis serumu)
3
-th damla: - salin solüsyonu (kontrol).
Test edilen saf bakteri kültürü her damlaya eklenir. Karıştırmak.
Sonuç
:
pozitif
- aglütinat pulların varlığı,
olumsuz
- aglütinat pul yok
Çözüm:İncelenen bakteriler, tifo ateşinin etken maddeleridir (antijenler belirlendi).
Hastanın serumundaki antikorları belirlemek için (serolojik tanı), standart bir mikrobiyalteşhis süspansiyon içerentanınmış mikroplar veya antijenleriAG .
ABO sisteminin kan gruplarının belirlenmesi (hemaglütinasyon reaksiyonu (RHA)) - eritrositleri aglütine edin.
Reaksiyon bileşenleri:
1. AG (kırmızı kan hücreleri) kan testi
2. AT (eritrotestler - tsoliklonlar)
Zoliklon seti:
Reaktif Tsoliklon anti-A (pembe)
Reaktif Tsoliklon anti-B (mavi)
Zoliklon anti-AB reaktifi (renksiz)
3. elektrolit (tuzlu su)
Tanımlama tekniği:
1
.
Tabletin kuyucuklarına bir damla (0,1 ml) anti-A, anti-B ve anti-AB tsoliklon (kontrol için) uygulanır.
2.
Reaktifin her damlasının yanına küçük bir (0,05-0,01 ml) test kanı damlası uygulanır.
Daha sonra bir damla tsoliklon, ayrı bir temiz cam çubuk ile bir damla kan ile karıştırılır.
3.
Aglütinasyon reaksiyonu, plak hafifçe sallandığında ilk 3-5 saniyede gelişir.
Reaksiyonun sonuçları, damlaların karıştırılmasından 2.5 - 3 dakika sonra dikkate alınır. Anti-A, anti-B, anti-AB kuyularında soldan sağa.
Olumlu bir sonuç, granüler bir çökeltinin (aglutinat) ortaya çıkmasıdır.
pozitif RA (+)
Negatif - tortu yok.
negatif RA(-)
4.
Sonuçların analizi.
Ö(ben) α β – aglütinasyon yok
A(II) β – anti-A ile aglütinasyon
B(III) α – anti-B ile aglütinasyon
AB(IV)O - anti-A ile aglütinasyon, anti-B ile
Aglütinasyonun şematik gösterimi.
Eritrositlerde AH antijenleri (tespit edilen) + antikorAT(tsoliklon) teşhis serumu
Plakalarda aglutinasyon muhasebesi
Yağış reaksiyonu:
Çökelme reaksiyonu, çözünür durumdaki AG'nin tuzlu su içindeki AT ile etkileşiminin bir bağışıklık reaksiyonudur.
Çökeltme sırasında, şeffaf bir kolloidal çözeltinin opak bir süspansiyona veya çökeltiye geçişi ile kendini gösteren bir makromoleküler bağışıklık kompleksi oluşumu meydana gelir.
Her iki reaktifin miktarı kesin olarak tanımlanmış oranlarda olmalıdır, çünkü bunlardan birinin fazlası sonucu azaltır.
Bir çökeltme reaksiyonu oluşturmanın çeşitli yolları vardır.
1. Halka çökeltme reaksiyonu, küçük çaplı çökeltme tüplerine konur. Test tüpüne bağışıklık serumu eklenir ve çözünür antijen dikkatlice katmanlanır. AG ve AT, moleküllerin termal hareketi nedeniyle karıştırılır ve etkileşirler. Olumlu bir sonuçla, iki çözeltinin sınırında bir opak çökelti halkası oluşur.
2. Ouchterlony çift immünodifüzyon reaksiyonu, oyuklara şemaya göre bir AG solüsyonu veya bir AT solüsyonu eklenen bir agar jeli içinde gerçekleştirilir. AG ve AT jel içinde birbirlerine doğru difüze olur ve reaksiyon pozitifse, çökelme çizgileri olarak görülebilen immün kompleksler oluşturur.
Yağış reaksiyonu -bu oluşumve çökelti adı verilen bulanıklık şeklinde antikorlar ile çözünür moleküler antijen kompleksinin çökeltilmesi. Antijen ve antikorların eşdeğer miktarlarda karıştırılmasıyla oluşturulur.
RA bileşenleri:
çökeltici serum (AT-presipitin olarak bilinir);
test serumu (bilinmeyen AG-presipitinojen);
fiziksel Çözüm.
Çökeltme reaksiyonu, özel dar test tüplerine (halka çökeltme reaksiyonu) veya jeller, besin ortamları vb. içindeki Petri kaplarına yerleştirilir.
Halka çökelme reaksiyonu
Reaksiyon sonuçlarının beyanı ve muhasebesihalka yağışşarbonun etken maddesini tespit etmek için (Ascoli reaksiyonu).
sahneleme .
1. Test malzemesi (deri, yün, keçe, kıl, kumaş, et, toprak, hayvan dışkısı vb.) 5-45 dakika tuzlu suda kaynatılır. izotonik bir ekstrakt (ekstrakt) elde etmek için. Filtre.
2. Çöken şarbon önleyici serumu test tüpüne dökün.
3. Üzerine test malzemesini (özü) dikkatlice yerleştirin.
Muhasebe .
Önümüzdeki 10 dakika içinde. serum ve ekstrakt arasındaki sınırda, pozitif durumlarda bir bulanıklık halkası belirir (halka çökelmesi). Ascoli reaksiyonu çok hassas ve spesifiktir.
Yardımı ile şarbon bulaşmış materyalleri hızlı bir şekilde tespit etmek mümkündür.
Agarda yağış reaksiyonu
Sonuçların beyanı ve muhasebesiagar çökelme reaksiyonlarıcorynebacteria'nın (difteri etken maddeleri) toksijenitesini belirlemek için
sahneleme
Petri kabında fosfat-pepton agar üzerine yerleştirildi.
1. Nemlendirilmiş bir steril filtre kağıdı şeridiantitoksik serum.
2. Kuruduktan sonra şeridin kenarından 1 cm uzaklıkta 10 mm çapında plaklar ekilir.izole ürünler.
Bir kapta 3 ila 10 ürün ekebilirsiniz, bunlardan biri,kontrol, bilinmesi gerekirtoksik.
