Полимеразна верижна реакция, нейната същност и приложения. PCR: какво е това? Диагностика на инфекциозни заболявания чрез полимеразна верижна реакция Полимеразна верижна реакция PCR

Провеждането на PCR анализ (PCR диагностика) започва с вземането на материал за изследване от гинеколог, уролог или дерматовенеролог. Качеството и надеждността на получените впоследствие резултати се осигуряват от най-високата квалификация и богатия опит на лекарите от медицинския център Euromedprestige, които спазват всички необходими правила за провеждане на PCR анализ: пълна стерилност, използване само на материали за еднократна употреба.

Събраният материал от четката се поставя в съд с физиологичен разтвор. След вземане на проби, пробите трябва да бъдат доставени в PCR лабораторията възможно най-скоро.

PCR анализът в лабораторията се извършва на три етапа:

  1. Изолиране на ДНК
  2. Амплификация на ДНК фрагменти
  3. Откриване на продукти на ДНК амплификация

Извличането на ДНК е началният етап на PCR диагностиката, чиято същност е следната: лекарят взема материала за изследване от пациента и го подлага на специална обработка. По време на обработката двойната спирала на ДНК се разделя на отделни нишки. Към материала на пациента се добавя специална течност, която разтваря органични вещества, които пречат на "чистотата" на реакцията. Това премахва липидите, аминокиселините, пептидите, въглехидратите, протеините и полизахаридите. Резултатът е ДНК или РНК.

Принципът на PCR метода е „изграждане“ на нови ДНК или РНК инфекции. Това не може да стане без отстраняване на клетъчния материал.

Времето, необходимо за извличане на ДНК, зависи от причинителя на инфекцията и от вида на материала, използван за PCR изследване. Например, подготовката на кръвта за следващата стъпка отнема 1,5-2 часа.

0Масив ( => Анализи) Масив ( => 2) Масив ( =>.html) 2

ДНК амплификация

За извършване на следващия етап от ДНК диагностиката - ДНК амплификация - лекарите използват т. нар. ДНК матрици - ДНК молекули на инфекции, върху които впоследствие ще се извърши "клониране" на ДНК. Вече беше споменато, че не е необходимо наличието на пълната ДНК на инфекцията, за този етап е достатъчно малко парче от ДНК молекулата, което е уникално за този микроб (инфекция).

В основата на амплификацията на ДНК и съответно в основата на целия принцип на PCR реакцията е естественият процес на завършване на ДНК за всички живи същества - репликация на ДНК, която се осъществява чрез удвояване на една единствена ДНК верига.

Започвайки с единичен фрагмент от ДНК, лабораторният лекар го копира и увеличава броя на копията във верижна реакция: след първия цикъл вече имате 2 фрагмента, след втория цикъл - 4, след третия - 8, след четвъртия - 16, после 32, 64, 128, 256... С всеки цикъл броят на копията се удвоява и след двадесет цикъла броят отива в милиони, а след тридесет - в милиарди. Цикълът продължава няколко минути и се свежда до определена промяна на температурния режим в много малък химически реактор. Тук, в разтвор в достатъчни количества, има всички необходими компоненти на синтеза, на първо място, нуклеотиди A, G, T и C, а също така бяха извършени фини подготвителни химични операции, така че веднага да се направи точно копие от всеки завършен ДНК сегмент, след това от това копие - отново копие, това е разклонената верижна реакция.

Чрез прикрепване на праймери към ДНК веригата - изкуствено синтезирани "парчета" ДНК (нуклеотидни двойки), подобни на ДНК на микроби (инфекция) - се образуват две къси, състоящи се от две вериги от ДНК участъци, спирали, които са необходими за синтеза на бъдещата ДНК.

Синтезът на нова верига възниква чрез завършване на всяка от двете вериги на ДНК. Процесът на амплификация се осъществява с помощта на специфично място - ДНК полимераза, което даде името на лабораторния метод. Полимеразата действа като катализатор за реакцията и наблюдава последователното прикрепване на нуклеотидни бази към растящата нова ДНК верига.

По този начин амплификацията на ДНК е многократно увеличаване на броя на копията на ДНК, които са специфични, т.е. присъщи само на определен организъм. Не е необходимо да се завършва цялата ДНК верига, за да се види причинителя на инфекцията. Необходима е само зоната, която е характерна за тази бактерия като индивид.

5360 рубли. Цената на цялостна програма с гастроентеролог

25% НАМАЛЕНИЕ НА РЕЦЕПЦИЯТА НА КАРДИОЛОГ

- 25%първичен
Посещение на лекар
уикенд терапевт

5 160 рубли. вместо 5420 рубли. Изследване на мъже за урологични инфекции

АЛЕРГОЛОГИЯ 5 120 рубли. вместо 5590 рубли.

Всички многократно повтарящи се стъпки на усилване се извършват при различни температури. За PCR анализ се използва специално програмируемо оборудване - PCR - термостат или усилвател, който автоматично променя температурите. Амплификацията се извършва по предварително зададена програма, съответстваща на вида на откритата инфекция. В зависимост от програмата и вида на откритата инфекция процесът на автоматизирана PCR отнема от 2 до 3 часа.

Важна роля в PCR диагностиката играе квалификацията на лабораторния асистент, който провежда анализа, от това зависи правилната настройка на PCR оборудването и интерпретацията на резултатите. Лекарите на медицинския център Euromedprestige имат богат опит в провеждането на ДНК диагностика, което гарантира надеждността на резултатите от изследването и гарантира положителен успех при лечението на инфекциозни заболявания. Да преминете PCR тестове и да извършите пълна диагностика и лечение на инфекциозни заболявания в нашия медицински център "Euromedprestige".

По време на откриването на продуктите на амплификация, получената смес от продукти на амплификация се отделя. Към сместа се добавят специални разтвори, които придават на ДНК фрагментите способността да флуоресцират - да отразяват оранжево-червени светещи ивици. Полученото сияние показва наличието на ДНК на вируси, микроби или бактерии в материала, взет от пациента за PCR анализ.

Наскоро беше разработен надежден, високочувствителен и бърз метод за диагностициране на различни човешки инфекциозни заболявания. Този метод се нарича "PCR анализ". Какво е това, каква е неговата същност, какви микроорганизми може да разкрие и как да го приемаме правилно, ще кажем в нашата статия.

История на откритията


Също така PCR методите се използват при диагностицирането на рак.

Предимства на метода

PCR диагностиката има няколко предимства:

  1. Висока чувствителност. Дори при наличието само на няколко молекули ДНК на микроорганизма, PCR анализът определя наличието на инфекция. Методът ще помогне при хронични и латентно протичащи заболявания. Често в такива случаи микроорганизмът е иначе некултивиран.
  2. Всеки материал е подходящ за изследване, например слюнка, кръв, генитални секрети, коса, епителни клетки. Най-често се извършва кръвен тест и урогенитална намазка за PCR.

  3. Не се изисква дългосрочно отглеждане на култури. Автоматизираният диагностичен процес ви позволява да получите резултатите от изследването след 4-5 часа.
  4. Методът е почти 100% надежден. Регистрирани са само отделни случаи на фалшиво-отрицателни резултати.
  5. Възможност за идентифициране на няколко вида патогени от една материална проба. Това не само ускорява процеса на диагностициране на заболяването, но и значително намалява материалните разходи. Често лекарят предписва цялостен PCR анализ. Цената на изследването, състояща се от определянето на шест патогена, е около 1500 рубли.

