Етапи на метода на флуоресцентна in situ хибридизация. FISH тест: бърза диагностика на рак. Вижте какво е "флуоресцентна in situ хибридизация" в други речници

FISH е един от най-удивителните "инструменти" на молекулярната биология през 21 век. При предимплантационна диагностика изследователската техника FISH се използва за откриване на хромозомни аномалии или нарушения на хромозомното сдвояване в клетките на ембрион, току-що получен чрез ин витро оплождане (IVF). Ако не се открият аномалии или признаци на анеуплоидия (нарушения на чифтосването, липса на хромозомни двойки), тогава "изкуственият" ембрион се счита за жизнеспособен. Може да се имплантира в матката на бъдеща майка.

FISH също така дава възможност да се проследят сексуалните характеристики в хромозомния набор на ембриона. Това дава възможност да се определи пола на нероденото дете дори преди реалното настъпване на бременността (ако се счита, че това е началото на имплантирането на извънтелесен заченат ембрион в матката).

Какво е FISH?

Съкращението означава: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, или флуоресцентна in-situ хибридизация. Преписът най-вероятно не казва нищо на невежия читател. Затова ще анализираме сложната концепция на части, оставяйки непреведеното „на място“ за накрая.

Хибридизация

В молекулярната биология този термин има много специално значение, което няма нищо общо с кръстосването на видове в "обикновената" биология.

Хибридизацията е молекулярно-генетична техника, използвана за оценка на състоянието на ДНК и РНК на изследваните клетки. Основава се на свързването на отделни вериги от нуклеинови киселини в една молекула. По този начин се проверява взаимното допълване (взаимното съответствие) на молекулите или техните фрагменти. При пълно допълване веригите лесно и бързо се комбинират в обща молекула. Бавното свързване показва недостатъчно допълване. Некомплементарността на веригите се дължи именно на хромозомни аномалии (нарушения в реда на подреждане на хромозомите в определени области), несдвоени хромозоми или липса на някои двойки.

„Инструментът“ за измерване на комплементарността е температурата, при която нишките на ДНК се хибридизират в обща молекула. За да направите това, първо трябва да загреете препарата на нуклеиновата киселина и след това, след като го смесите с друг загрят препарат, да го охладите. При нагряване водородните връзки между веригите на ДНК или РНК изчезват, образуват се едноверижни фрагменти от молекули. Смесени препарати от две ДНК или РНК (или ДНК - РНК) се охлаждат. При охлаждане водородните връзки между комплементарни бази бързо се възстановяват, образува се единична, хибридна ДНК молекула (РНК или ДНК - РНК). При липса на допълване процесът отнема повече време, некомплементарните фрагменти остават незакрепени. Следователно, колкото по-висока е температурата на хибридизация, толкова по-хармонична и правилна е хромозомната структура на клетките. Колкото по-ниска е температурата, толкова повече аномалии в хромозомите. Въз основа на анализа на некомплементарни остатъци могат да бъдат идентифицирани специфични аномалии или области на анеуплоидия.

Флуоресцентно етикетиране

За анализ на комплементарността на хибридизираща ДНК (или РНК) молекула се използват специални генетични сонди (или ДНК сонди), които, разбира се, също имат малко общо с техните съименници, използвани например в хирургията.

Генетичните проби са синтезирани и специално белязани едноверижна ДНК (рядко РНК) с предварително определени свойства на комплементарност. Когато се хибридизират, те се сливат с определени генетични фрагменти, като по този начин потвърждават тяхната комплементарност. Местоположението на сондите в хибридизираната молекула показва нормалната или дефектна структура на оригиналния хромозомен материал, от който е сглобена тази "изкуствена структура".

Генетичните сонди са маркирани по-специално със светещи (флуоресцентни) вещества, което ги прави видими под обектива на специален флуоресцентен микроскоп.

Използването на различни багрила за няколко сонди позволява едновременен анализ на различни генетични структури, например за идентифициране на хромозомни региони с два насложени един върху друг гена и други аномалии.

Понастоящем, когато се извършва един анализ, генетичните проби се маркират с пет или шест различни багрила, понякога дори със седем.

In-situ означава "у дома"

Оригиналната техника на хибридизация беше тромава. Екстрахираната ДНК се денатурира в специални термични буфери, смесени в центрофуга с други денатурирани фрагменти. Хибридизацията също беше извършена в лаборатория, "в химически стъклени съдове".

Съвременните технологии позволяват извършването на in situ анализи, тоест „на място“, „у дома“, в оригинални генетични структури, а не в лабораторни препарати. Обект на изследването бяха самите клетъчни ядра (полярни тела, бластомери, повърхностни клетки на бластоциста, извлечени по време на биопсия).