Mahsuller bir termostata yerleştirilir.
Muhasebe
Analiz 24-48-72 saat sonra gerçekleştirilir.
Olumlu sonuç - (kültürtoksik) - kağıt şeridinden belli bir mesafede ortaya çıkarçökelti hatları, « dal okları”, iletilen ışıkta açıkça görülebilir.
Şekil, difteri basilinin toksijenitesini belirlemek için agardaki çökeltme reaksiyonunu göstermektedir. Orta kültürler "ok antenleri" oluşturmamıştır, bunlar toksikojenik patojenler değildir.
Difteri etkeninin suşları, toksijenik (ekzotoksin üreten) ve toksik olmayan olabilir. Ekzotoksin oluşumu, bakterilerde ekzotoksin oluşumunu kodlayan toksin genini taşıyan bir profajın varlığına bağlıdır.
Hastalık durumunda, tüm difteri patojenleri toksijenite açısından test edilir - agarda bir çökeltme reaksiyonu kullanılarak difteri ekzotoksin üretimi
Karmaşık serolojik reaksiyonlar ( 3 bileşenli: Ag + Ig + C):
Kompleman fiksasyon reaksiyonu (RSC).
Reaksiyon iki aşamada gerçekleştirilir.
İlk aşamada, antikorlar AG ve tamamlayıcı ile etkileşime girer; ikinci aşamada bir gösterge eklenir - hemolitik sistem (bir eritrosit ve anti-eritrosit serumu karışımı).
Olumlu bir sonuçla, ilk aşamada AT, reaksiyon karışımının tamamlayıcısını bağlayan AG ile bir bağışıklık kompleksi oluşturur.
Bu durumda ikinci aşamada eklenen hemolitik sistemin eritrositleri yok edilmez.
Aksi takdirde, bağlanmamış tamamlayıcı, gösterge kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına neden olur.
Beş bileşen gerektirir: AG, AT ve tamamlayıcı (birinci sistem), ram eritrositler ve hemolitik serum (ikinci sistem) (Şekil 1).
Reaksiyon iki fazda ilerler (Şekil 3).
İlk etap - antijen ve antikorların, tamamlayıcının zorunlu katılımı ile etkileşimi.
İkinci - bir gösterge hemolitik sistem (koyun eritrositleri ve hemolitik serum) kullanılarak reaksiyon sonuçlarının tanımlanması. Eritrositlerin hemolitik serum tarafından yok edilmesi, yalnızca hemolitik sisteme kompleman bağlanması durumunda meydana gelir. Kompleman antijen-antikor kompleksi üzerinde daha önce adsorbe edilmişse, eritrositlerin hemolizi meydana gelmez (Şekil).
Deneyimin sonucu
değerlendirin (Şekil 2), tüm tüplerde hemoliz varlığına veya yokluğuna dikkat edin. Test tüpündeki sıvı renksiz olduğunda ve eritrositler dibe çöktüğünde, hemolizde tam bir gecikme ile reaksiyon pozitif olarak kabul edilir, negatif - sıvı yoğun bir şekilde renklendiğinde ("lak" kan) eritrositlerin tamamen parçalanmasıyla .
Hemoliz gecikmesinin derecesi, sıvının renk yoğunluğuna ve alttaki eritrosit tortusu miktarına (++++, +++, ++, +) bağlı olarak tahmin edilir.
Pirinç. 4. RSC'nin beyanı ve sonucu.
Çözüm:Çalışılan serumda antikorlar tespit edildi.
RSK, aynı virüs serotipinin herhangi bir türüne karşı antikorları tespit etmenizi sağlar.
Teşhis değeri:
eşleştirilmiş serumlarda antikor titresinde dört kat artış (grip salgını sırasında);
karakteristik bir klinik tabloya sahip hastaların kan serumunda iki kat artış.
Etiket Reaksiyonları :
Bu yöntemler oldukça hassastır. Boyalar, radyoaktif izotoplar, enzimler vb., antijenler veya antikorlar için etiketler olarak kullanılır.
RIF - immünofloresan reaksiyonu
İmmünofloresan reaksiyonu, antijen-antikor kompleksinin ışık göstergesine dayanır.
Bağlantılı immünosorbent tahlili.
Sadece etiyolojiyi değil, aynı zamanda hastalığın evresini de belirlemek için kandaki spesifik antikorlar veya spesifik hastalıklar için antijenlerin arandığı modern bir laboratuvar çalışması.
ELISA sonuçları niteliksel ve niceliksel olarak yayınlanabilir.
Şu anda, ELISA aşağıdaki durumlarda kullanılmaktadır:
1) herhangi bir bulaşıcı hastalığa spesifik antikorları araştırmak;
2) herhangi bir hastalığın antijenlerini arayın (bulaşıcı, zührevi hastalıklar);
3) hastanın hormonal durumunun incelenmesi;
4) tümör belirteçleri için muayene;
5) otoimmün hastalıkların varlığı için muayene.
Şekilde, katı fazlı ELISA - bilinen antijenler (solda) plakanın kuyusuna adsorbe edilir, (sağda) plakanın kuyularına adsorbe edilir, bilinen antikorlar
ELISA yönteminin avantajları:
1) ELISA yönteminin yüksek özgüllüğü ve duyarlılığı (%90'dan fazla).
2) Hastalığı belirleme ve sürecin dinamiklerini takip etme, yani farklı zaman aralıklarındaki antikor miktarını karşılaştırma yeteneği.
3) Herhangi bir tıbbi kurumda ELISA teşhisinin mevcudiyeti.
Göreceli eksiklik: Bir enzim etiketi ile konjuge edilmiş patojenin kendisinin değil, bir bağışıklık tepkisinin (antikorlar) saptanması.
ELISA ayarı (genel mekanizma):
Enzim bağlantılı immünosorbent testinin temeli, bir antijenin ve bir antikorun bir immün kompleksi oluşumu ile immün reaksiyonudur: bir antijen-antikor, antikorların yüzeyindeki spesifik etiketlerin enzimatik aktivitesinde bir değişiklik ile sonuçlanır.