    6. За да бъдат резултатите надеждни по време на PCR изследването, е необходимо да се премине анализът, следвайки препоръките за предварителна подготовка за диагностика:

    1. Преди да дарите слюнка, трябва да се въздържате от ядене и приемане на лекарства 4 часа преди да вземете материала. Непосредствено преди процедурата изплакнете устата си с преварена вода.
    2. Горните правила трябва да се спазват и при вземане на проба от вътрешната повърхност на бузата. След изплакване се препоръчва да се извърши лек масаж на кожата, за да се подчертае тайната на жлезата.
    3. Урината обикновено се събира у дома. За да направите това, трябва да извършите щателна тоалетна на гениталиите. Съберете 50-60 ml урина в стерилен пластмасов съд. За да се гарантира чистотата на материала, се препоръчва жените да поставят тампон във влагалището, а мъжете да изтеглят кожната гънка доколкото е възможно. Не можете да вземете материала по време на менструалния цикъл.
    4. За да дарите сперма, трябва да се въздържате от полов акт 3 дни преди събирането на материала. Лекарите съветват също така да не се посещава сауна и да се взема гореща вана, да се пие алкохол и пикантна храна. 3 часа преди анализа трябва да се въздържате от уриниране.
    5. При раждане, например, ако се прави PCR тест за хламидия, се препоръчва и на жените, и на мъжете да имат полов покой в ​​продължение на 3 дни. 2 седмици преди анализа не трябва да се приемат антибактериални лекарства. За една седмица трябва да спрете да използвате интимни гелове, мехлеми, вагинални супозитории, душове. 3 часа преди изследването трябва да се въздържате от уриниране. По време на менструация вземането на материал не се извършва, само 3 дни след спиране на изтичането на кръв можете да вземете урогенитална намазка.

    PCR по време на бременност

    Докато чакате бебе, много полово предавани инфекции са изключително опасни за нормалното развитие на плода. Полово предаваните болести могат да провокират вътрематочно забавяне на растежа, спонтанен аборт или преждевременно раждане, вродени малформации на детето. Ето защо е изключително важно да се подложите на PCR изследване в ранна бременност. Необходимо е да се премине анализът при регистрация - до 12 седмици.

    Материалът се взема от цервикалния канал с помощта на специална четка. Процедурата е безболезнена и не представлява опасност за бебето. Обикновено по време на бременност се извършва анализ за хламидия чрез PCR метод, както и за уреаплазмоза, микоплазмоза, цитомегаловирус, херпес, папиломен вирус. Такъв комплекс от изследвания се нарича PCR-6.

    PCR за диагностика на ХИВ

    Поради факта, че методът е много чувствителен към промените в тялото и условията на диагнозата, много фактори могат да повлияят на резултата. Следователно PCR анализът за HIV инфекция не е надежден метод, неговата ефективност е 96-98%. В останалите 2-4% от случаите тестът дава фалшиво положителни резултати.

    Но в някои ситуации не може да се направи без PCR диагностика на ХИВ. Обикновено се дава на хора с фалшиво-отрицателен резултат от ELISA. Такива показатели показват, че човек все още не е развил антитела срещу вируса и те не могат да бъдат открити без многократно увеличаване на броя. Точно това може да се постигне чрез провеждане на кръвен тест по метода PCR.

    Такава диагностика е необходима и за деца от първата година от живота, родени от ХИВ-позитивна майка. Методът е единственият начин за надеждно определяне на състоянието на детето.

    PCR за диагностика на хепатит

    Методът на полимеразна верижна реакция позволява да се открие ДНК на вируса на хепатит А, В, С много преди образуването на антитела срещу инфекцията или появата на симптомите на заболяването. Анализът на PCR за хепатит С е особено ефективен, тъй като в 85% от случаите това заболяване е асимптоматично и без навременно лечение преминава в хроничен стадий.

    Навременното откриване на патогена ще помогне да се избегнат усложнения и дългосрочно лечение.

    Цялостно PCR изследване

    Цялостен PCR анализ: изследване чрез метода на полимерна верижна реакция, което включва едновременно определяне на няколко вида инфекции: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, цитомегаловирус, херпес тип 1 и 2, гонорея, папиломавирус. Цената на такава диагностика варира от 2000 до 3500 рубли. в зависимост от клиниката, използваните материали и оборудване, както и от вида на анализа: качествен или количествен. Какво е необходимо във вашия случай - лекарят ще реши. В някои случаи е достатъчно само да се определи наличието на патогена, в други, например при HIV инфекция, количественият титър играе важна роля. При диагностициране на всички горепосочени патогени, изследването се нарича "PCR-12 анализ".

    Дешифриране на резултатите от анализа

    Дешифрирането на PCR анализа не е трудно. Има само 2 скали на показателя - "положителен резултат" и "отрицателен резултат". Когато се открие патоген, лекарите могат да потвърдят наличието на болестта с 99% сигурност и да започнат лечението на пациента. При количествен метод за определяне на инфекцията в съответната колона ще бъде посочен цифровият показател за откритите бактерии. Само лекар може да определи степента на заболяването и да предпише необходимото лечение.

    В някои случаи, например при определяне на HIV инфекция чрез PCR, с отрицателен резултат, става необходимо да се проведат допълнителни изследвания за потвърждаване на получените показатели.

    Къде да вземем анализа?

    Къде да направите PCR анализ: в държавна клиника или в частна лаборатория? За съжаление в общинските лечебни заведения често оборудването и методиката са остарели. Ето защо е по-добре да се даде предпочитание на частни лаборатории с модерно оборудване и висококвалифициран персонал. Освен това в частна клиника ще получите резултат много по-бързо.

    В Москва много частни лаборатории предлагат PCR анализ за различни инфекции. Например в такива клиники като Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro се извършва PCR анализ. Цената на прегледа е от 200 рубли. за идентифициране на отделен патоген.

    Може да се заключи, че диагностицирането на инфекциозни заболявания чрез PCR в повечето случаи е бърз и надежден начин за откриване на патогена в тялото в ранните стадии на инфекцията. Но все пак в някои случаи си струва да изберете други диагностични методи. Само специалист може да определи необходимостта от такова изследване. Дешифрирането на PCR анализа също изисква професионален подход. Следвайте инструкциите на Вашия лекар и не правете тестове, които не са Ви необходими.


ПРИНЦИП НА МЕТОДА (молекулярно-биологична основа)

Сред голямото разнообразие от хибридизационни методи за ДНК анализ, PCR е най-широко използваният в клиничната лабораторна диагностика.

Принцип на метода полимеразна верижна реакция (PCR)(Полимеразна верижна реакция (PCR)) е разработена от Cary Mullis (Cetus, САЩ) през 1983 г. и в момента се използва широко както за научни изследвания, така и за диагностика в практическото здравеопазване и службата за държавен санитарен и епидемиологичен надзор (генотипиране, диагностика на инфекциозни заболявания).

PCR методът се основава на естествен процес - комплементарно попълване на ДНК матрицата, осъществявано с помощта на ензима ДНК полимераза. Тази реакция се нарича репликация на ДНК.