Наблюдението на генетичния материал директно в ядрата на клетките ускорява процеса, прави го по-„чист“, свободен от външни въздействия и повреди, каквито не са изключени при производството на лабораторни препарати.

Има обаче проблеми, които сочат непреодолимите ограничения на този метод. Една единствена хибридизация не може да "покрие" целия набор от хромозоми в клетките. Обикновено са необходими две или три последователни хибридизации, позволяващи изследването на 12-15 хромозомни двойки (и има 23 при хората). Способността за по-нататъшна хибридизация в ДНК веригите след всяка рехибридизация постепенно намалява. Това не позволява хибридизация "колкото пъти искате" за изчерпателен анализ на същия генетичен материал.

Техниката FISH, флуоресцентна in situ хибридизация, е разработена в средата на 80-те години и се използва за откриване на наличието или отсъствието на специфични ДНК последователности върху хромозомите, както и алфа сателита на ДНК, разположен в центромера на хромозома 6, CEP6( 6p11.1-q11. 1).

Това доведе до значителна промяна в диагностиката на онкологичните заболявания с меланоцитен произход поради откриването на туморни антигени. На фона на злокачествено заболяване се определя мутация в три антигена: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) и CMM1 (1p). В тази връзка възможността за обективна диференциална диагноза, основана на определянето на генетичните характеристики на меланоцитните кожни тумори, е от голямо значение за ранната диагностика на меланома и неговите предшественици.В ядрото с нормален набор от изследваните гени и хромозома 6 , два RREB1 гена, оцветени в червено, наблюдават се два MYB гена в жълто, два CCND1 гена в зелено и две центромери на хромозома 6 в синьо. За диагностични цели се използват флуоресцентни проби.

Оценка на резултатите от реакцията: броят на червените, жълтите, зелените и сините сигнали в 30 ядра на всяка проба се преброява, идентифицират се четири параметъра на различни варианти на генетични заболявания, при които пробата е генетично съвместима с меланома. Например, проба съответства на меланом, ако средният брой CCND1 ген на ядро ​​е ≥2,5. Броят на копията на други гени се оценява по същия принцип. Едно лекарство се счита за FISH-положително, ако е изпълнено поне едно от четирите условия. Проби, в които и четирите параметъра са под граничните стойности, се считат за FISH-отрицателни.

Определянето на специфични ДНК последователности върху хромозомите се извършва върху срезове от биопсични проби или хирургически материал. На практика реакцията FISH е следната: тестовият материал, съдържащ ДНК в ядрата на меланоцитите, се обработва, за да се разруши частично неговата молекула, за да се разруши двойноверижната структура и по този начин да се улесни достъпът до желаната генна област. Пробите се класифицират според мястото на прикрепване към ДНК молекулата. Материал за реакцията FISH в клиничната практика са парафинови тъканни срезове, петна и отпечатъци.

Реакцията FISH ви позволява да откриете промени, които са настъпили в молекулата на ДНК в резултат на увеличаване на броя на копията на ген, загуба на ген, промяна в броя на хромозомите и качествени промени - движението на гена локуси както в една и съща хромозома, така и между две хромозоми.

За обработка на данните, получени чрез реакцията FISH и изследване на връзката между броя на копията на гените на трите изследвани групи, се използва корелационният коефициент на Spearman.

Меланомът се характеризира с увеличаване на броя на копията в сравнение с невуса и диспластичния невус.

Простият невус, в сравнение с диспластичния невус, има по-малко аномалии в броя на копията (т.е. повече нормални копия).

За да се изградят правила за вземане на решения за предсказване дали дадена проба принадлежи към определен клас (диференциална диагноза на прости и диспластични невуси), се използва математическият апарат на „дърветата на решенията“. Този подход се е доказал на практика и резултатите от прилагането на този метод (за разлика от много други методи, като например невронни мрежи) могат да бъдат ясно интерпретирани за изграждане на правила за вземане на решения за диференциране на прости, диспластични невуси и меланом. Първоначалните данни във всички случаи бяха номерата на копията на четири гена.

Задачата за конструиране на решаващо правило за диференциална диагностика е разделена на няколко етапа. На първия етап се диференцират меланом и невус, без да се взема предвид вида на невуса. На следващия етап се изгражда решаващо правило за разделяне на прости и диспластични невуси. И накрая, на последния етап е възможно да се изгради "дърво на решенията", за да се определи степента на дисплазия на диспластичния невус.

Такова разделение на задачата за класифициране на невусите в подзадачи позволява да се постигне висока точност на прогнозите на всеки от етапите. Входните данни за конструиране на дървото на решенията са данни за броя на копията на четири гена за пациенти с диагноза меланом и пациенти с немеланомна диагноза (пациенти с различни видове невуси – прости и диспластични). За всеки пациент са налични номера на генни копия за 30 клетки.