Reaksiyon bileşenleri:
1. AG(AT) biliniyor - tabletin kuyucuğunda.
2. AT (AG) araştırıldı.
3. AT(AG)-AG(AT) kompleksine özgü bir enzime sahip AT
4. enzim ile etkileşime giren kromojenik substrat
5. durdurma çözümü
ELISA'nın ana aşamaları
1. Tabletin oyuklarının yüzeyinde, belirli bir patojenin saflaştırılmış bir antijeni bulunur. Bunlara hastanın biyolojik materyali eklenir, bu antijen ile istenen antikor (immünoglobulin) arasında spesifik bir reaksiyon oluşur. Bir kompleks oluşur.
2. Bir enzim ile bir konjugat eklenir - AT. Konjugant, birinci aşamanın AT-AG kompleksine özgüdür. Enzim aktive edilir.
3. Bir substrat eklenir ve aktif enzim onunla etkileşime girerek çözeltinin renksiz rengini değiştirir.
4. Enzim-substrat etkileşimini durdurmak için bir durdurma solüsyonu eklenir.
Muhasebe.
Olumlu bir sonuç, renkteki bir değişikliktir - sarı.
immünokromatografik analiz
İmmünokromatografik analiz yöntemi (ICA, hızlı testler), birkaç dakika içinde herhangi bir koşulda hızlı bir şekilde analiz yapmanızı sağlayan kalitatif bir tarama ön yöntemidir. "alan".
ICA'nın faydaları şunları içerir:
Hız ve kullanım kolaylığı;
Küçük numune hacimleri, numune hazırlama yok;
Üretici ve tüketici için ucuzluk;
Büyük hacimlerde testler üretebilme;
Sonucu okuma ve yorumlama kolaylığı;
Yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik;
Kantitatif belirleme imkanı;
Bilgisayarla uyumlu taşınabilir okuyucuları kullanabilme;
Çoklu analiz imkanı.
Bileşenler (test şeridine uygulanır):
1. Kolloidal altınla etiketlenmiş konjugat - belirlenen AG'ye özgü.
2. Test hattının AT'si - AT-AG kompleksine özgü
3. Kontrol çizgisinin abs'leri konjugata özeldir.
IHA ayarı:
1. Numunenin şeridin belirlenmiş başlangıç alanına uygulanması.
2. Test ve kontrol çizgileri yerine renkli bantların görünümü şeklinde bir sonuç elde edilmesi.
Muhasebe
Pozitif - test çizgisini boyarken.
Negatif - test çizgisinin boyanmaması durumunda.
Geçersiz - kontrol hattının boyanmadığı durumlarda.
Genel IHA mekanizması:
1. Numune başlangıç alanına (numune pedi) yerleştirilir ve konjugat pedinde bulunan konjugata (renk işaretli özel gövde) bağlanır. Sonuç olarak, renkli bir kompleks oluşur.
2. Ortaya çıkan renkli bağışıklık kompleksi, kılcal kuvvetlerin etkisi altında nitroselüloz zarı boyunca hareket eder. ve etkileşime girerAT test hattı ile.Sonuç, tek renkli pembe-kırmızı bir şerittir.
3. Abs, test bandına bağlı değil (konjugat)hareket eder ve kontrol çizgisine ulaşır, kontrol çizgisinin AT'sine bağlanır.Sonuç olarak, ikinci bir renkli bant belirir.Analiz doğru yapılırsa, biyolojik sıvı örneğinde araştırılan antijenin (antikor) varlığından bağımsız olarak Kontrol çizgisi her zaman görünmelidir.
2. Serolojik reaksiyonların yürütülmesi için koşullar.
1. Homolog varlığı - birbirine karşılık gelen antijen ve antikor.
2. Temiz, kuru bulaşıklar.
3. Belirli bir ilaç oranı (çoğunlukla eşittir).
4. Elektrolitin zorunlu varlığı (izotonik NaCl çözeltisi).
5. pH nötr veya hafif alkaliye yakın.
6. Sıcaklık + 37 ° С veya oda sıcaklığı (mutlaka pozitif).
7. Antijen kontrolü ve serum (antikor) kontrolü yapılır.
3 Serum Gereksinimleri
Serum, herhangi bir hücre karışımı olmadan tamamen berrak olmalıdır.
Genellikle, antikorların zaten mevcut olduğu hastalığın 2. haftasında elde edilir.
Aç karnına veya yemekten 6 saat sonra 3-5 ml kan alınır.
Serum elde etmek için kan 1 saat oda sıcaklığında bırakılır veya santrifüj edilir. Oluşan elementleri yakalamamak için serum çok dikkatli bir şekilde emilir.
Bağışıklık serumları, ilgili antijen (aşı) ile belirli bir şemaya göre bağışıklanmış insan veya hayvanların (genellikle tavşanlar ve atlar) kanından elde edilir. Peynir altı suyu genellikle üretimde hazırlanır.
4. Olumlu ve olumsuz sonuç kavramı.
RA.
Pozitif bir reaksiyonla, pasif olarak yapıştırılmış eritrositler, kuyunun dibini, taraklı kenarlı ("şemsiye") eşit bir tabaka ile kaplar; aglütinasyon yokluğunda, eritrositler kuyunun merkezi girintisinde birikir ve keskin kenarları olan kompakt bir "düğme" oluşturur (yukarıdaki şekillere bakın).
RP.
Olumlu bir sonuçla, iki çözeltinin sınırında sütsü bir halka oluşur (yukarıdaki şekillere bakın).
ELISA.
Pozitif bir reaksiyonla çözeltinin renginde bir değişiklik meydana gelir.
RSK.
Hemoliz gecikmesi - reaksiyon pozitiftir; kompleman serbest ise hemoliz gözlenir - reaksiyon negatiftir(yukarıdaki resimlere bakın).
Wasserman reaksiyon sonuçları:
a - hemolizde tam gecikme (+ + ++);
b - hemolizde belirgin gecikme (+ ++);
c - hemolizde kısmi gecikme (++);
d - zayıf hemoliz gecikmesi (+);
e - tam hemoliz (-).
Reaksiyon, test tüplerinin içeriğinin açık pembeden parlak kırmızıya boyanma derecesi ile belirlenen hemolizde kısmi, belirgin ve tam bir gecikme ile pozitiftir, hemolize edilmemiş eritrositler daha sonra kırmızı bir çökelti oluşturur.