Естествената репликация на ДНК включва няколко стъпки:

1) денатурация на ДНК(развиване на двойната спирала, разминаване на ДНК вериги);

2) Образуване на къси двуверижни ДНК сегменти(семена, необходими за започване на синтеза на ДНК);

3) Синтез на нова ДНК верига(допълващо завършване на двете нишки)

Този процес може да се използва за получаване на копия къси сегменти от ДНК, специфични за специфични микроорганизми,тези. да извършва целенасочено търсене на такива специфични области, което е целта на генната диагностика за идентифициране на патогени на инфекциозни заболявания.

Откриване на термостабилна ДНК полимераза (Taq полимераза) от термофилни бактерии Thermis aquaticus, чийто оптимум е от порядъка на 70-72°C, направи възможно да се направи процесът на репликация на ДНК цикличен и да се използва за работа in vitro. Създаването на програмируеми термостати (усилватели), които по зададена програма извършват циклични температурни промени, създаде предпоставки за широкото въвеждане на PCR метода в практиката на лабораторната клинична диагностика. При многократно повторение на циклите на синтез се получава експоненциално увеличаване на броя на копията на специфичен ДНК фрагмент, което прави възможно получаването на достатъчен брой ДНК копия от малко количество анализиран материал, който може да съдържа единични клетки от микроорганизми. , за идентифицирането им чрез електрофореза.

Комплементарното завършване на веригата не започва в която и да е точка на ДНК последователността, а само в определени начални блокове - къси двойноверижни участъци. Чрез прикрепването на такива блокове към специфични области на ДНК е възможно да се насочи процесът на синтез на нова верига само в тази област, а не по цялата дължина на ДНК веригата. За създаване на начални блокове в дадени ДНК региони се използват два олигонуклеотидни праймера (20 нуклеотидни двойки), т.нар. грундове.Праймерите са комплементарни на ДНК последователностите на лявата и дясната граница на специфичен фрагмент и са ориентирани по такъв начин, че завършването на нова ДНК верига става само между тях.

По този начин PCR е многократно увеличаване на броя на копията (амплификация) на специфична ДНК област, катализирана от ензима ДНК полимераза.

За усилване са необходими следните компоненти:

Смес от дезоксинуклеотидни трифосфати (dNTPs)(смес от четири dNTP, които са материалът за синтеза на нови комплементарни ДНК вериги)

Ензим Taq полимераза(термостабилна ДНК полимераза, която катализира удължаването на праймерните вериги чрез последователно добавяне на нуклеотидни бази към нарастваща верига от синтезирана ДНК).

буферен разтвор(реакционна среда, съдържаща Mg2+ йони, необходими за поддържане на ензимната активност)
За да се определят специфични региони на генома на РНК-съдържащи вируси, първо се получава ДНК копие от РНК матрица с помощта на реакция на обратна транскрипция (RT), катализирана от ензима обратна транскриптаза (обратна транскриптаза).

За да се получат достатъчен брой копия на желания характерен ДНК фрагмент, амплификацията включва няколко (20-40) цикъла.



Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия

Стъпка 1: Денатуриране на ДНК(развиване на двойна спирала). Тече при 93-95°C за 30-40 секунди.

Етап 2: Прикрепване на праймери (отгряване).Прикрепването на праймера се извършва комплементарно на съответните последователности на противоположни ДНК вериги в границите на специфично място. Всяка двойка праймери има собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Време за отгряване -20-60 сек.

Етап 3: Изграждане на ДНК вериги.Комплементарното завършване на ДНК веригите става от 5'-края до 3'-края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на прикрепване на праймера. Материалът за синтеза на нови ДНК вериги са дезоксирибонуклеотид трифосфати (dNTPs), добавени към разтвора. Процесът на синтез се катализира от ензима термостабилна ДНК полимераза (Taq полимераза) и протича при температура 70-72°C. Време за синтез - 20-40 сек.






Новите ДНК вериги, образувани в първия цикъл на амплификация, служат като шаблони за втория цикъл на амплификация, в който се образува желаният специфичен ДНК фрагмент (ампликон). (виж фиг. 2). В следващите цикли на амплификация ампликоните служат като шаблон за синтеза на нови вериги. По този начин натрупването на ампликони в разтвор става съгласно формулата 2n, където n е броят на циклите на амплификация. Следователно, дори ако само една двуверижна ДНК молекула първоначално присъства в първоначалния разтвор, около 108 ампликонови молекули се натрупват в разтвора след 30-40 цикъла. Това количество е достатъчно за надеждно визуално откриване на този фрагмент чрез електрофореза в агарозен гел. Процесът на усилване се извършва в специален програмируем термостат (усилвател), който по зададена програма автоматично променя температурите според броя на циклите на усилване.

ЕТАПИ НА PCR - АНАЛИЗ


PCR методът, като лабораторен диагностичен инструмент за инфекциозни заболявания, се основава на откриването на малък ДНК фрагмент на патогена (няколкостотин базови двойки), специфичен само за този микроорганизъм, с помощта на полимеразна верижна реакция за натрупване на желания фрагмент.
Техниката за анализ с помощта на метода PCR включва три етапа:

1. Изолиране на ДНК (РНК) от клинична проба


2. Амплификация на специфични ДНК фрагменти
3. Откриване на продукти на амплификация

Изолиране на ДНК (РНК)
На този етап от анализа клиничната проба се подлага на специална обработка, която води до лизиране на клетъчния материал, отстраняване на протеинови и полизахаридни фракции и приготвяне на ДНК или РНК разтвор без
инхибитори и готови за по-нататъшно усилване.
Изборът на техника за екстракция на ДНК (РНК) се определя главно от естеството на обработения клиничен материал.

Амплификация на специфични ДНК фрагменти
На този етап се натрупват къси специфични ДНК фрагменти в количеството, необходимо за тяхното по-нататъшно откриване. Повечето методи за определяне на конкретни фрагменти от генома използват т.нар. „класическа версия на насочен PCR. За да се повиши специфичността и чувствителността на анализа, някои методи използват „вложен“ PCR метод, който използва 2 двойки праймери („външен“ - за 1-ви етап и „вътрешен“ - за 2-ри етап).

Откриване на продукти на амплификация
В повечето техники на този етап сместа от продукти на амплификация, получена на 2-ри етап, се разделя чрез хоризонтална електрофореза в агарозен гел. Преди електрофоретично разделяне, разтвор на етидиев бромид се добавя към амплификационната смес, която образува силни интерстициални връзки с двойноверижни ДНК фрагменти. Тези съединения под действието на UV облъчване могат да флуоресцират, което се записва като оранжево-червени светещи ленти след електрофоретично разделяне на амплификационната смес в агарозен гел.

Като алтернатива на електрофоретичния метод за откриване, който има някои недостатъци: субективизъм при разчитане на резултатите, могат да бъдат предложени ограничения за определяне на ДНК на различни микроорганизми в една реакция. схеми за откриване на хибридизация.В тези схеми полученият от амплификацията ДНК фрагмент се хибридизира (образува 2-верижни комплекси - "хибриди") със специфична олигонуклеотидна проба. Регистрирането на такива комплекси може да се извърши колориметрично или флуориметрично. SPC "Litekh" създаде комплекти за откриване на базата на хибридизация с флуориметрична регистрация на резултатите

ПРЕДИМСТВА НА МЕТОДА PCR като метод за диагностика на инфекциозни заболявания:

- Директно откриване на наличието на патогени

Много традиционни диагностични методи, като ензимно-свързан имуносорбентен анализ, откриват маркерни протеини, които са отпадъчни продукти от инфекциозни агенти, което предоставя само косвени доказателства за наличието на инфекция. Идентифицирането на специфична ДНК област на патогена чрез PCR дава пряка индикация за наличието на инфекциозния агент.