По този начин разделянето на задачата за прогнозиране на диагнозата на няколко етапа ни позволява да изградим правила за вземане на решения с висока точност не само за разграничаване между меланом и невуси, но и за определяне на вида на невусите и прогнозиране на степента на дисплазия за диспластичен невус. Конструираните „дървета на решенията“ са ясен начин за предсказване на диагноза въз основа на броя на генните копия и могат лесно да се използват в клиничната практика за разграничаване на доброкачествени, премалигнени и злокачествени меланоцитни кожни тумори. Предложеният допълнителен метод за диференциална диагноза е особено важен при изрязването на гигантски вродени пигментни невуси и диспластични невуси при педиатрични пациенти, тъй като такива пациенти посещават лечебни заведения с висок процент диагностични грешки. Резултатите от използването на описания метод са много ефективни, препоръчително е да се използва при диагностицирането на пигментни кожни тумори, особено при пациенти със синдром на FAMM.

Във всички случаи, без изключение, образуването и растежът са свързани с активността на гена тип HER2. Именно той е отговорен за това колко протеини ще бъдат разпределени в женското тяло за развитието на гръдната тъкан. Когато първите здрави клетки се трансформират в злокачествени, генните рецептори получават информация, че е необходимо допълнително делене на клетъчния материал.

Генът стартира програма за изграждане на допълнителна тъкан в гърдите, въпреки че в действителност този клетъчен материал ще бъде използван от тумора за неговия растеж и развитие. И така, карциномът всъщност заблуждава тялото и го принуждава да храни рака за сметка на собствените си ресурси.

Задачата на рибния анализ при рак на гърдата е именно да идентифицира неправилното функциониране на гена HER2 и да предприеме подходящи мерки за реагиране по отношение на предписване на адекватно лечение.

Ако рибният тест не се проведе своевременно за рак на гърдата, тогава дори ако в процеса на лечение се използват определени лекарства, това може да доведе до факта, че туморът ще продължи да се развива агресивно, покривайки всички нови тъкани на гърдата. Това са така наречените последствия от неправилно предписана терапия поради липсата на обективни данни за функционирането на гена HER2.

В процеса на преминаване на анализа на рибата лекарят въвежда в кръвта на пациента специални вещества, съдържащи оцветяващи елементи, които могат да визуализират картината на хромозомните нарушения. Така лекарят може визуално да види и допълнително да проучи генетичните аномалии в генома на жената, довели до развитието на рак на гърдата.

Ако се потвърдят аномалии в работата на гена HER2, тогава се предписва подходящо лечение. Ако не, тогава лекарят, използвайки други тестове, установява друга причина за развитието на рак на гърдата.

Друго важно предимство на рибния анализ е, че след няколко дни пациентът получава изчерпателен доклад за генетичната предразположеност към развитието на конкретен рак. С помощта на това медицинско изследване е възможно едновременно да се диагностицира патологията не само на млечната жлеза, но и на всички коремни органи.

Информативно видео

Точно както по време на Southern blottingнуклеотидните сонди се използват за идентифициране на ДНК фрагменти, цитогенетиците могат да използват подобни сонди за анализ на хромозомни аберации. За да направите това, сонди, белязани с флуоресцентно багрило, се хибридизират с ДНК, съдържаща се във фиксирани хромозоми върху предметни стъкла.

Тази техника се нарича Флуоресцентна in situ хибридизация (РИБА), тъй като , съдържащ се в интерфазния хроматин или в метафазните хромозоми, е фиксиран и денатуриран върху стъклото на едно място (т.е. in situ), за обработка с белязана сонда, която хибридизира с хромозомна ДНК. Сондата флуоресцира, когато хромозомите са осветени със светлина с дължина на вълната, която възбужда флуоресцентното багрило. Позицията на хибридизационния сигнал и по този начин позицията на ДНК сегмента с хибридизираната проба се определя микроскопски.

Обикновено за FISH анализизползвайте сонди - ДНК фрагменти, които имат уникална позиция в хромозомата. Такива проби се подлагат на хибридизация и маркират местоположението на всяка хомоложна хромозома, съответстваща на нормалната позиция на последователността на сондата. FISH сондата може също да бъде сложна смес от ДНК, получена от цяла ръка или дори цяла хромозома. В зависимост от състава на сондата, по време на хибридизация с нея се маркира цялата хромозома или нейната част.

Такива смеси сондиизвестни като хромозомни сонди. И накрая, 24 различни хромозомни проби, маркирани с различни комбинации от флуоресцентни багрила, излъчващи различни дължини на вълната на светлината, могат да бъдат комбинирани за всяка от 24-те човешки хромозоми. Всяка хромозома е маркирана със сонда със собствена характерна комбинация от дължини на светлинните вълни. Всичките 24 хромозомни проби се обединяват и се използват за FISH анализ на метафазни хромозоми. Тази техника е известна като спектрално кариотипиране (SKY).