Ev ödevi:
1. Malzemeyi inceleyin
Videoya 3 not alın
13.1. Antijen-antikor reaksiyonları ve kullanımları
Bir antijen enjekte edildiğinde, vücutta antikorlar oluşur. Antikorlar, sentezlerine neden olan antijenin tamamlayıcısıdır ve ona bağlanabilmektedir. Antijenlerin antikorlara bağlanması iki aşamadan oluşur. Birinci faz, antijenik determinantın antikorların Fab fragmanının aktif merkezine hızlı bir şekilde bağlandığı spesifiktir. Bağlanmanın van der Waals kuvvetleri, hidrojen ve hidrofobik etkileşimlerden kaynaklandığına dikkat edilmelidir. Bağ gücü, antikorun aktif bölgesi ile antijenin epitopu arasındaki uzamsal yazışma derecesi ile belirlenir. Belirli bir aşamadan sonra, daha yavaş olan başlar - görünür bir fiziksel fenomenle kendini gösteren spesifik olmayan (örneğin, aglütinasyon sırasında pul oluşumu, vb.).
Bağışıklık reaksiyonları, antikorlar ve antijenler arasındaki etkileşimlerdir ve bu reaksiyonlar spesifik ve oldukça hassastır. Tıbbi uygulamada yaygın olarak kullanılırlar. Bağışıklık reaksiyonlarının yardımıyla aşağıdaki görevler çözülebilir:
Bilinen antijenler tarafından bilinmeyen antikorların belirlenmesi (antijenik teşhis). Böyle bir görev, hastanın kan serumunda (serodiagnoz) patojene karşı antikorların belirlenmesi gerektiğinde gerçekleşir. Antikor bulmak, tanıyı doğrulamanıza olanak tanır;
Bilinen antikorlar tarafından bilinmeyen antijenlerin belirlenmesi (tanısal serum). Bu çalışma, hastanın materyalinden (serotipleme) izole edilen patojenin kültürünü tanımlarken ve ayrıca tespit ederken gerçekleştirilir.
mikropların antijenleri ve kandaki ve diğer biyolojik sıvılardaki toksinleri. Ayarlama tekniğinde ve kaydedilen etkide farklılık gösteren birçok bağışıklık tepkisi türü vardır. Bunlar aglütinasyon reaksiyonları (RA), çökelme (RP), kompleman içeren reaksiyonlar (RCC), etiketli bileşenleri kullanan reaksiyonlardır (RIF, ELISA, RIA).
13.2. aglütinasyon reaksiyonu
Aglütinasyon reaksiyonu (RA), elektrolitlerin varlığında bir antijenin antikorlarla etkileşiminin bir immün reaksiyonudur ve antijen, korpüsküler bir durumdadır (eritrositler, bakteriler, adsorbe edilmiş antijenlere sahip lateks partikülleri). Aglütinasyon sırasında, korpüsküler antijenler, flokülent bir çökelti oluşumu ile kendini gösteren antikorlar tarafından birbirine yapıştırılır. Pul oluşumu, antikorların iki aktif merkeze sahip olması ve antijenlerin çok değerli olması nedeniyle oluşur, yani. birden fazla antijenik belirleyiciye sahiptir. RA, hastanın materyalinden izole edilen patojeni tanımlamanın yanı sıra hastanın kan serumundaki patojene karşı antikorları tespit etmek için kullanılır (örneğin, brusellozda Wright ve Huddleson reaksiyonları, tifo ve paratifo ateşinde Vidal reaksiyonu). ).
RA'yı kurmanın en kolay yolu cam üzerinde bir reaksiyondur, bu hastadan izole edilen patojeni belirlemek için kullanılan yaklaşık bir RA'dır. Reaksiyonu bir cam slayt üzerine ayarlarken, tanısal aglütinasyon serumu (1:10 veya 1:20 dilüsyonunda) uygulanır, ardından hastadan bir kültür verilir. Damlada pıhtılaşmış bir çökelti belirirse reaksiyon pozitiftir. Yakınına bir kontrol yerleştirilir: serum yerine bir damla sodyum klorür çözeltisi uygulanır. Tanısal aglütinasyon serumu adsorbe edilmemişse 1, o zaman seyreltilir (titreye - aglütinasyonun gerçekleşmesi gereken seyreltme), yani. genişletilmiş RA'yı artan test tüplerine koyun
1 Adsorplanmamış aglütinasyon serumu, ortak (çapraz reaksiyona giren) antijenlere sahip ilgili bakterileri aglütine edebilir. Bu nedenle, keyfini çıkarınadsorbe edilmiş aglütinasyon serumu, ilgili bakteriler tarafından adsorpsiyon yoluyla çapraz reaktif antikorların çıkarıldığı. Bu tür serumlarda sadece bu bakteriye özgü antikorlar kalır.
hastadan izole edilen patojenin 2-3 damla süspansiyonunun eklendiği aglütinasyon serumu seyreltimleri. Aglütinasyon, test tüplerindeki tortu miktarı ve sıvının berraklaşma derecesi ile dikkate alınır. Teşhis serumunun titresine yakın bir seyreltmede aglütinasyon not edilirse reaksiyon pozitif olarak kabul edilir. Reaksiyona kontroller eşlik eder: izotonik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiş serum şeffaf olmalı, aynı çözeltideki mikropların süspansiyonu tortusuz, homojen bir şekilde bulanık olmalıdır.
Hastanın kan serumunda patojene karşı antikorları belirlemek için genişletilmiş bir RA kullanılır. Test tüplerine konulduğunda hastanın kan serumu seyreltilir ve test tüplerine eşit miktarda diagnostik süspansiyonu (öldürülen mikropların süspansiyonu) eklenir. İnkübasyondan sonra, aglütinasyonun meydana geldiği en yüksek serum seyreltisi belirlenir, yani. oluşan bir çökelti (serum titresi). Bu durumda, O-diagnosticum (ısıtarak öldürülen, termostabil bir O-antijeni tutan bakteri) ile aglütinasyon reaksiyonu, ince taneli aglütinasyon şeklinde meydana gelir. H-diagnosticum (formalin tarafından öldürülen, ısıya dayanıklı flagellar H-antijeni tutan bakteri) ile aglütinasyon reaksiyonu kaba tanelidir ve daha hızlı ilerler.