- Висока специфичност
Високата специфичност на PCR метода се дължи на факта, че в тествания материал се открива уникален ДНК фрагмент, характерен само за този патоген. Специфичността се определя от нуклеотидната последователност на праймерите, която изключва
възможността за получаване на фалшиви резултати, за разлика от метода на ензимен имуноанализ, където грешките не са необичайни поради кръстосано реагиращи антигени.

- Висока чувствителност
PCR методът ви позволява да откриете дори единични клетки от бактерии или вируси. PCR диагностиката открива наличието на патогени на инфекциозни заболявания в случаите, когато други методи (имунологични, бактериологични,
микроскопични) е невъзможно. Чувствителността на PCR анализа е 10-1000 клетки на проба (чувствителността на имунологичните и микроскопските тестове е 103-105 клетки).

-Универсалност на процедурата за идентифициране на различни патогени
Материалът за изследване чрез PCR е ДНК на патогена. Методът се основава на откриването на ДНК или РНК фрагмент, който е специфичен за определен организъм. Сходството на химичния състав на всички нуклеинови киселини позволява използването на унифицирани методи за лабораторни изследвания. Това прави възможно диагностицирането на няколко патогена от един биотест. Като материал за изследване могат да се използват различни биологични секрети (слуз, урина, храчки), изстъргвания от епителни клетки, кръв, серум.

- Висока скорост на получаване на резултата от анализа
PCR анализът не изисква изолиране и култивиране на културата на патогена, което отнема много време. Унифициран метод за обработка на биоматериали и откриване на реакционни продукти и автоматизация на процеса на амплификация позволява извършването на пълен анализ за 4-4,5 часа.

Трябва да се отбележи, че PCR методът може да открие патогени не само в клиничния материал, получен от пациента, но и в материала, получен от обекти на околната среда (вода, почва и др.)

ПРИЛОЖЕНИЕ НА МЕТОДА PCR В ПРАКТИЧЕСКОТО ЗДРАВЕОПАЗВАНЕ

Използването на PCR метода за диагностициране на инфекциозни заболявания от бактериална и вирусна природа е от голямо значение за решаването на много проблеми на микробиологията и епидемиологията. Използването на този метод допринася и за развитието на фундаменталните изследвания в областта на хроничните и малко проучени инфекциозни заболявания.

Най-ефективното и икономически оправдано използване на метода при:

урогинекологична практика- за откриване на хламидия, уреаплазмоза, гонорея, херпес, гарднерелоза, микоплазмена инфекция;

в пулмологията- за диференциална диагностика на вирусни и бактериални пневмонии, туберкулоза;

в гастроентерологията- за откриване на хеликобактериоза;

в клиниката по инфекциозни болести- като експресен метод за диагностика на салмонелоза, дифтерия, вирусен хепатит В, С и G;

в хематологията- за откриване на цитомегаловирусна инфекция, онковируси.

В края на статията вж
Полимеразна верижна реакция (PCR, PCR)изобретен през 1983 г. от Кери Мълис (американски учен). Впоследствие той получава Нобелова награда за това изобретение. В момента PCR диагностиката е един от най-точните и чувствителни методи за диагностициране на инфекциозни заболявания.
Полимеразна верижна реакция (PCR)- експериментален метод на молекулярната биология, метод за значително увеличаване на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина (ДНК) в биологичен материал (проба).
Методът PCR се основава на многократно удвояване на определен участък от ДНК с помощта на ензими при изкуствени условия (ин витро). В резултат на това се произвеждат достатъчни количества ДНК за визуално откриване. В този случай се копира само зоната, която отговаря на зададените условия, и то само ако присъства в изследваната проба.
В допълнение към простото увеличаване на броя на ДНК копията (този процес се нарича амплификация), PCR позволява много други манипулации с генетичен материал (въвеждане на мутации, снаждане на ДНК фрагменти) и се използва широко в биологичната и медицинската практика, напр. за диагностициране на заболявания (наследствени, инфекциозни), за установяване на бащинство, за клониране на гени, въвеждане на мутации, изолиране на нови гени.

Специфика и приложение

Провеждане на PCR

За PCR в най-простия случай са необходими следните компоненти:

  • ДНК матрица, съдържаща секцията от ДНК за амплифициране;
  • два праймера, комплементарни на краищата на желания фрагмент;
  • термостабилна ДНК полимераза;
  • дезоксинуклеотидни трифосфати (A, G, C, T);
  • Mg2+ йони, необходими за работата на полимераза;
  • буферен разтвор.

PCR се извършва в усилвател - устройство, което осигурява периодично охлаждане и нагряване на епруветки, обикновено с точност най-малко 0,1 ° C. За да се избегне изпаряването на реакционната смес, в епруветката се добавя масло с висока температура на кипене, като вазелин. Добавянето на специфични ензими може да увеличи добива на PCR реакцията.
Прогрес на реакцията

Обикновено при провеждане на PCR се извършват 20 - 35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа. Двойноверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се позволи на ДНК веригите да се разделят. Този етап се нарича денатурация – разрушават се водородните връзки между двете вериги. Понякога, преди първия цикъл, реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути, за да денатурира напълно шаблона и праймерите.
Когато нишките се разделят, температурата се понижава, за да се позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване. Температурата на отгряване зависи от праймерите и обикновено се избира 4 - 5°C под тяхната точка на топене. Времетраене на сцената - 0,5 - 2 минути.

ДНК полимеразата репликира шаблонната верига, използвайки праймера като праймер. Това е етапът на удължаване. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните полимерази са най-активни при 72°C. Времето на удължаване зависи както от вида на ДНК полимеразата, така и от дължината на фрагмента, който се амплифицира. Обикновено времето за удължаване се приема като една минута за всеки хиляда базови двойки. След края на всички цикли често се извършва допълнителен етап на окончателно удължаване, за да се завършат всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 10-15 минути.
Подготовка на материала за изследване и транспортирането му до лабораторията

За успешен анализ е важно правилно да вземете материала от пациента и да го подготвите правилно. Известно е, че в лабораторната диагностика по-голямата част от грешките (до 70%) се допускат на етапа на подготовка на пробата. За вземане на кръв в лаборатория INVITRO в момента се използват вакуумни системи, които от една страна минимално нараняват пациента, а от друга позволяват материалът да бъде взет така, че да не влиза в контакт или с персонала, или с околната среда. По този начин се избягва контаминация (замърсяване) на материала и се гарантира обективността на PCR анализа.

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина - биологичен полимер, един от двата вида нуклеинови киселини, които осигуряват съхранение, предаване от поколение на поколение и изпълнение на генетичната програма за развитието и функционирането на живите организми. Основната роля на ДНК в клетките е дълготрайното съхранение на информация за структурата на РНК и протеините.


РНК - рибонуклеиновата киселина е биологичен полимер, подобен по своята химична структура на ДНК. Молекулата на РНК е изградена от същите мономерни единици – нуклеотиди като ДНК. В природата РНК обикновено съществува като единична верига. При някои вируси РНК е носител на генетична информация. В клетката той играе важна роля в преноса на информация от ДНК към протеина. РНК се синтезира върху ДНК шаблон. Този процес се нарича транскрипция. В ДНК има участъци, които съдържат информация, отговорна за синтеза на три вида РНК, които се различават по своите функции: информационна или информационна РНК (иРНК), рибозомна (рРНК) и транспортна (тРНК). И трите вида РНК по един или друг начин участват в протеиновия синтез. Информацията за протеиновия синтез обаче се съдържа само в иРНК.