Тъй като всяка специфична за хромозома сонда има флуоресценциясъс собствена комбинация от дължини на вълните, мутантните хромозоми, състоящи се от части от различни хромозоми, се разграничават добре чрез SKY анализ и хромозомите, включени в пренареждането, могат лесно да бъдат идентифицирани. FISH, използващ единична непрекъсната нуклеотидна последователност, хромозомно-специфични сонди и методът SKY с комбинация от сонди за всички хромозоми се използват широко в клиничната цитогенетика за откриване на хромозомни аберации като делеции, вмъквания и транслокализации.

Флуоресцентна in situ хибридизация

Флуоресцентна хибридизация на място , или метода FISH (англ. Флуоресценция на място хибридизация - РИБИ ) - цитогенетичен метод, който се използва за откриване и определяне на позицията на специфична ДНК последователност върху метафазни хромозоми или в интерфазни ядра на място. В допълнение, FISH се използва за откриване на специфични иРНК в тъканна проба. В последния случай методът FISH дава възможност да се установят пространствено-времеви характеристики на генната експресия в клетките и тъканите.

сонди

С флуоресцентна хибридизация на мястоизползвайте ДНК сонди (ДНК сонди), които се свързват с комплементарни цели в пробата. ДНК сондите съдържат нуклеозиди, белязани с флуорофори (директно маркиране) или конюгати като биотин или дигоксигенин (индиректно маркиране). При директно маркиране, ДНК сондата, свързана с мишената, може да се наблюдава с помощта на флуоресцентен микроскоп веднага след завършване на хибридизацията. В случай на индиректно маркиране е необходима допълнителна процедура на оцветяване, по време на която биотинът се открива с помощта на флуоресцентно белязан авидин или степавидин и дигоксигенин с помощта на флуоресцентно белязани антитела. Въпреки че индиректната версия на маркиране на ДНК проби изисква допълнителни реагенти и време, този метод обикновено постига по-високо ниво на сигнала поради наличието на 3-4 флуорохромни молекули върху антитяло или молекула авидин. Освен това, в случай на индиректно маркиране, е възможно каскадно усилване на сигнала.

За създаване на ДНК проби се използват клонирани ДНК последователности, геномна ДНК, продукти от PCR реакция, белязани олигонуклеотиди и ДНК, получена чрез микродисекция.

Маркирането на сондата може да бъде извършено по различни начини, например чрез ник-транслация или чрез PCR с белязани нуклеотиди.

Процедура на хибридизация

Схема на експеримента за флуоресцентна хибридизация на мястоза локализиране на позицията на гена в ядрото

Първата стъпка е проектирането на сондите. Размерът на сондата трябва да бъде достатъчно голям, за да се осъществи хибридизация на конкретно място, но не прекалено голям (не повече от 1 kb), за да не пречи на процеса на хибридизация. При идентифициране на специфични локуси или при оцветяване на цели хромозоми е необходимо да се блокира хибридизацията на ДНК проби с неуникални повтарящи се ДНК последователности чрез добавяне на небелязани ДНК повторения (например Cot-1 ДНК) към хибридизационната смес. Ако ДНК сондата е двойноверижна ДНК, тя трябва да бъде денатурирана преди хибридизация.

На следващия етап се приготвят препарати от интерфазни ядра или метафазни хромозоми. Клетките се фиксират върху субстрат, обикновено върху предметно стъкло, последвано от денатурация на ДНК. За да се запази морфологията на хромозомите или ядрата, денатурацията се извършва в присъствието на формамид, което позволява да се намали температурата на денатурация до 70 °.

Визуализацията на свързаните ДНК проби се извършва с помощта на флуоресцентен микроскоп. Интензитетът на флуоресцентния сигнал зависи от много фактори - ефективността на маркиране на сондата, вида на сондата и вида на флуоресцентното багрило.

Литература

• Рубцов Н.Б. Методи за работа с хромозоми на бозайници: Proc. надбавка / Новосиб. състояние un-t. Новосибирск, 2006. 152 с.

• Рубцов Н.Б. Хибридизация на нуклеинови киселини на мястопри анализ на хромозомни аномалии. Глава в книгата "Въведение в молекулярната диагностика" Т. 2. "Молекулярно-генетични методи в диагностиката на наследствени и онкологични заболявания" / Изд. М.А. Палцева, Д.В. Залетаев. Учебна литература за студенти от медицински университети. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Бележки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е "флуоресцентна in situ хибридизация" в други речници:

Този термин има и други значения, вижте хибридизация. ДНК хибридизация, хибридизация на нуклеинови киселини in vitro комбинация от комплементарни едноверижни нуклеинови киселини в една молекула. С пълно допълване ... ... Wikipedia