Dolaylı (pasif) hemaglütinasyon reaksiyonu(RNGA veya RPGA) bir RA türüdür. Bu yöntem oldukça hassastır. RNGA yardımıyla iki görev çözülebilir: antijenik eritrosit teşhisinin eklendiği hastanın kan serumundaki antikorları belirlemek, yani bilinen antijenlerin adsorbe edildiği eritrositler; test materyalinde antijenlerin varlığını belirleyin. Bu durumda reaksiyon bazen ters dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonu (RONGA) olarak adlandırılır. Evreleme sırasında, test materyaline bir antikor eritrosit teşhisi (yüzeylerinde adsorbe edilmiş antikorlara sahip eritrositler) eklenir. Bu reaksiyondaki eritrositler taşıyıcı görevi görür ve bağışıklık kümelerinin oluşumunda pasif olarak yer alır. Pozitif bir reaksiyonla, pasif olarak yapıştırılmış eritrositler, kuyunun dibini, taraklı kenarlı ("şemsiye") eşit bir tabaka ile kaplar; aglütinasyon yokluğunda, eritrositler deliğin merkezi girintisinde birikir ve keskin bir şekilde tanımlanmış kenarları olan kompakt bir "düğme" oluşturur.
pıhtılaşma reaksiyonuüzerine adsorbe edilen antikorları kullanarak patojen hücrelerini (antijenleri) tespit etmek için kullanılır. stafilokok aureus, protein A içeren. Protein A, immünoglobulinlerin Fc fragmanı için bir afiniteye sahiptir. Bu nedenle, antikorlar stafilokoklara Fc fragmanı yoluyla dolaylı olarak bağlanır ve Fab fragmanları dışa doğru yönlendirilir ve hastalardan izole edilen karşılık gelen mikroplarla etkileşime girebilir. Bu durumda, pullar oluşur.
Hemaglütinasyon inhibisyon reaksiyonu (HITA) viral enfeksiyonların tanısında ve sadece hemaglutine edici virüslerin neden olduğu enfeksiyonlarda kullanılır. Bu virüsler, yüzeylerinde eritrosit virüslerine eklendiğinde hemaglütinasyon reaksiyonundan (RHA) sorumlu olan bir protein - hemaglutinin içerir. RTGA, viral antijenlerin antikorlarla bloke edilmesinden oluşur, bunun sonucunda virüsler kırmızı kan hücrelerini aglütine etme yeteneklerini kaybeder.
Coombs reaksiyonu - Eksik antikorların tespiti için RA. Bruselloz gibi bazı bulaşıcı hastalıklarda, hastanın kan serumunda patojene karşı eksik antikorlar dolaşır. Eksik antikorlar, tam antikorlar gibi iki değil, bir antijen bağlama bölgesine sahip oldukları için bloke etme olarak adlandırılır. Bu nedenle, bir antijenik tanı eklendiğinde, eksik antikorlar antijenlere bağlanır, ancak onları birbirine yapıştırmaz. Reaksiyonu ortaya çıkarmak için, reaksiyonun ilk aşamasında oluşan immün komplekslerin (antijenik tanı + eksik antikorlar) aglütinasyonuna yol açacak olan antiglobulin serumu (insan immünoglobulinlerine karşı antikorlar) eklenir.
Dolaylı Coombs reaksiyonu intravasküler hemolizli hastalarda kullanılır. Bu hastaların bazılarında eksik monovalan anti-Rhesus antikorları bulunur. Spesifik olarak Rh pozitif eritrositler ile etkileşime girerler, ancak aglütinasyonlarına neden olmazlar. Bu nedenle, eritrositlerin aglütinasyonuna neden olan anti-Rh antikorları + Rh-pozitif eritrositler sistemine antiglobulin serumu eklenir. Coombs reaksiyonu kullanılarak, bağışıklık kaynaklı eritrositlerin intravasküler lizisi ile ilişkili patolojik durumlar, örneğin Rh çatışması nedeniyle yenidoğanın hemolitik hastalığı teşhis edilir.
Kan gruplarının belirlenmesi için RA A (II), B (III) kan gruplarının antijenlerine karşı immün serum antikorları tarafından eritrositlerin aglütinasyonuna dayanır. Kontrol, antikor içermeyen serumdur, yani. serum AB (IV) kan grupları ve A (P) ve B (III) gruplarının eritrosit antijenleri. Grup 0(I) eritrositler, antijenleri olmadığı için negatif kontrol olarak kullanılır.
Rh faktörünü belirlemek için anti-Rh serumları kullanılır (en az iki farklı seri). İncelenen eritrositlerin zarında Rh antijeni varlığında bu hücrelerin aglütinasyonu meydana gelir.
13.3. Yağış reaksiyonu
RP, elektrolitlerin varlığında antikorların antijenlerle etkileşiminin bir immün reaksiyonudur ve antijen çözünür bir durumdadır. Çökeltme sırasında, çözünür antijenler, çökelme bantları şeklinde bulanıklık ile kendini gösteren antikorlar tarafından çökeltilir. Her iki reaktif eşdeğer oranlarda karıştırıldığında görünür bir çökelti oluşumu gözlemlenir. Bunlardan birinin fazlası, çöken bağışıklık komplekslerinin miktarını azaltır. Bir çökeltme reaksiyonu oluşturmanın çeşitli yolları vardır.
Halka çökelme reaksiyonu küçük çaplı çökeltme tüplerine yerleştirilir. Bağışıklık serumu test tüpüne eklenir ve çözünür antijen dikkatlice katmanlanır. Olumlu bir sonuçla, iki çözeltinin sınırında sütlü bir halka oluşur. Ekstraktları kaynatılıp filtre edilen organ ve dokularda antijenlerin varlığını belirleyen halka çökeltme reaksiyonuna termopresipitasyon reaksiyonu (termostabil şarbon antijeni belirlemek için Ascoli reaksiyonu) denir.
Ouchterlony çift immünodifüzyon reaksiyonu. Bu reaksiyon, bir agar jeli üzerinde gerçekleştirilir. Kuyucuklar, birbirinden belirli bir mesafede eşit kalınlıkta bir jel tabakasında kesilir ve sırasıyla antijen ve bağışıklık serumu ile doldurulur. Bundan sonra, antijenler ve antikorlar jel içine yayılır, birbirleriyle buluşur ve jel içinde çöken ve çökelme çizgileri olarak görünür hale gelen bağışıklık kompleksleri oluşturur.
beslenme. Bu reaksiyon, bilinmeyen antijenleri veya antikorları saptamak ve farklı antijenler arasındaki benzerliği kontrol etmek için kullanılabilir: antijenler aynıysa, çökelme çizgileri birleşir; antijenler aynı değilse, çökelme çizgileri kesişir; antijenler aynıysa kısmen aynı, bir mahmuz oluşur.