Нуклеотидите са основната повтаряща се единица в молекулите на нуклеинова киселина, продукт на химично съединение от азотна основа, петвъглеродна захар (пентоза) и една или повече фосфатни групи. Нуклеотидите, присъстващи в нуклеиновите киселини, съдържат една фосфатна група. Наименуват се според съдържащата се в тях азотна основа - аденин (А) съдържащ аденин, гуанин (G) - гуанин, цитозин (С) - цитозин, тимин (Т) - тимин, урацил (U) - урацил. ДНК се състои от 4 вида нуклеотиди - A, T, G, C, РНК също има 4 вида - A, U, G, C. Захарта в състава на всички нуклеотиди на ДНК е дезоксирибоза, РНК е рибоза. По време на образуването на нуклеиновите киселини нуклеотидите чрез свързване образуват захарно-фосфатен скелет на молекулата, от едната страна на който има бази.


Праймерът е къса ДНК, използвана за репликиране на шаблонната верига. Всеки от праймерите е комплементарен към една от веригите на двойноверижния шаблон, рамкирайки началото и края на амплифицираната област.


Литература

  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение. пер. от английски. - М .: Мир, 2002. - 589 с., илюстрация. ISBN 5-03-003328-9
  2. Щелкунов С.Н. Генно инженерство - Новосибирск: Сиб. унив. издателство, 2004. - 496 с.; аз ще. ISBN 5-94087-098-8
  3. Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи - М .: Наука, 2005 - В 2 тома - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацията в този раздел не трябва да се използва за самодиагностика или самолечение. В случай на болка или друго обостряне на заболяването само лекуващият лекар трябва да предпише диагностични изследвания. За диагностика и правилно лечение трябва да се свържете с Вашия лекар.

Полимеразна верижна реакция (PCR)- е метод на биохимична технология в молекулярната биология, проведен с цел увеличаване на едно или повече копия на ДНК фрагменти с няколко градуса, което ви позволява да създадете от няколко хиляди до милиони копия на специфична ДНК последователност.


Разработен през 1983 г. от Cary Mullis, PCR методът сега е често срещан и често незаменим метод, използван в медицински и биологични изследователски лаборатории за много различни приложения. Те включват ДНК клониране за секвениране, ДНК базирана филогенеза или функционален анализ на гени; диагностика на наследствени заболявания; идентификация на генетични пръстови отпечатъци (използвани в клоновете на съдебната медицина и при тестване за бащинство), както и откриване и диагностика на инфекциозни заболявания. През 1993 г. Мълис получава Нобелова награда за химия заедно с Майкъл Смит за работата им върху PCR.

Методът се основава на термичен цикъл, състоящ се от повтарящи се цикли на реакции на нагряване и охлаждане за денатуриране и репликиране на ДНК от ензими. Праймерите (къси части от ДНК), съдържащи последователности, които са комплементарни на целевото място заедно с ДНК полимеразата (от която е кръстен методът), са ключови компоненти за стимулиране на селективно и повторно усилване. В PCR процеса самата синтезирана ДНК се използва като матрица за репликация, задействайки верижна реакция, при която шаблонната ДНК се амплифицира експоненциално. PCR може да бъде значително модифициран за извършване на широк спектър от генетични манипулации.

Почти всички PCR приложения използват термостабилна ДНК полимераза като Taq полимераза, ензим, първоначално изолиран от бактерии. Термусaquaticus. Тази ДНК полимераза ензимно сглобява нова верига на ДНК от градивните елементи на ДНК - нуклеотиди, използвайки едноверижна ДНК като матрица и ДНК олигонуклеотиди (наричани още ДНК праймери), които са необходими за започване на ДНК синтеза. По-голямата част от PCR методите използват термичен цикъл, т.е. алтернативно нагряване и охлаждане на PCR пробата през определена поредица от температурни стъпки. Тези стъпки на топлинен цикъл са необходими първо за физическо разделяне на двете вериги на двойната спирала на ДНК при висока температура в процес, наречен денатурация на ДНК. При по-ниска температура всяка верига ще бъде използвана като матрица в синтеза на ДНК от ДНК полимераза, за да се усили селективно целевата ДНК област. Селективност на резултатите от PCR при използване на праймери, които са комплементарни на целевата ДНК област за амплификация при определени условия на термичен цикъл.

Принципи на PCR диагностика

PCR се използва за амплифициране на специфичен участък от ДНК верига (целева ДНК). Повечето PCR методи обикновено амплифицират ДНК фрагменти до ~10 000 базови двойки (kb), въпреки че някои методи позволяват фрагментите да бъдат мащабирани до 40 kb по размер. Реакцията произвежда ограничено количество от крайния амплифициран продукт, който се контролира от наличните реагенти в реакцията и обратната връзка-инхибиране на реакционните продукти.

Основният PCR комплект изисква няколко компонента и реактиви. Те включват:

  • ДНК шаблон, който съдържа целевата ДНК област, която трябва да бъде амплифицирана.
  • два праймера,комплементарни към 3' краищата на всяка от сенс и антисенс вериги на целевата ДНК.
  • Taq полимеразаили друга ДНК полимераза, работеща при оптимална температура от около 70°C.
  • Дезоксинуклеозид трифосфати(dNTPs; трифосфатни групи, съдържащи нуклеотиди), градивните елементи, от които ДНК полимеразата синтезира нова ДНК верига.
  • буферен разтвор, осигуряващи подходящи химични условия за оптимална активност и стабилност на ДНК полимеразата.
  • двувалентни катиони,магнезиеви или манганови йони; Обикновено се използва Mg2+, но Mn2+ може да се използва и за PCR-медиирана ДНК мутагенеза, тъй като по-високите концентрации на Mn2+ увеличават процента на грешки по време на синтеза на ДНК.
  • Едновалентни катионикалиеви йони.

PCR обикновено се провежда в реакционен обем от 10-200 µl в малки реакционни епруветки (обем 0,2-0,5 ml) в термичен цикъл-усилвател. Циклерът загрява и охлажда реакционните тръби, за да постигне температурите, необходими за всеки етап от реакцията. Много съвременни циклери използват ефекта на Пелтие, който позволява нагряване и охлаждане на PCR тръбата просто чрез обръщане на посоката на електрическия ток. Тънкостенните реакционни тръби насърчават благоприятната топлопроводимост, за да осигурят бързо топлинно равновесие. По-старите циклери, които нямат нагрят капак, изискват слой масло върху повърхността на реакционната смес или капка восък във флакон.

Процедурен ред

Обикновено PCR се състои от серия от 20-40 повтарящи се температурни промени, наречени цикли, като всеки цикъл обикновено се състои от 2-3 отделни температурни стъпки, обикновено три. Цикълът често започва и завършва с една стъпка на температурата (т.нар очакване) при висока температура (> 90 ° C) за окончателно разширяване на продукта или кратко съхранение. Използваните температури и продължителността на прилагането им във всеки цикъл зависи от много параметри. Те включват ензима, използван за синтеза на ДНК, концентрацията на двувалентни йони и dNTP в реакцията и точката на топене (Tm) на праймерите.

  • Етап на инициализация:Този етап се състои от нагряване на реакцията до температура от 94-96°C (или 98°C, ако се използват полимерази с висока термостабилност), което се провежда за 1-9 минути. Стъпката е необходима само за ДНК полимерази, които изискват топлинно активиране, така наречената PCR с горещ старт.
  • Етап на денатурация:Това е първото редовно термично циклично събитие и се състои от нагряване на реакцията до 94-98°C за 20-30 секунди. Това причинява разцепване на ДНК матрицата с разрушаване на водородните връзки между комплементарни бази и образуване на едноверижни ДНК молекули.
  • Стъпка на отгряване:Реакционната температура се намалява до 50-65°C за 20-40 секунди, което позволява праймерите да се свържат с едноверижната ДНК матрица. Обикновено температурата на отгряване е около 3-5 градуса по Целзий под Tm на използваните праймери. Стабилни ДНК-ДНК водородни връзки се образуват само когато последователността на праймера съвпада по-близо с матрицата на последователността. Полимеразата се свързва с хибрида праймер-шаблон и инициира синтеза на ДНК.
  • Етап на разширяване / удължаване:Температурата по време на този етап зависи от използваната ДНК полимераза; Taq полимеразата има своята оптимална температура на активност при 75-80°C; температура от 72°C обикновено се използва за този ензим. На този етап ДНК полимеразата синтезира нова ДНК верига, комплементарна на ДНК шаблонната верига, чрез добавяне на dNTP, които са комплементарни на матрицата в посока 5" към 3", свързвайки 5"-фосфатната група на dNTP с 3"- хидроксилна група в края на получената (разширяваща се) ДНК. Времето за разширяване зависи както от използваната ДНК полимераза, така и от дължината на ДНК фрагмента, който трябва да се амплифицира. Обикновено при оптималната си температура ДНК полимеразата полимеризира хиляда бази в минута. При оптимални условия, т.е. при липса на ограничения, дължащи се на ограничаващи субстрати или реагенти, при всяка стъпка на разширяване, количеството на целевата ДНК се удвоява, което води до експоненциална (геометрична) амплификация на ДНК фрагмент.
  • Окончателно разширение:Това е единствената стъпка, понякога изпълнявана при 70-74°C за 5-15 минути след последния PCR цикъл, за да се гарантира, че останалата едноверижна ДНК е напълно удължена.
  • Крайно очакване:Тази стъпка при 4-15 °C за неопределено време може да се използва за поддържане на реакцията кратка. За да се провери дали PCR е синтезирал очаквания ДНК фрагмент (също понякога наричан "ампликер" или "ампликон"), се използва електрофореза в агарозен гел за разделяне на PCR продуктите по размер. Размерът на PCR продуктите се определя чрез сравнение с ДНК стълба (маркер за молекулно тегло), който съдържа ДНК фрагменти с известен размер, направен върху гел заедно с PCR продуктите.

Етапи на полимеразната верижна реакция

PCR процесът може да бъде разделен на три стъпки:

  1. Експоненциално усилване: По време на всеки цикъл количеството продукт се удвоява (приемайки 100% ефективност на реакцията). Реакцията е много чувствителна: необходимо е само малко количество ДНК.
  2. Етап на изравняване: реакцията се забавя, тъй като ДНК полимеразата губи активност и консумацията на реагенти като dNTP и праймери ги кара да станат ограничаващи .
  3. Плато: Продуктът вече не се натрупва поради изчерпване на реагентите и ензимите.

PCR оптимизация

На практика PCR може да се провали по различни причини, по-специално поради неговата чувствителност към замърсяване, което причинява амплификация на ДНК странични продукти. В тази връзка са разработени редица техники и процедури за оптимизиране на PCR условията. Замърсяването с чужда ДНК се обработва от лабораторни протоколи и процедури, които пречистват смеси преди PCR от потенциални ДНК замърсители. Това обикновено включва отделяне на PCR комплектите от зоните за анализ или пречистване на PCR продуктите, използване на пластмасови прибори за еднократна употреба и цялостно почистване на работната повърхност между етапите на реакцията. Техниките за проектиране на праймер играят важна роля за подобряване на изолирането на PCR продукти и за избягване на образуването на странични продукти, а използването на алтернативни буферни компоненти или полимеразни ензими може да помогне за амплифициране на дълги или по друг начин проблемни ДНК региони. Добавянето на реагенти като формамид към буферните системи може да увеличи специфичността и възстановяването на PCR. Компютърна симулация на теоретични резултати от PCR (електронна PCR) може да бъде извършена, за да подпомогне проектирането на праймера.

Приложение на PCR

Селективно изолиране на ДНК

PCR позволява изолирането на ДНК фрагменти от геномна ДНК чрез селективна амплификация на специфична ДНК област. Това приложение на PCR допълва много методи, като създаването на хибридизационни сонди за Southern или Northern blotting и методи за клониране на ДНК, които изискват големи количества ДНК, представляващи специфична област на ДНК. PCR осигурява тези методи с високо съдържание на чиста ДНК, което позволява анализ на ДНК проби, дори и с малко количество изходен материал.

Други приложения на PCR включват ДНК секвениране за идентифициране на неизвестни PCR-амплифицирани последователности, в които един от амплификационните праймери може да се използва в секвенирането на Sanger, изолиране на ДНК последователност за ускоряване на рекомбинантни ДНК технологии, включващи вмъкване на ДНК последователност в плазмид или генетичен материал на друг организъм. Колониите от бактерии (E. coli) могат бързо да бъдат скринирани чрез PCR, за да се коригира дизайнът на векторната ДНК. PCR може да се използва и за генетични пръстови отпечатъци; техника, използвана в съдебната медицина за идентифициране на човек или организъм чрез сравняване на експериментална ДНК с помощта на различни PCR методи.

Някои PCR методи за "пръстов отпечатък" имат висока дискриминационна сила и могат да се използват за определяне на генетични връзки между индивиди, като родител-дете или между братя и сестри, и се използват при тестване за бащинство. Тази техника може да се приложи и за определяне на еволюционните връзки между организмите.

ДНК амплификация и количествено определяне

Тъй като PCR увеличава броя на копията на целевите ДНК региони, PCR може да се използва за анализ на много малки количества от проба. Това често е критично за криминалистични разследвания, при които като доказателство са налични само следи от ДНК. PCR може да се използва и за анализ на древна ДНК, която е на десетки хиляди години. Тези PCR методи са успешно използвани върху животни като 40 000-годишния мамут, както и върху човешка ДНК, в приложения, вариращи от анализ на египетски мумии до идентифициране на руски цар.

Количествените PCR методи оценяват количеството на дадена последователност, присъстваща в проба, метод, често използван за количествено определяне на нивото на генна експресия. PCR в реално време е утвърден инструмент за количествено определяне на ДНК, който измерва натрупването на ДНК на продукта след всеки цикъл на PCR амплификация.

PCR в диагностиката на заболявания

PCR позволява ранна диагностика на злокачествени заболявания като левкемия и лимфом, което в момента е силно развито в изследването на рака и вече се използва рутинно. PCR може да се извърши директно върху геномни ДНК проби за откриване на специфични за транслокация злокачествени клетки с чувствителност, която е най-малко 10 000 пъти по-висока от другите методи.

PCR също така позволява откриването на некултивирани или бавно растящи организми като микобактерии, анаеробни бактерии и вируси от тъканни култури и животински модели. Основата на PCR диагностичните приложения в областта на микробиологията е идентифицирането на инфекциозни агенти и диференцирането на непатогенни щамове от патогенни, дължащи се на специфични гени.