Radyal immünodifüzyon reaksiyonu. Eritilmiş agar jele antikorlar eklenir ve jel, slayt üzerine eşit bir tabaka halinde uygulanır. Jelde kuyucuklar kesilir ve bunlara çeşitli konsantrasyonlarda standart bir antijen çözeltisi hacmi verilir. İnkübasyon sırasında antijenler kuyudan radyal olarak yayılır ve antikorlarla karşılaştıklarında bir çökelme halkası oluşturur. Kuyuda fazla antijen olduğu sürece, çökelme halkasının çapında kademeli bir artış olur. Bu yöntem, test çözeltisindeki antijenleri veya antikorları belirlemek için kullanılır (örneğin, kan serumunda farklı sınıflardaki immünoglobulinlerin konsantrasyonunu belirlemek için).
İmmünoelektroforez. Antijen karışımı ön olarak elektroforez ile ayrılır, ardından protein hareketi yönünde ilerleyen oluğa çöken antiserum verilir. Antijenler ve antikorlar jele birbirlerine doğru yayılır; etkileşime girerek kavisli yağış çizgileri oluştururlar.
flokülasyon reaksiyonu(Ramon'a göre) - antitoksik serum veya toksoidin aktivitesini belirlemek için kullanılan bir tür çökelme reaksiyonu. Reaksiyon test tüplerinde gerçekleştirilir. Toksoid ve antitoksinin eşdeğer oranda olduğu bir test tüpünde bulanıklık gözlenir.
13.4. Kompleman fiksasyon reaksiyonu
Karşılık gelen antijen ile etkileşime giren antikorlar, eklenen tamamlayıcıyı (1. sistem) bağlar. Kompleman fiksasyonunun göstergesi, hemolitik serum tarafından duyarlı hale getirilen eritrositlerdir, yani. eritrositlere karşı antikorlar (2. sistem). 1. sistemde tamamlayıcı sabit değilse, yani. antijen-antikor reaksiyonu oluşmaz, daha sonra hassaslaştırılmış kırmızı kan hücreleri tamamen parçalanır (negatif reaksiyon). Kompleman, 1. sistemin immün kompleksleri ile bağlandığında, duyarlılaştırılmış eritrositlerin eklenmesinden sonra, hemoliz
yok (pozitif reaksiyon). Kompleman fiksasyon reaksiyonu, bulaşıcı hastalıkları (gonore, sifiliz, grip, vb.) teşhis etmek için kullanılır.
13.5. Nötrleştirme reaksiyonu
Mikroplar ve onların toksinleri, insan vücudunun organları ve dokuları üzerinde zararlı bir etkiye sahiptir. Antikorlar bu zararlı ajanlara bağlanıp onları bloke edebilir, yani. etkisiz hale getirmek. Tanısal nötralizasyon reaksiyonu, antikorların bu özelliğine dayanır. Hayvanlara veya hassas test nesnelerine (hücre kültürü, embriyolar) bir antijen-antikor karışımı sokularak gerçekleştirilir. Örneğin hastanın materyalindeki toksinleri tespit etmek için 1. grup hayvanlara hastanın materyali enjekte edilir. 2. grubun hayvanlarına benzer bir materyal enjekte edilir, uygun antiserum ile ön işleme tabi tutulur. 1. grubun hayvanları, materyalde toksin varlığında ölür. İkinci grup hayvan hayatta kalır, nötralize edildiğinden toksinin zararlı etkisi kendini göstermez.
13.6. Etiketli antikorlar veya antijenler kullanan reaksiyonlar
13.6.1. İmmünofloresan reaksiyonu (RIF, Koons yöntemi)
Bu yöntem hızlı teşhis için kullanılır. Hem mikrobiyal antijenleri hem de antikorları tespit edebilir.
Doğrudan RIF yöntemi- antikorların antijenlerle etkileşiminin bir bağışıklık reaksiyonu ve antikorlar bir florokrom ile etiketlenmiştir - belirli bir dalga boyundaki ışıkla çarpıldığında belirli bir dalga boyunda ışık kuantumları yayan bir madde. Bu yöntemi ayarlamanın özelliği, spesifik olmayan ışıldama tespitini hariç tutmak için reaksiyona girmemiş bileşenlerin çıkarılması ihtiyacıdır. Bunu yapmak için, reaksiyona girmemiş antikorların aklanmasını gerçekleştirin. Sonuçlar bir floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilir. Böyle bir ışıldayan serumla tedavi edilen bir yaymadaki bakteri, hücrenin çevresi boyunca koyu bir arka plan üzerinde parlar.
Dolaylı RIF yöntemiöncekinden daha fazla kullanıldı. Bu reaksiyon iki aşamada gerçekleştirilir. İlk aşamada antijenler karşılıklı olarak
karşılık gelen antikorlarla etkileşime girerek bağışıklık kompleksleri oluşturur. Reaksiyona girmeyen (yani bağışıklık komplekslerinin bir parçası olmayan) tüm bileşenler yıkama ile uzaklaştırılmalıdır. İkinci aşamada, oluşan antijen-antikor kompleksi, florokrom antiglobulin serumu kullanılarak saptanır. Sonuç olarak, kompleks bir mikrop + antimikrobiyal tavşan antikorları + florokrom ile etiketlenmiş tavşan immünoglobulinlerine karşı antikorlar oluşur. Sonuçlar bir floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilir.
13.6.2. İmmünoassay veya tahlil
ELISA, viral, bakteriyel, protozoal enfeksiyonları teşhis etmek, özellikle HIV enfeksiyonu, viral hepatit vb. teşhis etmek için kullanılan en yaygın modern yöntemdir.
Birçok ELISA modifikasyonu vardır. Katı faz rekabetçi olmayan ELISA yaygın olarak kullanılmaktadır. 96 oyuklu polistiren plakalarda (katı faz) gerçekleştirilir. Reaksiyon sırasında, reaksiyona girmeyen bileşenlerin her aşamada yıkanması gerekir. Antikorlar belirlenirken, antijenlerin adsorbe edildiği kuyucuklar, incelenen kan serumu, ardından enzimle etiketlenen antiglobulin serumu ile doldurulur. Enzim için bir substrat ekleyerek reaksiyonu gösterin. Enzim varlığında substrat değişir ve enzim-substrat kompleksi reaksiyonda oluşan ürün renklenecek şekilde seçilir. Böylece pozitif bir reaksiyonla çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenir. Antijenleri belirlemek için, bir katı fazlı taşıyıcı antikorlarla hassaslaştırılır, ardından test materyali (antijenler) ve enzim etiketli antijen serumu sırayla eklenir. Reaksiyonun tezahürü için enzim için bir substrat eklenir. Pozitif bir reaksiyonla çözeltinin renginde bir değişiklik meydana gelir.
13.6.3. immünoblotlama
Bu yöntem, elektroforez ve ELISA kombinasyonuna dayanmaktadır. İmmünoblotlama yaparken (İngilizceden lekeleme. kirletmek- nokta) karmaşık bir antijen karışımı önce bir poliakrilamid jel içinde elektroforeze tabi tutulur. Elde edilen fraksiyonlu anti-
gen peptitleri bir nitroselüloz membrana aktarılır. Lekeler daha sonra spesifik antijene karşı enzim etiketli antikorlarla, yani. bir ELISA lekesi yapın. İmmünoblotlama, HIV gibi enfeksiyonların tanısında kullanılır.
13.6.4. Bağışıklık elektron mikroskobu
Yöntem, daha önce elektron optik olarak yoğun müstahzarlarla etiketlenmiş uygun bir bağışıklık serumu, örneğin demir içeren bir protein olan ferritin ile muamele edilmiş virüslerin (nadiren diğer mikropların) bir elektron mikroskobunda mikroskopiden oluşur.
13.7. akış sitometrisi
Kan hücreleri, lazer sitoflorometrisine dayalı olarak farklılaştırılır. Bunu yapmak için istenen hücreler, CD antijenlerine karşı floresan monoklonal antikorlarla boyanır. Etiketli antikorlarla tedaviden sonra bir kan örneği ince bir tüpten geçirilir ve içinden florokromun lüminesansını uyaran bir lazer ışını geçirilir. Floresan yoğunluğu, hücre yüzeyindeki antijenlerin yoğunluğu ile ilişkilidir ve bir fotoçoğaltıcı kullanılarak ölçülebilir. Elde edilen sonuçlar bir histograma dönüştürülür.
Akış sitometrisi, bağışıklık durumunu belirlemek için kullanılır (ana lenfosit popülasyonlarının içeriği, hücre içi ve hücre dışı sitokinlerin içeriği, NK hücrelerinin fonksiyonel aktivitesi, fagositoz aktivitesi vb.).
29 Aglütinasyon reaksiyonu. Bileşenler, mekanizma, ayar yöntemleri. Başvuru.
aglütinasyon reaksiyonu- antikorların korpüsküler antijenleri (bakteriler, eritrositler veya diğer hücreler, üzerlerinde adsorbe edilmiş antijenleri olan çözünmeyen partiküller ve ayrıca makromoleküler agregalar) bağladığı basit bir reaksiyon. Elektrolitlerin varlığında, örneğin bir izotonik sodyum klorür çözeltisi eklendiğinde meydana gelir.
Aglütinasyon reaksiyonunun çeşitli varyantları kullanılır: genişletilmiş, yaklaşık, dolaylı, vb. Aglütinasyon reaksiyonu, pul veya tortu oluşumu ile kendini gösterir (iki veya daha fazla antijen bağlama merkezine sahip antikorlar tarafından "yapıştırılmış" hücreler - Şekil 13.1) . RA aşağıdakiler için kullanılır:
1) antikor tespitiörneğin bruselloz (Wright, Heddelson reaksiyonları), tifo ateşi ve paratifoid ateşi (Vidal reaksiyonu) ve diğer bulaşıcı hastalıkları olan hastaların kan serumunda;
2) patojen tanımları hastadan izole;
3) kan gruplarının belirlenmesi eritrosit alloantijenlerine karşı monoklonal antikorların kullanılması.
Hastanın antikorlarını belirlemek için ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu koyun: hastanın kan serumunun seyreltmelerine bir teşhis (öldürülen mikropların süspansiyonu) eklenir ve 37 ° C'de birkaç saat inkübasyondan sonra, aglütinasyonun meydana geldiği serumun (serum titresi) en yüksek seyreltmesi not edilir, yani. oluşan çökelti.
Aglütinasyonun doğası ve hızı, antijenin ve antikorların tipine bağlıdır. Bir örnek, diagnostiklerin (O- ve H-antijenleri) spesifik antikorlarla etkileşiminin özellikleridir. O-diagnosticum (ısıtarak öldürülen, termostabil bir O-antijeni tutan bakteri) ile aglütinasyon reaksiyonu, ince taneli aglütinasyon şeklinde meydana gelir. H-diagnosticum (formalin tarafından öldürülen, ısıya dayanıklı flagellar H-antijeni tutan bakteri) ile aglütinasyon reaksiyonu kaba tanelidir ve daha hızlı ilerler. Hastadan izole edilen patojenin belirlenmesi gerekiyorsa, Aglütinasyon reaksiyonunun yönlendirilmesi, tanı antikorları (aglütinasyon serumu) kullanılarak, yani patojenin serotiplenmesi gerçekleştirilir. Bir cam slayt üzerinde yaklaşık bir reaksiyon gerçekleştirilir. 1:10 veya 1:20'lik bir dilüsyonda bir damla diagnostik aglütinasyon serumuna hastadan izole edilen patojenin saf kültürünü ekleyin. Yakınına bir kontrol yerleştirilir: serum yerine bir damla sodyum klorür çözeltisi uygulanır. Serum ve mikrop içeren bir damlada topaklayıcı bir tortu göründüğünde, test tüplerinde, 2-3 damla patojen süspansiyonunun eklendiği artan aglütinasyon serumu seyreltileri ile ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu gerçekleştirilir. Aglütinasyon, tortu miktarı ve sıvının berraklaşma derecesi ile dikkate alınır. Teşhis serumunun titresine yakın bir seyreltmede aglütinasyon not edilirse reaksiyon pozitif olarak kabul edilir. Aynı zamanda, kontroller de dikkate alınır: izotonik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiş serum şeffaf olmalı, aynı çözelti içindeki bir mikrop süspansiyonu, tortu olmadan homojen bir şekilde bulanık olmalıdır.
Farklı ilgili bakteriler, aynı tanısal aglütinasyon serumu ile aglütine edilebilir.
onları tanımlamayı zorlaştırır. Bu nedenle adsorbe edilmiş aglütinasyon serumları kullanılır.
ilgili bakterilere adsorpsiyon yoluyla çapraz reaksiyona giren antikorlar. Bu serumlar antikor içerir
bu bakteriye özel.
aglütinasyon reaksiyonu
Aglütinasyon (lat. aglütinasyon- yapıştırma) - antijen taşıyan korpüsküler parçacıkların (bütün hücreler, lateks parçacıkları vb.) elektrolitlerin varlığında spesifik antikor molekülleri ile yapıştırılması (bağlanması), bu da pul veya tortu (aglütinat) oluşumu ile sona erer. çıplak göz. Sedimentin doğası antijenin doğasına bağlıdır: flagellar bakteriler büyük bir pul tortu verir, flagellar ve kapsülsüz - ince taneli, kapsüler - lifli. Spesifik antikorlarla etkileşimin, bir bakteriyel veya eritrositler gibi başka herhangi bir hücrenin kendi antijenlerini doğrudan içerdiği doğrudan aglütinasyonu ayırt eder; ve bakteri hücrelerinin veya eritrositlerin veya lateks parçacıklarının kendilerine özgü antikorları (veya antijenleri) tespit etmek için kendilerine adsorbe edilen yabancı antijenlerin (veya antikorların) taşıyıcıları olduğu dolaylı veya pasif. Aglütinasyon reaksiyonu esas olarak IgG ve IgM sınıflarına ait antikorları içerir. İki aşamada ilerler: ilk olarak, aktif antikor merkezinin antijen belirleyici ile spesifik bir etkileşimi vardır, bu aşama elektrolitlerin yokluğunda meydana gelebilir ve reaksiyona giren sistemde gözle görülür değişiklikler eşlik etmez. İkinci aşama, aglütinat oluşumu, antijen + antikor komplekslerinin elektrik yükünü azaltan ve yapıştırma sürecini hızlandıran elektrolitlerin varlığını gerektirir. Bu aşama aglütinat oluşumu ile sona erer.
Aglütinasyon reaksiyonları, cam veya düz karton plakalar üzerine veya steril aglütinasyon tüplerine yerleştirilir. Cam üzerindeki aglütinasyon reaksiyonları (doğrudan ve pasif), genellikle hastanın serumunda (örneğin, brusellozda) spesifik antikorların saptanması veya patojenin serolojik tanımlanması için hızlandırılmış bir yöntem olarak kullanılır. İkinci durumda, genellikle sadece monoreseptör antikorları veya bunların çeşitli antijenlere setini içeren iyi saflaştırılmış (adsorbe edilmiş) tanı serumları kullanılır. Cam üzerindeki aglütinasyon reaksiyonunun şüphesiz avantajı, formülasyonunun basitliği ve her iki bileşen de konsantre bir biçimde kullanıldığı için birkaç dakika hatta saniye sürmesidir. Ancak sadece kalitatif bir değere sahiptir ve test tüpünden daha az hassastır. Test tüplerinde genişletilmiş bir aglütinasyon testi daha doğru sonuçlar verir, çünkü serumdaki antikorların kantitatif içeriğini belirlemenize (titresini ayarlamanıza) ve gerekirse, tanısal olan antikor titresindeki bir artış gerçeğini kaydetmenize izin verir. değer. Reaksiyonu kurmak için, belirli bir şekilde %0.85 NaCl solüsyonu ile seyreltilmiş serum ve 1 ml'de 1 milyar bakteri içeren standart bir diagnostik (veya test kültürü) süspansiyonunun eşit hacimli (genellikle 0.5 ml) süspansiyonu aglütinasyona verilir. tüpler. Aglütinasyon reaksiyonunun sonuçlarının hesaplanması, tüplerin 37 ° C sıcaklıkta 2 saatlik inkübasyonundan sonra ve son olarak 20-24 saat sonra iki işarete göre gerçekleştirilir: çökeltinin varlığı ve boyutu ve derecesi. süpernatantın şeffaflığı. Değerlendirme dört çapraz sisteme göre yapılır. Reaksiyona mutlaka serum ve antijenin kontrolü eşlik eder. Patojenin serolojik tanımlanması için bir test tüpünde ayrıntılı bir aglütinasyon testinin kullanıldığı durumlarda, tanısal serum titresinin en az yarısı ile seyreltildiğinde reaksiyon pozitif olarak değerlendirilirse tanısal bir değeri vardır.
Homolog antijenlerin ve antikorların çözeltilerini karıştırırken, aglütinasyon reaksiyonunun görünür tezahürlerinin her zaman gözlenmediği dikkate alınmalıdır. Her iki reaksiyon bileşeninin yalnızca belirli optimal oranlarında bir çökelti oluşur. Bu sınırların dışında, önemli miktarda antijen veya antikor ile reaksiyon gözlenmez. Bu fenomene "prozon fenomeni" denir. Hem aglütinasyon reaksiyonunda hem de çökelme reaksiyonunda gözlenir. Prozonun immün reaksiyonlardaki görünümü, bunlara dahil olan antijenlerin genellikle polideterminant olması ve IgG antikor moleküllerinin iki aktif merkeze sahip olması ile açıklanır. Fazla antikorla, her bir antijen partikülünün yüzeyi, hiçbir serbest determinant grup kalmayacak şekilde antikor molekülleri ile kaplanır, böylece ikinci, bağlanmamış aktif antikor merkezi, başka bir antijenik partikül ile etkileşime giremez ve onları birbirine bağlayamaz. Tek bir serbest aktif antikor bölgesi olmadığında, görünür bir aglütinat veya çökelti oluşumu da fazla antijen ile bastırılır ve bu nedenle antijen + antikor + antijen kompleksleri artık büyütülemez.