Вирусната ДНК може да бъде открита и чрез PCR. Праймерите трябва да са специфични за целевите ДНК последователности на вируса и PCR може да се използва за диагностични ДНК тестове или секвениране на вирусния геном. Високата чувствителност на PCR дава възможност за откриване на вируси скоро след инфекцията и дори преди началото на заболяването. Това ранно откриване на вируса може да даде на лекарите значителни възможности за лечение. Количеството на вируса („вирусен товар“) при пациент може също да се определи чрез количествен PCR-базиран ДНК анализ.

Вариации на основните методи на полимеразна верижна реакция

  • Алел-специфична PCR: метод за диагностика или клониране, базиран на единични нуклеотидни полиморфизми (SNP) (единични базови разлики в ДНК). Изисква предварително познаване на ДНК последователността, включително разликите между алелите, и използва праймери, чиито 3' краища обхващат SNPs. Строгата PCR амплификация е много по-малко ефективна при наличие на несъответствие между шаблон и праймер, така че успешната амплификация със SNP-специфичен праймерът сигнализира за наличието на специфични SNPs в последователността.
  • PCR сглобяване или полимеразно циклично сглобяване (PCP):изкуствен синтез на дълги ДНК последователности чрез PCR върху набор от дълги олигонуклеотиди с къси припокриващи се сегменти. Олигонуклеотидите се редуват между посоките на сенс и антисенс вериги и припокриващите се сегменти определят реда на PCR фрагментите, като по този начин селективно генерират крайния дълъг ДНК продукт.
  • Асиметричен PCR: преференциално амплифицира една верига на ДНК в двуверижен ДНК шаблон. Използва се при секвениране и хибридизационно сондиране, където се изисква амплификация само на една от двете допълващи се вериги. PCR се провежда както обикновено, но с голям излишък от праймери за веригата, предназначена за амплификация. Поради бавната (аритметична прогресия) амплификация в края на реакцията след използването на ограничаващ праймер, са необходими допълнителни PCR цикли. Най-новата модификация на този процес, известна като "LATE-PCR" (линейност след експоненциална фаза - PCR) използва ограничаващ праймер с по-висока точка на топене (Tm) от излишъка на праймера, за да поддържа ефективността на реакцията, тъй като концентрацията на ограничаващия праймер намалява в средата на реакцията.
  • Dial-out PCR: изключително паралелен метод за получаване на прецизни ДНК молекули за генен синтез. Сложният пул от ДНК молекули се модифицира чрез уникални странични етикети до масивно паралелно секвениране. След това праймерите, насочени към тагове, осигуряват секвенирани молекули чрез PCR.
  • Хеликаза-зависима амплификация:подобно на традиционната PCR, но изисква постоянна температура, отколкото цикъл през денатурация и цикли на отгряване/разширяване. Вместо топлинна денатурация се използва ДНК хеликаза, ензим, който развива ДНК.
  • PCR с горещ старт: Техника, която намалява неспецифичната амплификация по време на първоначалната настройка на стъпките на PCR. Може да се извърши ръчно чрез нагряване на реакционните компоненти до температура на денатуриране (напр. 95 °C) преди добавяне на полимеразата. Разработени са специализирани ензимни системи, които инхибират полимеразната активност при стайна температура, или чрез свързване на антитела, или в присъствието на ковалентно свързани инхибитори, които се дисоциират само след етап на активиране при висока температура. Горещ старт/студен край PCR се постига с нови хибридни полимерази, които са неактивни при температура на околната среда и незабавно се активират при температура на удължаване.
  • Интермикросателитна последователност специфична PCR (ISSR): PCR ДНК метод за пръстови отпечатъци, който увеличава броя на копията на региони между прости повтарящи се последователности, за да се получи уникален пръстов отпечатък от дължината на амплифицирания фрагмент.
  • Обърнат PCRшироко използвани за дефиниране на региони на последователност около геномни вложки. Това включва серия от разцепвания на ДНК и самолигиране, което води до известни последователности в двата края на неизвестната последователност.
  • PCR, медииран от лигиране:Използва малки ДНК линкери, свързани с интересната ДНК и няколко праймера, свързани с ДНК линкерите; използвани за секвениране на ДНК, разходка в генома и отпечатване на ДНК.
  • PCR, специфичен за метилиране(MSP): Разработено от Стивън Бейлин и Джим Херман от Медицинското училище Джон Хопкинс, то се използва за откриване на метилиране на CpG острови в геномна ДНК. ДНК първо се третира с натриев бисулфит, който превръща неметилираните цитозинови бази в урацил, който се разпознава от PCR праймерите като тимин. След това се извършват две PCR върху модифицираната ДНК, като се използват набори от идентични праймери, с изключение на който и да е CpG остров в праймерната последователност. В тези точки един набор от праймери разпознава ДНК с цитозини, за да увеличи броя на копията на метилираната ДНК, а един комплект разпознава ДНК с урацил или тимин, за да усили неметилираната ДНК. MSP с помощта на qPCR може също да се извърши за получаване на количествена, а не качествена информация за метилирането.
  • Минипраймер - PCR:използват се термостабилни полимерази (S-Tbr), които могат да се простират от къси праймери ("smalligos"), с брой 9 или 10 нуклеотида. Тази техника позволява на PCR да се насочи към региони, свързани с по-малки праймери, и се използва за амплифициране на запазени ДНК последователности като 16S (или еукариотния 18S) rRNA ген.
  • Амплификация на сонда, зависима от мултиплексно лигиране (MLPA): позволява амплификация на множество мишени само с една двойка праймери, като по този начин се избягват ограниченията на разделителната способност на мултиплексната PCR.
  • Мултиплексна PCRсе състои от няколко комплекта праймери в една PCR смес, за да се получат ампликони с различни размери, които са специфични за различни ДНК последователности. Чрез фокусиране върху няколко гена едновременно е възможно да се получи допълнителна информация по време на един тест, който иначе би изисквал няколко пъти повече реагенти и повече време за завършване. Температурите на отгряване за всеки набор от праймери трябва да бъдат оптимизирани, за да работят правилно в рамките на една реакция и с размери на ампликони. Това означава, че тяхната дължина на базовата двойка трябва да бъде достатъчно различна, за да образува различни ивици, когато се визуализира чрез гел електрофореза.
  • Вложен PCR: повишава специфичността на ДНК амплификацията, чрез намаляване на фона, дължащ се на неспецифична ДНК амплификация. Два комплекта праймери се използват в две последователни PCRs. При първата реакция една двойка праймери се използва за синтезиране на ДНК продукти, които в допълнение към предназначението все още могат да се състоят от неспецифично амплифицирани ДНК фрагменти. След това продуктите се използват във втора PCR с набор от праймери, чиито места на свързване са изцяло или частично различни от 3' краищата на всеки от праймерите, използвани в първата реакция. Вложената PCR често е по-успешна при специфично амплифициране на дълги ДНК фрагменти от традиционен PCR, но изисква по-подробно познаване на целевите последователности.
  • PCR с припокриващи се разширенияили снаждане с припокриващи се разширения(SOE): Техника на генното инженерство, която се използва за свързване на две или повече части от ДНК, които съдържат допълващи се последователности. Използва се за свързване на части от ДНК, съдържащи гени, които регулират последователности или мутации; техниката позволява създаването на специфични и дълги ДНК конструкции.
  • Количествен PCR (QPCR):използвани за измерване на количеството PCR продукт (обикновено в реално време). Определя количествено първоначалните количества ДНК, кДНК или РНК. qPCR се използва широко за определяне на наличието на ДНК последователност в проба и броя на нейните копия в пробата. Количественият PCR в реално време има много висока степен на точност. QRT-PCR (или QF-PCR) методите използват флуоресцентни багрила като Sybr Green, EvaGreen или съдържащи флуорофор ДНК сонди като TaqMan за измерване на количеството на амплифицирания продукт в реално време. Понякога се нарича RT-PCR (PCR в реално време) или RQ-PCR. QRT-PCR или RTQ-PCR са по-подходящи съкращения, тъй като RT-PCR обикновено се отнася до PCR с обратна транскрипция, често използван заедно с qPCR.
  • PCR с обратна транскрипция (RT-PCR):за увеличаване на броя на копията на ДНК от РНК. Обратната транскриптаза транскрибира РНК в сДНК, която след това се амплифицира чрез PCR. RT-PCR се използва широко в профилирането на експресията за откриване на генна експресия или за определяне на последователността на РНК транскрипт, включително места за начало и спиране на транскрипция. Ако геномната ДНК последователност на ген е известна, RT-PCR може да се използва за картографиране на местоположението на екзони и интрони в гена. 5'-краят на ген (съответстващ на мястото на начало на транскрипция) обикновено се определя чрез RACE-PCR (бързо усилване на сДНК краищата).
  • PCR в твърда фаза: обхваща няколко значения, включително „Полонна амплификация“ (където PCR на колонии се прави върху гел матрица, например), „Мостова PCR“ (праймерите са ковалентно свързани към твърда поддържаща повърхност), традиционна твърдофазова PCR (където „асиметрична PCR" се използва в присъствието на праймери, носещи твърда подложка с последователност, съответстваща на един от водните праймери), и подобрена PCR в твърда фаза (където конвенционалната PCR в твърда фаза може да бъде подобрена чрез използване на висок Tm и вложени праймери в твърда подложка с възможността за прилагане на термична "стъпка" за насърчаване на образуването на грундове с твърда опора).
  • Thermal Asymmetric Interleaved PCR (TAIL-PCR):се използва за изолиране на неизвестна последователност след известна последователност. В известна последователност TAIL-PCR използва вложена двойка праймери с различни температури на отгряване; degenerate праймер се използва за амплифициране в различна посока от неизвестната последователност.
  • Тъчдаун PCR (стъпков PCR): PCR вариант, насочен към намаляване на неспецифичния фон чрез постепенно понижаване на температурата на отгряване с напредването на PCR циклите. Температурата на отгряване при първоначалните цикли обикновено е няколко градуса (3-5°C) над Tm на използваните праймери, докато при по-късните цикли температурата е няколко градуса (3-5°C) под Tm на грундове. По-високите температури дават повече специфичност за свързване на праймера, а по-ниските температури позволяват по-ефективно усилване от специфични продукти, генерирани по време на първоначалните цикли.
  • PAN-AC: Използва изотермични условия за амплификация и може да се прилага към живи клетки.
  • Универсална бърза разходка из генома: за геномна разходка и генетични пръстови отпечатъци, като се използва по-специфичен "двустранен" PCR отколкото традиционните "едностранни" подходи (използвайки само един генно-специфичен праймер и един общ праймер - което може да доведе до изкуствен "шум") поради механизма , включително образуването на ласо структура. Опростени производни на UFW са "Lane RAGE" (вложена PCR с ласо за бързо усилване на краища на геномна ДНК), "5" RACE Lane" и "3" RACE Lane.
  • всиликоPCR(цифрова PCR, виртуална PCR, e-PCR, e-PCR) се отнася до изчислителни инструменти, използвани за изчисляване на резултатите от теоретична полимеразна верижна реакция, като се използва даден набор от праймери (сонди) за амплифициране на ДНК последователности от секвениран геном или транскриптом.

История на PCR

В статия от 1971 г. в Journal of Molecular Biology, Kleppe et al., за първи път описват метод, използващ ензимен анализ за репликиране на къса ДНК матрица с праймери при in vitro условия. Въпреки това, това ранно проявление на основния принцип на PCR не получи много внимание и изобретението на полимеразната верижна реакция през 1983 г. обикновено се приписва на Кери Мълис.

Когато Мълис разработва PCR през 1983 г., той работи в Емеривил, Калифорния за Cetus Corporation, ранна биотехнологична компания. Там той отговаря за синтеза на къси ДНК вериги. Мълис пише, че е замислил PCR, докато шофира по магистралата на Тихоокеанското крайбрежие една нощ в колата си. Той изигра в ума си нов начин за анализиране на промените (мутации) в ДНК, когато осъзна, че вместо това е изобретил метод за увеличаване на броя на копията на всеки участък от ДНК чрез повтарящи се цикли на дублиране, причинени от ДНК полимераза. В Scientific American Мълис обобщава процедурата: „Започвайки с една молекула ДНК генетичен материал, PCR може да генерира 100 милиарда такива молекули за един ден. Тази реакция е лесна за изпълнение. Не изисква повече от епруветка, няколко прости реагента и източник на топлина. Той беше удостоен с Нобелова награда за химия през 1993 г. за изобретението си, седем години по-късно, когато той и колегите му от Cetus приложиха предложението му на практика за първи път. Въпреки това остават някои противоречия относно интелектуалния и практически принос на други учени към работата на Мълис и дали той е единственият изобретател на принципа на PCR.

PCR методът се основава на използването на подходяща ДНК полимераза, способна да издържа на високите температури от >90°C (194°F), необходими за разцепване на двете нишки на ДНК в двойната спирала на ДНК след всеки цикъл на репликация. ДНК полимеразите, първоначално използвани за in vitro експерименти, предизвестени от PCR, не са били в състояние да издържат на толкова високи температури. Следователно ранните процедури за репликация на ДНК са много неефективни и отнемат много време и изискват големи количества ДНК полимераза и непрекъсната обработка по време на процеса.

Откриването през 1976 г. на Taq полимераза, ДНК полимераза, изолирана от термофилна бактерия, Термусaquaticus, който естествено живее в горещи (50 до 80°C (122 до 176°F)) среди като горещи извори, проправи пътя за драматично подобрение на PCR метода. ДНК полимераза, изолирана от T.Aquaticus, е стабилен при високи температури и остава активен дори след денатурация на ДНК, като по този начин елиминира необходимостта от добавяне на нови ДНК полимерази след всеки цикъл. Това направи възможно автоматизирането на процеса на амплификация на ДНК на базата на термичен цикъл.

Патентни войни

Предложеният PCR метод е патентован от Carey Mullis и се приписва на Cetus Corporation, където Mullis е работил, когато е изобретил техниката през 1983 г. Ензимът Taq полимераза също е защитен с патенти. Има няколко шумни съдебни дела, свързани с методологията, включително неуспешно дело, заведено от DuPont. Фармацевтичната компания Hoffmann-La Roche придоби правата върху патентите през 1992 г. и в момента държи тези, които все още са защитени.

Подобна патентна битка за ензима Taq полимераза все още се води в някои юрисдикции по света между Roche и Promega. Правните аргументи надхвърлиха условията на оригиналните патенти за PCR и Taq полимераза, които изтекоха на 28 март 2005 г.

Дял: