GENETIČKI INŽENJERING, skup metoda biohemije i molekularne genetike, uz pomoć kojih se vrši usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. genetski inženjering omogućava prevazilaženje prirodnih međuvrstskih barijera koje onemogućavaju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama, te stvaranje ćelija i organizama s kombinacijama gena koji ne postoje u prirodi, sa određenim naslijeđenim svojstvima. Glavni objekt uticaja genetskog inženjeringa je nosilac genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čiji se molekul obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost uparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog fundamentalne sličnosti strukture molekula DNK u svim vrstama organizama, a stvarna univerzalnost genetskog koda osigurava ekspresiju stranih gena (ispoljavanje njihove funkcionalne aktivnosti). ) u bilo kojoj vrsti ćelije. Tome je doprinijelo i akumuliranje znanja iz oblasti hemije nukleinskih kiselina, identifikacija molekularnih karakteristika organizacije i funkcionisanja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnost podređivanja gena delovanju gena). stranih” regulatornih elemenata), razvoj metoda sekvenciranja DNK, otkriće lančane reakcije polimeraze, koja je omogućila brzu sintetizaciju bilo kojeg dijela DNK. Važni preduvjeti za nastanak genetskog inženjeringa bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijelaz iz jedne bakterijske ćelije u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagima, što je omogućilo formuliranje koncepta. vektora: molekuli nosioci gena. Od velikog značaja u razvoju metodologije genetskog inženjeringa bili su enzimi uključeni u transformaciju nukleinskih kiselina: restrikcijski enzimi (prepoznaju striktno definisane sekvence u molekulima DNK - mjesta - i "presijeku" dvostruki lanac na tim mjestima), DNK ligaze (kovalentno se vežu pojedinačni fragmenti DNK), reverzna transkriptaza (sintetizuje komplementarnu kopiju DNK, ili cDNK, na RNK šablonu) itd. Tek uz njihovo prisustvo, stvaranje veštačkih struktura postalo je tehnički izvodljiv zadatak. Enzimi se koriste za dobijanje pojedinačnih DNK fragmenata (gena) i stvaranje molekularnih hibrida - rekombinantne DNK (recDNA) zasnovane na DNK plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u ćeliju domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju (kloniranje) i formiranje konačnog genskog proizvoda (njegovu ekspresiju) tamo.

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNK. Termin "genetski inženjering" postao je raširen nakon što su P. Berg i njegovi suradnici prvi put dobili rekombinantnu DNK 1972. godine, koja je bila hibrid u kojem su fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njenog virusa (bakteriofaga λ) i DNK virusa majmuna SV40 su spojeni (sl. 1). 1973. S. Cohen i saradnici su koristili plazmid pSC101 i restrikcijski enzim (EcoRI), koji ga razbija na jednom mjestu na način da se na krajevi dvolančane DNK molekule. Zvali su ih "ljepljivi" jer se mogu pariti (nekako da se drže zajedno) jedno s drugim. Kada se takva DNK pomiješa sa stranim DNK fragmentima tretiranim istim restrikcijskim enzimom i koji imaju iste ljepljive krajeve, dobijeni su novi hibridni plazmidi, od kojih svaki sadrži najmanje jedan strani fragment DNK umetnut u EcoRI mjesto plazmida (slika 2). Postalo je očigledno da se u takve plazmide mogu ubaciti fragmenti različitih stranih DNK dobijenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Glavna trenutna strategija za dobijanje recDNK je sljedeća:

1) fragmenti DNK koji pripadaju drugom organizmu koji sadrže određene gene ili vještački dobijene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača se ubacuju u DNK plazmida ili virusa koji se može razmnožavati nezavisno od hromozoma;

2) dobijeni hibridni molekuli se uvode u osjetljive prokariotske ili eukariotske ćelije, gdje se repliciraju (množe, pojačavaju) zajedno sa fragmentima DNK koji su ugrađeni u njih;

3) ćelijski klonovi se biraju u obliku kolonija na posebnim hranljivim podlogama (ili virusi u obliku čistih zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih ćelija ili kultura životinjskog tkiva) koje sadrže željene vrste recDNA molekule i podvrgnuti ih sveobuhvatnoj strukturnoj i funkcionalnoj studiji. Da bi se olakšala selekcija ćelija u kojima je prisutna recDNK, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (selekcija stanica koje sadrže recDNK vrši se prema njihovoj sposobnosti rasta u prisustvu jednog ili drugog antibiotika). RecDNK koje nose željene gene se biraju i uvode u ćelije primaoca. Od ovog trenutka počinje molekularno kloniranje - dobijanje kopija recDNK, a samim tim i kopija ciljnih gena u njegovom sastavu. Samo ako je moguće odvojiti sve transficirane ili inficirane stanice, svaki klon će biti predstavljen zasebnom ćelijskom kolonijom i sadržavati određenu recDNK. U završnoj fazi vrši se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Zasnovan je na činjenici da umetanje u recDNK neke određuje jedinstvena nekretninaćelija koja ga sadrži (na primjer, ekspresioni proizvod umetnutog gena). U eksperimentima sa molekularnim kloniranjem, primjećuju se 2 osnovna principa: nijedna ćelija u kojoj se kloniranje recDNK ne smije primiti više od jednog molekula plazmida ili virusne čestice; potonji mora biti u stanju da se replicira.

Kao vektorski molekuli u genetskom inženjeringu, širok raspon plazmid i virusna DNK. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markera i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restriktaze. Takve zahtjeve, na primjer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruiran od originalnog plazmida koji se pojavljuje u prirodi korištenjem metoda koje se koriste pri radu sa recDNK; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, kao i jedno mjesto prepoznavanja za 19 različitih restriktaza. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresioni vektori, koji uz amplifikaciju osiguravaju ispravnu i efikasnu ekspresiju stranih gena u ćelijama primaocima. U nekim slučajevima, molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNK u genom ćelije ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka genetskog inženjeringa je stvaranje sojeva bakterija ili kvasca, staničnih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgeni organizmi), koji bi osigurali efikasnu ekspresiju gena kloniranih u njima. Visoki nivo proizvodnja proteina se postiže ako se geni kloniraju u višekopijskim vektorima, jer u ovom slučaju, ciljni gen će se nalaziti u ćeliji u u velikom broju. Važno je da sekvenca koja kodira DNK bude pod kontrolom promotora koji je efektivno prepoznat od ćelijske RNK polimeraze i da rezultirajuća mRNA bude relativno stabilna i efikasno translativna. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primatelja ne bi trebao biti podvrgnut brzoj degradaciji unutarćelijskih proteaza. Prilikom stvaranja transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija uvedenih ciljnih gena.

Budući da je genetski kod univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisustvom u njegovom sastavu signala za inicijaciju i završetak transkripcije i translacije, koje ćelija domaćin pravilno prepoznaje. Budući da većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu strukturu egzon-intron, kao rezultat transkripcije takvih gena, formira se prekursor RNK (pre-mRNA) iz kojeg se, tokom naknadnog spajanja, nekodirajuće sekvence - introni se cijepaju i formira se zrela mRNA. Takvi geni se ne mogu eksprimirati u bakterijskim ćelijama kojima nedostaje sistem spajanja. Kako bi se prevladala ova prepreka, kopija DNK (cDNA) se sintetiše na zrelim mRNA molekulima pomoću reverzne transkriptaze, na koju se drugi lanac dovršava pomoću DNK polimeraze. Takvi fragmenti DNK koji odgovaraju kodirajućoj sekvenci gena (više nisu razdvojeni intronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući aminokiselinsku sekvencu ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, dobivši takozvani ekvivalentni gen, i ubaciti ga u odgovarajući ekspresijski vektor. Prilikom kreiranja ekvivalentnog gena, svojstvo degeneracije se obično uzima u obzir genetski kod(20 aminokiselina je kodirano sa 61 kodonom) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u onim stanicama u koje se planira uvesti ovaj gen, budući da se sastav kodona može značajno razlikovati u različitih organizama. Pravilno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u ćeliji primaocu.

Vrijednost genetskog inženjeringa. Genetski inženjering je uvelike proširio eksperimentalne granice molekularne biologije, jer je postalo moguće uvesti stranu DNK u različite vrste ćelija i proučavati njene funkcije. To je omogućilo otkrivanje općih bioloških obrazaca organizacije i izražavanja genetskih informacija u različitim organizmima. Ovaj pristup je otvorio izglede za stvaranje fundamentalno novih mikrobioloških bioloških proizvođača aktivne supstance, kao i životinje i biljke koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mnogi ranije nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uključujući interferone, interleukine, peptidnih hormona, krvni faktori, počeli su se razvijati u velike količine u ćelijama bakterija, kvasca ili sisara i široko se koristi u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju himerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti genetskog inženjeringa su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i Bacilltis subtilis (bacil sijena), pekarski kvasac Saccharomices cerevisiae, različite ćelijske linije sisara. Spektar objekata uticaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju pravci istraživanja stvaranja transgenih biljaka i životinja. Za stvaranje se koriste metode genetskog inženjeringa najnovije generacije cjepiva protiv raznih infektivnih agenasa (prva od njih stvorena je na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein humanog virusa hepatitisa B). Velika pažnja posvećena je razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisara i njihovoj upotrebi za stvaranje živih polivalentnih vakcina za potrebe veterine i medicine, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju. kancerozni tumori i nasljedne bolesti. Razvijena je metoda za direktno unošenje recDNK u ljudske i životinjske organizme, koja usmjerava proizvodnju antigena različitih infektivnih agenasa u njihovim stanicama (DNK vakcinacija). Najnoviji pravac genetski inženjering je stvaranje jestivih vakcina na bazi transgenih biljaka kao što su paradajz, šargarepa, krompir, kukuruz, zelena salata, itd., koje proizvode imunogene proteine ​​infektivnih agenasa.

Strahovi povezani s provođenjem eksperimenata genetskog inženjeringa. Ubrzo nakon prvih uspješnih eksperimenata na dobivanju recDNK, grupa naučnika predvođena P. Bergom predložila je ograničavanje brojnih eksperimenata genetskog inženjeringa. Ovi strahovi su se zasnivali na činjenici da je teško predvidjeti svojstva organizama koji sadrže strane genetske informacije. Mogu dobiti neželjene znakove, poremetiti ekološku ravnotežu, dovesti do pojave i širenja neobičnih bolesti kod ljudi, životinja i biljaka. Osim toga, uočeno je da je ljudska intervencija u genetski aparat živih organizama nemoralna i može izazvati nepoželjne društvene i etičke posljedice. 1975. o ovim problemima se raspravljalo na međunarodnoj konferenciji u Asilomaru (SAD). Učesnici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti s korištenjem metoda genetskog inženjeringa, ali uz obavezno poštivanje određenih pravila i preporuka. Naknadno su ova pravila, uspostavljena u nizu zemalja, značajno relaksirana i svedena na metode uobičajene u mikrobiološkim istraživanjima, stvaranje posebnih zaštitnih uređaja koji sprečavaju širenje bioloških agenasa u okruženje, korištenje sigurnih vektora i stanica primatelja koje se ne razmnožavaju u prirodi.

Često se genetski inženjering shvata samo kao rad sa recDNK, a pojmovi „molekularno kloniranje“, „kloniranje DNK“, „kloniranje gena“ koriste se kao sinonimi za genetski inženjering. Međutim, svi ovi koncepti odražavaju sadržaj samo pojedinačnih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu "genetski inženjering". U Rusiji se izraz "genetski inženjering" široko koristi kao sinonim za genetski inženjering. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je drugačiji: genetski inženjering ima za cilj stvaranje organizama sa novim genetskim programom, dok termin "genetski inženjering" objašnjava kako se to radi - manipulacijom genima.

Lit.: Shchelkunov S. N. Kloniranje gena. Novosib., 1986; on je. genetski inženjering. 2. izd., Novosib., 2004; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Rekombinantna DNK. M., 1986; Kloniranje DNK. Metode. M., 1988; Novo u kloniranju DNK: Metode. M., 1989.

Uz pomoć kojih se provodi usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. Genetski inženjering (GE) omogućava prevazilaženje prirodnih međuvrstnih barijera koje onemogućavaju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama i stvaranje ćelija i organizama s kombinacijama gena kojih u prirodi nema, sa zadatim nasljednim svojstvima.

Glavni objekt uticaja genetskog inženjeringa je nosilac genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čiji se molekul obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost uparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog fundamentalne sličnosti u strukturi molekula DNK u svim vrstama organizama i stvarne univerzalnosti genetike. Kod omogućava ekspresiju stranih gena (ispoljavanje njihove funkcionalne aktivnosti) u bilo kojoj vrsti ćelije. Tome je doprinijelo i akumuliranje znanja iz oblasti hemije, identifikacija molekularnih karakteristika organizacije i funkcioniranja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnost podređivanja gena djelovanju "stranih"). regulatorni elementi), razvoj metoda sekvenciranja DNK, otkriće lančane reakcije polimeraze koja je omogućila brzu sintetizaciju bilo kojeg dijela DNK.

Važni preduslovi za pojavu G. i. bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijelaz iz jedne bakterijske ćelije u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagama, što je omogućilo formuliranje koncepta vektora - molekula nosača gena.

Od velikog značaja u razvoju metodologije G.I. igraju enzime uključene u transformaciju nukleinskih kiselina: restrikcijske enzime (prepoznaju striktno definirane sekvence (mjesta) u molekulama DNK i "presijeku" dvostruki lanac na tim mjestima), DNK ligaze (kovalentno vezuju pojedinačne fragmente DNK), reverznu transkriptazu (sintetizuju na RNA šablonu komplementarnu kopiju DNK, ili cDNK), itd. Samo ako su dostupne, stvaranje umjetnosti. konstrukcije je postao tehnički izvodljiv zadatak. Enzimi se koriste za dobijanje pojedinačnih DNK fragmenata (gena) i stvaranje molekularnih hibrida - rekombinantne DNK (recDNA) zasnovane na DNK plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u ćeliju domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju (kloniranje) i formiranje konačnog genskog proizvoda (njegovu ekspresiju) tamo.

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNK

Termin „G. i." postao široko rasprostranjen nakon što su 1972. P. Berg et al. Po prvi put je dobijena rekombinantna DNK, koja je bila hibrid u kojoj su povezani fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njenog virusa (bakteriofaga λ) i DNK virusa majmuna SV40. Godine 1973. S. Cohen et al. korišteni plazmid pSC101 i restrikcijski enzim ( Eko RI), koji ga razbija na jednom mjestu na način da se na krajevima dvolančane DNK molekule formiraju kratki komplementarni jednolančani "repovi" (obično 4-6 nukleotida). Zvali su ih "ljepljivi" jer se mogu pariti (nekako da se drže zajedno) jedno s drugim. Kada se takva DNK pomiješa s fragmentima strane DNK tretirane istim restrikcijskim enzimom i koji imaju iste ljepljive krajeve, dobijeni su novi hibridni plazmidi, od kojih je svaki sadržavao najmanje jedan fragment strane DNK umetnut u Eko RI mjesto plazmida. Postalo je očigledno da se u takve plazmide mogu ubaciti fragmenti različitih stranih DNK dobijenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Main moderna strategija dobijanje recDNK se svodi na sledeće:

1. u DNK plazmida ili virusa sposobnog za reprodukciju neovisno o hromozomu, ubacuju se fragmenti DNK koji pripadaju drugom organizmu, koji sadrže odre. geni ili umjetno dobivene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača;
2. nastali hibridni molekuli se uvode u osjetljive prokariotske ili eukariotske stanice, gdje se repliciraju (množe, pojačavaju) zajedno sa fragmentima DNK ugrađenim u njih;
3. ćelijski klonovi se biraju u obliku kolonija na posebnim hranjivim podlogama (ili virusi - u obliku čistih zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih stanica ili kultura životinjskog tkiva) koje sadrže željene vrste recDNA molekula i podvrgavaju se njihovom raznovrsna strukturalna i funkcionalna studija.

Da bi se olakšala selekcija ćelija u kojima je prisutna recDNK, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (selekcija stanica koje sadrže recDNK vrši se prema njihovoj sposobnosti rasta u prisustvu jednog ili drugog antibiotika). RecDNK koje nose željene gene se biraju i uvode u ćelije primaoca. Od ovog trenutka počinje molekularno kloniranje – dobijanje kopija recDNK, a time i kopija ciljnih gena u njenom sastavu. Samo ako je moguće odvojiti sve transficirane ili inficirane ćelije, svaki klon će biti predstavljen zasebnom ćelijskom kolonijom i sadržavati određeni broj ćelija. recDNA. U završnoj fazi vrši se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Zasniva se na činjenici da umetanje u recDNK određuje neko jedinstveno svojstvo ćelije koja ga sadrži (npr. produkt ekspresije umetnutog gena). U eksperimentima na molekularnom kloniranju primjećuju se 2 glavna principa:

• nijedna ćelija u kojoj se vrši kloniranje recDNK ne bi trebalo da primi više od jednog molekula plazmida ili virusne čestice;
• potonji mora biti u stanju da se replicira.

Kao vektorski molekuli u G.I. koristi se širok spektar plazmidne i virusne DNK. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markeri i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restrikcije. Ovaj zahtev, na primer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruisan od plazmida koji se pojavljuje u prirodi korišćenjem metoda koje se koriste u radu sa recDNK; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, sadrži jedno mjesto prepoznavanja za 19 različitih restriktaza. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresioni vektori, koji uz amplifikaciju osiguravaju ispravnu i efikasnu ekspresiju stranih gena u ćelijama primaocima. U nekim slučajevima, molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNK u genom ćelije ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka G.I. - stvaranje sojeva bakterija ili kvasca, ćelijskih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgeni organizmi), koji bi osigurali efikasnu ekspresiju gena kloniranih u njima. Visok nivo proizvodnje proteina postiže se ako se geni kloniraju u višekopijskim vektorima, jer u ovom slučaju, ciljni gen će biti prisutan u ćeliji u velikom broju. Važno je da sekvenca koja kodira DNK bude pod kontrolom promotora koji je efektivno prepoznat od ćelijske RNK polimeraze i da rezultirajuća mRNA bude relativno stabilna i efikasno translativna. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primatelja ne bi trebao biti podvrgnut brzoj degradaciji unutarćelijskih proteaza. Prilikom stvaranja transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija uvedenih ciljnih gena.

Jer genetski kod je univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisustvom u njegovom sastavu signala za inicijaciju i završetak transkripcije i translacije, koje pravilno prepoznaje ćelija domaćina. Jer većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu ekson-intron strukturu; kao rezultat transkripcije takvih gena nastaje prekursor RNK (pre-mRNA) iz kojeg se prilikom naknadnog spajanja cijepaju nekodirajuće sekvence, introni, i formira se zrela mRNA. Takvi geni se ne mogu eksprimirati u bakterijskim ćelijama kojima nedostaje sistem spajanja. Kako bi se prevladala ova prepreka, kopija DNK (cDNA) se sintetiše na zrelim mRNA molekulima pomoću reverzne transkriptaze, na koju se drugi lanac dovršava pomoću DNK polimeraze. Takvi fragmenti DNK koji odgovaraju kodirajućoj sekvenci gena (više nisu razdvojeni intronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući sekvencu aminokiselina ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, čime se dobija tzv. ekvivalentnog gena i ubaciti ga u odgovarajući ekspresijski vektor. Prilikom stvaranja ekvivalentnog gena obično se uzima u obzir svojstvo genetske degeneracije. kod (20 aminokiselina je kodirano sa 61 kodonom) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u onim stanicama u koje se planira uvesti ovaj gen, tk. sastav kodona može značajno varirati u različitim organizmima. Pravilno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u ćeliji primaocu.

Značaj genetskog inženjeringa

G.i. značajno proširio eksperimentalne granice, jer je omogućio ulazak u dekomp. tipove stanica stranoj DNK i istražiti njene funkcije. To je omogućilo identifikaciju općih bioloških obrasci organizacije i izražavanja genet. informacije u raznim organizmi. Ovaj pristup je otvorio izglede za stvaranje fundamentalno novih mikrobioloških sistema. proizvođači biološki aktivnih supstanci. kao i životinje i biljke koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mn. ranije nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uklj. interferoni, interleukini, peptidni hormoni, krvni faktori počeli su se proizvoditi u velikim količinama u ćelijama bakterija, kvasca ili sisara, te se široko koriste u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju himerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti G.I. su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i bacil subtilis (štapić sijena), pekarski kvasac Saharomije cerevisiae, diff. ćelijske linije sisara. Spektar objekata uticaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju pravci istraživanja stvaranja transgenih biljaka i životinja. Metode G.I. stvaraju se najnovije generacije vakcina protiv raznih infektivnih agenasa (prva je stvorena na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein humanog virusa hepatitisa B). Velika pažnja posvećena je razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisara i njihovoj upotrebi za stvaranje živih polivalentnih vakcina za potrebe veterine i medicine, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju kancerogenih tumora i nasljednih bolesti. Razvijena je metoda za direktno uvođenje recDNK u ljudsko i životinjsko tijelo, koja usmjerava proizvodnju raspadajućih antigena u njihovim stanicama. infektivni agensi (DNK vakcinacija). Najnoviji pravac G.i. je stvaranje jestivih vakcina na bazi transgenih biljaka kao što su paradajz, šargarepa, krompir, kukuruz, zelena salata, itd., koje proizvode imunogene proteine ​​infektivnih agenasa.

Zabrinutost u vezi s provođenjem eksperimenata genetskog inženjeringa

Ubrzo nakon prvih uspješnih eksperimenata na dobivanju recDNK, grupa naučnika predvođena P. Bergom predložila je ograničavanje brojnih eksperimenata genetskog inženjeringa. Ovi strahovi su se zasnivali na činjenici da svojstva organizama sadrže tuđu genetiku. informacije je teško predvidjeti. Mogu dobiti neželjene znakove, narušiti ekološki. ravnoteže, dovode do pojave i širenja neobičnih bolesti ljudi, životinja, biljaka. Osim toga, uočeno je da je ljudska intervencija u genetskoj aparat živih organizama je nemoralan i može izazvati nepoželjne društvene i etičke posljedice. O ovim problemima se 1975. raspravljalo na međunarodnoj. konferencija u Asilomaru (SAD). Njegovi sudionici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti koristiti G.I. metode. ali uz obavezno poštovanje pravila i preporuke. Naknadno su ova pravila, uspostavljena u nizu zemalja, značajno opuštena i svedena na uobičajene metode u mikrobiologiji. istraživanja, stvaranje specijal zaštitni uređaji koji sprečavaju širenje bioloških. uzročnike u okolišu, korištenje sigurnih vektora i stanica primatelja koje se ne razmnožavaju u prirodi.

Često pod G. i. razumiju samo rad sa recDNK, ali kao sinonime za G.I. koriste se izrazi "molekularno kloniranje", "kloniranje DNK", "kloniranje gena". Međutim, svi ovi koncepti odražavaju sadržaj samo pojedinačnih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu G.I. U Rusiji, kao sinonim za G.i. izraz "genetski inženjering" se široko koristi. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je drugačiji: G.i. ima za cilj stvaranje organizama s novom genetikom. programa, dok termin "genetski inženjering" objašnjava kako se to radi, tj. kroz manipulaciju genima.

Književnost

Shchelkunov S.N. Kloniranje gena. Novosibirsk, 1986; Watson J., Ace J.,Kurtz D. Rekombinantna DNK: Kratki kurs. M., 1986; Kloniranje DNK. Metode M., 1988; Novo u kloniranju DNK: Metode M., 1989. Shchelkunov S.N. genetski inženjering. 2. izdanje, Novosibirsk, 2004.

Genetski inženjering

Iz Wikipedije, slobodne enciklopedije

Genetski inženjering je skup tehnika, metoda i tehnologija za dobijanje rekombinantne RNK i DNK, izolovanje gena iz organizma (ćelija), manipulisanje genima i njihovo uvođenje u druge organizme.

Genetski inženjering nije nauka u najširem smislu, već je oruđe biotehnologije, koristeći istraživanje takvih biološke nauke, i molekularni i ćelijska biologija, citologija, genetika, mikrobiologija, virologija.

1 Ekonomski značaj

2 Istorija razvoja i stanje tehnike

3 Primjena u naučno istraživanje

4 Humani genetski inženjering

5 Napomene

7 Literatura

Ekonomski značaj

Genetski inženjering se koristi za dobijanje željenih kvaliteta modifikovanog ili genetski modifikovanog organizma. Za razliku od tradicionalnog uzgoja, tokom kojeg se genotip mijenja samo indirektno, genetski inženjering vam omogućava da direktno ometate genetski aparat, koristeći tehniku ​​molekularnog kloniranja. Primjeri primjene genetskog inženjeringa su proizvodnja novih genetski modificiranih sorti usjeva, proizvodnja humanog inzulina korištenjem genetski modificiranih bakterija, proizvodnja eritropoetina u ćelijskoj kulturi ili nove rase eksperimentalnih miševa za naučna istraživanja.

Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska ćelija. Ćelije potrebne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim kriterijima, od kojih je najvažniji sposobnost da proizvedu, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeno jedinjenje - aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organsku kiselinu. . Ponekad je potrebno imati mikroorganizam koji može, na primjer, iskoristiti ulje ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine ​​koji su sasvim prikladni za dodatke hrani. Ponekad su vam potrebni organizmi koji se mogu razviti ispod povišene temperature ili u prisustvu supstanci koje su sigurno smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

Zadatak dobijanja ovakvih industrijskih sojeva je veoma važan, za njihovu modifikaciju i selekciju razvijene su brojne metode aktivnog uticaja na ćeliju - od tretmana visoko efikasnim otrovima do radioaktivnog zračenja. Svrha ovih tehnika je ista - postići promjenu nasljednog, genetskog aparata ćelije. Njihov rezultat je proizvodnja brojnih mutantnih mikroba, od kojih na stotine i hiljade naučnici potom pokušavaju odabrati najprikladnije za određenu svrhu. Razvoj tehnika za hemijsku ili radijacijsku mutagenezu bio je izvanredno dostignuće u biologiji i široko se koristi u modernoj biotehnologiji.

Ali njihove mogućnosti su ograničene prirodom samih mikroorganizama. Nisu u stanju da sintetiziraju niz vrijednih tvari koje se akumuliraju u biljkama, prvenstveno ljekovito i eterično ulje. Ne mogu sintetizirati tvari koje su vrlo važne za život životinja i ljudi, brojne enzime, peptidne hormone, imune proteine, interferone i još mnogo jednostavnije uređenih spojeva koji se sintetiziraju u životinjama i ljudima. Naravno, mogućnosti mikroorganizama su daleko od toga da su iscrpljene. Od obilja mikroorganizama, nauka, a posebno industrija, koristi samo mali dio. Za potrebe selekcije mikroorganizama od velikog su interesa, na primjer, anaerobne bakterije koje mogu živjeti u nedostatku kisika, fototrofi koji koriste svjetlosnu energiju poput biljaka, kemoautotrofi, termofilne bakterije koje mogu živjeti na temperaturi, kako se ispostavilo nedavno, od oko 110°C itd.

Pa ipak, ograničenja "prirodnog materijala" su očigledna. Pokušavali su i pokušavaju zaobići ograničenja uz pomoć ćelijskih kultura i tkiva biljaka i životinja. Ovo je vrlo važan i perspektivan način, koji se primjenjuje iu biotehnologiji. Tokom proteklih nekoliko decenija, naučnici su razvili metode pomoću kojih se pojedinačne ćelije biljnog ili životinjskog tkiva mogu učiniti da rastu i razmnožavaju se odvojeno od tela, poput ćelija bakterija. Ovo je bilo važno postignuće - dobivene ćelijske kulture se koriste za eksperimente i za industrijsku proizvodnju određenih tvari koje se ne mogu dobiti bakterijskim kulturama.

[uredi]

Istorija razvoja i dostignuti nivo tehnologije

U drugoj polovini 20. vijeka nekoliko važna otkrića i pronalasci koji su u osnovi genetskog inženjeringa. Višegodišnji pokušaji "čitanja" bioloških informacija koje su "zabilježene" u genima uspješno su završeni. Ovaj rad započeli su engleski naučnik F. Sanger i američki naučnik W. Gilbert (Nobelova nagrada za hemiju 1980.). Kao što znate, geni sadrže informacije-instrukcije za sintezu RNA molekula i proteina u tijelu, uključujući enzime. Da bi se stanica natjerala da sintetizira nove, za nju neobične tvari, potrebno je da se u njoj sintetiziraju odgovarajući skupovi enzima. A za to je potrebno ili namjerno promijeniti gene u njemu, ili u njega uvesti nove, ranije odsutne gene. Promjene gena u živim stanicama su mutacije. Nastaju pod uticajem, na primer, mutagena - hemijskih otrova ili zračenja. Ali takve promjene se ne mogu kontrolirati niti usmjeravati. Stoga su naučnici svoje napore koncentrirali na pokušaje da razviju metode za uvođenje u ćeliju novih, vrlo specifičnih gena koji su potrebni osobi.

Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

1. Dobivanje izolovanog gena.

2. Uvođenje gena u vektor za prijenos u organizam.

3. Transfer vektora sa genom u modifikovani organizam.

4. Transformacija tjelesnih ćelija.

5. Selekcija genetski modifikovanih organizama (GMO) i eliminacija onih koji nisu uspešno modifikovani.

Proces sinteze gena je trenutno vrlo dobro razvijen i čak u velikoj mjeri automatiziran. Postoje posebni uređaji opremljeni kompjuterima, u čijoj se memoriji pohranjuju programi za sintezu različitih nukleotidnih sekvenci. Takav aparat sintetiše DNK segmente dužine do 100-120 azotnih baza (oligonukleotida). Tehnika je postala široko rasprostranjena koja omogućava upotrebu za sintezu DNK, uključujući mutantnu, polimerazu lančana reakcija. Termostabilni enzim, DNK polimeraza, koristi se u njemu za sintezu DNK šablona, ​​koji se koristi kao sjeme za umjetno sintetizirane komade. nukleinska kiselina- oligonukleotidi. Enzim reverzne transkriptaze omogućava, koristeći takve prajmere (prajmere), da se sintetiše DNK na šablonu izvedenom iz RNK ćelija. DNK sintetizirana na ovaj način naziva se komplementarna (RNA) ili cDNK. Izolovani, "hemijski čist" gen se takođe može dobiti iz biblioteke faga. Ovo je naziv preparata bakteriofaga čiji genom sadrži nasumične fragmente genoma ili cDNK, koje fag reprodukuje zajedno sa svom svojom DNK.

Za ubacivanje gena u vektor koriste se restrikcijski enzimi i ligaze, koji su također korisni alati za genetski inženjering. Uz pomoć restrikcijskih enzima, gen i vektor se mogu izrezati na komade. Uz pomoć ligaza, takvi komadi se mogu "zalijepiti", povezati u drugu kombinaciju, konstruirati novi gen ili ga zatvoriti u vektor. Za otkriće restrikta, Werner Arber, Daniel Nathans i Hamilton Smith također su nagrađeni Nobelovom nagradom (1978).

Tehnika uvođenja gena u bakterije razvijena je nakon što je Frederick Griffith otkrio fenomen bakterijske transformacije. Ovaj fenomen se zasniva na primitivnom seksualnom procesu, koji je u bakterijama praćen razmjenom malih fragmenata nehromozomske DNK, plazmida. Plazmidne tehnologije bile su osnova za uvođenje umjetnih gena u bakterijske stanice.

Značajne poteškoće bile su povezane s uvođenjem gotovog gena u nasljedni aparat biljnih i životinjskih stanica. Međutim, u prirodi postoje slučajevi kada je strana DNK (virusa ili bakteriofaga) uključena u genetski aparat ćelije i uz pomoć svojih metaboličkih mehanizama počinje sintetizirati "vlastiti" protein. Naučnici su proučavali karakteristike unošenja stranog DNK i koristili ga kao princip za uvođenje genetskog materijala u ćeliju. Ovaj proces se naziva transfekcija.

Ako jednostanični organizmi ili kulture višećelijskih ćelija dožive modifikaciju, tada počinje kloniranje u ovoj fazi, tj. selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su prošli modifikaciju. Kada je zadatak dobijanje višećelijskih organizama, tada se ćelije sa izmenjenim genotipom koriste za vegetativnu reprodukciju biljaka ili unose u blastociste surogat majke, kada su u pitanju životinje. Kao rezultat toga, rađaju se mladunci s promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se biraju i ukrštaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

Primjena u naučnim istraživanjima

Genetski nokaut. Genetski nokaut se može koristiti za proučavanje funkcije određenog gena. Ovo je naziv za tehniku ​​brisanja jednog ili više gena, što omogućava proučavanje posljedica takve mutacije. Za nokaut se sintetizira isti gen ili njegov fragment, modificira se tako da genski proizvod gubi svoju funkciju. Da bi se dobili nokaut miševi, rezultirajući genetski konstrukt se uvodi u embrionalne matične ćelije i njime zamjenjuje normalni gen, a izmijenjene ćelije se implantiraju u blastociste surogat majke. U voćnoj mušici, Drosophila pokreće mutacije u velikoj populaciji, koja se zatim traži potomstvo sa željenom mutacijom. Biljke i mikroorganizmi se uništavaju na sličan način.

veštačko izražavanje. Logičan dodatak nokautu je vještačko izražavanje, tj. dodavanje gena organizmu koji ranije nije imao. Ova metoda genetskog inženjeringa također se može koristiti za proučavanje funkcije gena. U suštini, proces uvođenja dodatnih gena je isti kao kod nokauta, ali se postojeći geni ne zamjenjuju niti oštećuju.

Označavanje genskih proizvoda. Koristi se kada je zadatak proučiti lokalizaciju genskog proizvoda. Jedna metoda označavanja je zamjena normalnog gena onim spojenim na reporterski element, kao što je gen za zeleni fluorescentni protein (GRF). Ovaj protein, koji fluorescira pod plavim svjetlom, koristi se za vizualizaciju proizvoda genetske modifikacije. Iako je ova tehnika zgodna i korisna, njene nuspojave mogu biti djelomični ili potpuni gubitak funkcije proteina koji se proučava. Sofisticiranija, iako ne tako prikladna, metoda je dodavanje manjih oligopeptida proteinu koji se proučava, koji se može otkriti korištenjem specifičnih antitijela.

Proučavanje mehanizma ekspresije. U takvim eksperimentima zadatak je proučavanje uslova ekspresije gena. Karakteristike ekspresije zavise prvenstveno od malog dela DNK koji se nalazi ispred kodirajućeg regiona, koji se naziva promotor i služi za vezivanje faktora transkripcije. Ova regija se unosi u tijelo, nakon čega se umjesto vlastitog gena ubacuje reporterski gen, na primjer, isti GFP ili enzim koji katalizuje reakciju koja se dobro detektuje. Pored činjenice da funkcioniranje promotora u različitim tkivima u jednom ili drugom trenutku postaje jasno vidljivo, takvi eksperimenti omogućavaju proučavanje strukture promotora uklanjanjem ili dodavanjem fragmenata DNK u njega, kao i umjetno poboljšanje njegove funkcije.

[uredi]

Ljudski genetski inženjering

Kada se primjenjuje na ljudima, genetski inženjering bi se mogao koristiti za liječenje nasljednih bolesti. Međutim, postoji značajna razlika između liječenja samog pacijenta i promjene genoma njegovih potomaka.

Iako u malom obimu, genetski inženjering se već koristi kako bi se ženama s nekim vrstama neplodnosti dala šansa da zatrudne. Za to se koriste jaja. zdrava žena. Dijete kao rezultat nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke. Uz pomoć genetskog inženjeringa moguće je dobiti potomstvo izmijenjenog izgleda, mentalnih i fizičkih sposobnosti, karaktera i ponašanja. U principu se mogu napraviti ozbiljnije promjene, ali na putu do takvih transformacija čovječanstvo treba riješiti mnoge probleme. etička pitanja.

Bilješke

BBC News. news.bbc.co.uk. Pristupljeno 26.04.2008

Književnost

Singer M., Berg P. Geni i genomi. - Moskva, 1998.

Stent G., Kalindar R. Molekularna genetika. - Moskva, 1981.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.

Enciklopedijski YouTube

• 1 / 5

  Genetski inženjering služi za dobijanje željenih kvaliteta modifikovanog ili genetski modifikovanog organizma. Za razliku od tradicionalnog uzgoja, tokom kojeg se genotip mijenja samo indirektno, genetski inženjering vam omogućava da direktno ometate genetski aparat, koristeći tehniku ​​molekularnog kloniranja. Primjeri primjene genetskog inženjeringa su proizvodnja novih genetski modificiranih sorti usjeva, proizvodnja humanog inzulina korištenjem genetski modificiranih bakterija, proizvodnja eritropoetina u ćelijskoj kulturi ili nove rase eksperimentalnih miševa za naučna istraživanja.

  Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska ćelija. Ćelije potrebne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim kriterijima, od kojih je najvažniji sposobnost da proizvedu, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeno jedinjenje – aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organsku kiselinu. . Ponekad je potrebno imati mikroorganizam koji može, na primjer, iskoristiti ulje ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine ​​koji su sasvim prikladni za dodatke hrani. Ponekad su potrebni organizmi koji mogu rasti na povišenim temperaturama ili u prisustvu supstanci koje su nesumnjivo smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

  Zadatak dobijanja ovakvih industrijskih sojeva je veoma važan, za njihovu modifikaciju i selekciju razvijene su brojne metode aktivnog uticaja na ćeliju - od tretmana snažnim otrovima do radioaktivnog zračenja. Svrha ovih tehnika je ista - postići promjenu nasljednog, genetskog aparata ćelije. Njihov rezultat je proizvodnja brojnih mutantnih mikroba, od kojih na stotine i hiljade naučnici potom pokušavaju odabrati najprikladnije za određenu svrhu. Stvaranje tehnika za hemijsku ili radijacijsku mutagenezu bilo je izvanredno dostignuće u biologiji i široko se koristi u modernoj biotehnologiji.

  Ali njihove mogućnosti su ograničene prirodom samih mikroorganizama. Nisu u stanju da sintetiziraju niz vrijednih tvari koje se akumuliraju u biljkama, prvenstveno ljekovito i eterično ulje. Ne mogu sintetizirati tvari koje su vrlo važne za život životinja i ljudi, brojne enzime, peptidne hormone, imune proteine, interferone i još mnogo jednostavnije uređenih spojeva koji se sintetiziraju u životinjama i ljudima. Naravno, mogućnosti mikroorganizama su daleko od toga da su iscrpljene. Od obilja mikroorganizama, nauka, a posebno industrija, koristi samo mali dio. Za potrebe selekcije mikroorganizama od velikog su interesa, na primjer, anaerobne bakterije koje mogu živjeti u nedostatku kisika, fototrofi koji koriste svjetlosnu energiju poput biljaka, kemoautotrofi, termofilne bakterije koje mogu živjeti na temperaturi, kako je nedavno otkriveno. , oko 110°C itd.

  Pa ipak, ograničenja "prirodnog materijala" su očigledna. Pokušavali su i pokušavaju zaobići ograničenja uz pomoć ćelijskih kultura i tkiva biljaka i životinja. Ovo je vrlo važan i perspektivan način, koji se primjenjuje iu biotehnologiji. Tokom proteklih nekoliko decenija, naučnici su razvili metode pomoću kojih se pojedinačne ćelije biljnog ili životinjskog tkiva mogu učiniti da rastu i razmnožavaju se odvojeno od tela, poput ćelija bakterija. Ovo je bilo važno postignuće - dobivene ćelijske kulture se koriste za eksperimente i za industrijsku proizvodnju određenih tvari koje se ne mogu dobiti bakterijskim kulturama.

  Drugi pravac istraživanja je uklanjanje iz DNK gena koji su nepotrebni za kodiranje proteina i funkcioniranje organizama i stvaranje umjetnih organizama na bazi takve DNK sa "krnjim skupom" gena. To omogućava naglo povećanje otpornosti modificiranih organizama na viruse.

  Istorija razvoja i dostignuti nivo tehnologije

  U drugoj polovini 20. veka došlo je do nekoliko važnih otkrića i izuma koji su u osnovi genetski inženjering. Višegodišnji pokušaji "čitanja" bioloških informacija koje su "zabilježene" u genima uspješno su završeni. Ovaj rad započeli su engleski naučnik Frederick Senger i američki naučnik Walter Gilbert (Nobelova nagrada za hemiju 1980.). Kao što znate, geni sadrže informacije-instrukcije za sintezu RNA molekula i proteina u tijelu, uključujući enzime. Da bi se stanica natjerala da sintetizira nove, za nju neobične tvari, potrebno je da se u njoj sintetiziraju odgovarajući skupovi enzima. A za to je potrebno ili namjerno promijeniti gene u njemu, ili u njega uvesti nove, ranije odsutne gene. Promjene gena u živim stanicama su mutacije. Nastaju pod uticajem, na primer, mutagena - hemijskih otrova ili zračenja. Ali takve promjene se ne mogu kontrolirati niti usmjeravati. Stoga su naučnici svoje napore koncentrirali na pokušaje da razviju metode za uvođenje u ćeliju novih, vrlo specifičnih gena koji su potrebni osobi.

  Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

  1. Dobivanje izolovanog gena.
  2. Uvođenje gena u vektor za prijenos u organizam.
  3. Prenos vektora sa genom u modifikovani organizam.
  4. Transformacija tjelesnih ćelija.
  5. Selekcija genetski modifikovanih organizama ( GMO) i eliminisanje onih koji nisu uspješno modificirani.

  Proces sinteze gena je trenutno vrlo dobro razvijen i čak u velikoj mjeri automatiziran. Postoje posebni uređaji opremljeni kompjuterima, u čijoj se memoriji pohranjuju programi za sintezu različitih nukleotidnih sekvenci. Takav aparat sintetiše DNK segmente dužine do 100-120 azotnih baza (oligonukleotida). Tehnika je postala široko rasprostranjena koja omogućava korištenje lančane reakcije polimeraze za sintezu DNK, uključujući mutantnu DNK. U njemu se za sintezu DNK koristi termostabilni enzim DNK polimeraza, koji se koristi kao sjeme za umjetno sintetizirane komade nukleinske kiseline - oligonukleotide. Enzim reverzne transkriptaze omogućava sintetizaciju DNK pomoću takvih prajmera (prajmera) na matriksu RNK izolovane iz ćelija. DNK sintetizirana na ovaj način naziva se komplementarna (RNA) ili cDNK. Izolovani, "hemijski čist" gen se takođe može dobiti iz biblioteke faga. Ovo je naziv preparata bakteriofaga, u čiji genom se ubacuju nasumični fragmenti genoma ili cDNK, koje fag reprodukuje zajedno sa svom svojom DNK.

  Tehnika uvođenja gena u bakterije razvijena je nakon što je Frederick Griffith otkrio fenomen bakterijske transformacije. Ovaj fenomen se zasniva na primitivnom seksualnom procesu, koji je u bakterijama praćen razmjenom malih fragmenata nehromozomske DNK, plazmida. Plazmidne tehnologije bile su osnova za uvođenje umjetnih gena u bakterijske stanice.

  Značajne poteškoće bile su povezane s uvođenjem gotovog gena u nasljedni aparat biljnih i životinjskih stanica. Međutim, u prirodi postoje slučajevi kada je strana DNK (virusa ili bakteriofaga) uključena u genetski aparat ćelije i uz pomoć svojih metaboličkih mehanizama počinje sintetizirati "vlastiti" protein. Naučnici su proučavali karakteristike unošenja stranog DNK i koristili ga kao princip za uvođenje genetskog materijala u ćeliju. Ovaj proces se naziva transfekcija.

  Ako se modificiraju jednoćelijski organizmi ili kulture višećelijskih stanica, tada u ovoj fazi počinje kloniranje, odnosno selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su prošli modifikaciju. Kada je zadatak nabavke višećelijskih organizama, zatim se ćelije sa promijenjenim genotipom koriste za vegetativno razmnožavanje biljaka ili se ubrizgavaju u blastociste surogat majke kada su životinje u pitanju. Kao rezultat, rađaju se mladunci sa promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se biraju i ukrštaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

  Primjena u naučnim istraživanjima

  Iako u malom obimu, genetski inženjering se već koristi kako bi se ženama s nekim vrstama neplodnosti dala šansa da zatrudne. Da biste to učinili, koristite jaja zdrave žene. Dijete kao rezultat nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke.

  Međutim, mogućnost značajnijih promjena u ljudskom genomu suočava se s nizom ozbiljnih etičkih problema. 2016. godine u SAD-u grupa naučnika dobila je odobrenje za klinička ispitivanja metode liječenja raka koristeći vlastitu imune ćelije pacijent koji je podvrgnut genetskoj modifikaciji pomoću CRISPR/Cas9 tehnologije.

  Cell engineering

  Ćelijski inženjering se zasniva na uzgoju biljnih i životinjskih ćelija i tkiva sposobnih za proizvodnju tvari neophodnih ljudima izvan tijela. Ova metoda se koristi za klonsko (aseksualno) razmnožavanje vrijednih biljnih oblika; za dobivanje hibridnih stanica koje kombiniraju svojstva, na primjer, limfocita krvi i tumorskih stanica, što vam omogućava brzo dobivanje antitijela.

  Genetski inženjering u Rusiji

  Napominje se da nakon uvoda državna registracija GMO je značajno povećao aktivnost pojedinih javnih organizacija i pojedinih poslanika Državna Duma pokušava da spreči uvođenje inovativnih biotehnologija u rusku poljoprivredu. Više od 350 ruskih naučnika potpisalo je otvoreno pismo Društva naučnika za podršku razvoju genetskog inženjeringa u Ruska Federacija. U otvorenom pismu se navodi da zabrana GMO-a u Rusiji neće samo naštetiti zdravoj konkurenciji na poljoprivrednom tržištu, već će dovesti do značajnog zaostatka u proizvodnim tehnologijama. prehrambeni proizvodi, sve veća zavisnost od uvoza hrane, i narušiće prestiž Rusije kao države u kojoj se inovativni razvoj [značaj činjenice? ] .

  vidi takođe

  Bilješke

  1. Alexander Panchin Beating God // Popular Mechanics . - 2017. - br. 3. - S. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
  2. In vivo uređivanje genoma koristeći a visoko efikasan TALEN sistem(engleski) . priroda. Pristupljeno 10. januara 2017.
  3. Elementi - vijesti iz nauke: majmuni izliječeni od sljepoće za boje genskom terapijom (neodređeno) (18. septembar 2009.). Pristupljeno 10. januara 2017.

  Genetski (genetski) inženjering

  Genetski (genetski) inženjering- umjetna konstrukcija genetskih struktura i nasljedno modificiranih organizama. Genetski inženjering je dio (primijenjena grana) molekularne genetike povezan s ciljanim stvaranjem novih molekula DNK sposobnih za reprodukciju u ćeliji domaćinu. U ovom slučaju dolazi do umjetne, svrsishodne promjene genotipa organizma (mikroorganizma) i stvaranja novih znakova i svojstava. Genetski inženjering se bavi dešifrovanjem strukture gena, njihovom sintezom i kloniranjem, umetanjem gena izolovanih iz ćelija živih organizama u ćelije biljaka i životinja u cilju promene njihovih genetskih karakteristika.

  Dobro razvijene metode genetskog inženjeringa su transgeneza, mikrobiološka sinteza itd.

  transgeneza prijenos gena s jedne vrste organizma na drugu. Transgeneza se izvodi rezanjem i šivanjem DNK sekcija uz učešće enzima - restrikcijskih enzima i ligaza.

  Faze transgeneze:

  a) izolacija gena (fragmenata DNK) iz bakterijskih, biljnih ili životinjskih stanica pomoću enzima restriktaze;

  b) povezivanje (umrežavanje) gena (fragmenata DNK) sa plazmidom pomoću enzima ligaze;

  c) uvođenje hibridne plazmidne DNK koja sadrži željeni gen u ćeliju domaćina;

  d) kopiranje (kloniranje) ovog gena u ćeliji domaćina i osiguranje njegovog rada prema shemi: "DNK kod - transkripcija - translacija - protein"

  Alati za genetski inženjering su enzimi otkriveni 1974. restriktaze (restrikcijske endonukleaze). Restrikcijski enzimi prepoznaju dijelove (mjesta) DNK, prave rezove u lancima DNK. Na krajevima svakog fragmenta formiraju se jednolančani repovi, zvani " ljepljivi krajevi, jer se mogu, takoreći, držati zajedno zbog komplementarnosti.

  Restrikcijski enzimi prepoznaju u dvolančanoj DNK specifičnu, samo svoju vlastitu sekvencu nukleotida DNK. Restrikcioni enzim se zatim veže za prepoznatljivo mesto nukleotida i preseca ga na mestu vezivanja. Češće, restrikcijski enzimi prepoznaju regione od 4-6 parova baza u molekulu DNK i preseku oba lanca DNK u sredini ovih regiona ili obično sa pomakom. Primjeri restriktaza: restrikcijski enzim EcoRI, koji prepoznaje fragment DNK od šest nukleotida GAATTC (rez između nukleotida G i A oba lanca DNK); restriktaza Hind III prepoznaje AAGTSTT mjesto (mjesto reza između nukleotida A i A oba lanca DNK); restriktaza Bam I prepoznaje GGATCC mjesto (mjesto reza između G i G nukleotida oba lanca DNK); restriktaza Hae III prepoznaje GGCC mjesto (mjesto reza između G i C nukleotida oba lanca DNK); restriktaza Hpa II prepoznaje CGG mjesto (mjesto reza između nukleotida C i C oba lanca DNK).

  Dalje, da bi se konstruisao genetski modifikovan organizam, potrebno je uvesti željeni gen u ćeliju ovog organizma. Unošenje stranih gena u organizam vrši se pomoću plazmidni vektor. Vektor je plazmid – mali kružni molekul DNK koji se ekstrahuje iz citoplazme bakterijske ćelije. Plazmidi- nasljedni faktori locirani izvan hromozoma, koji su ekstrahromozomska DNK.

  Rice. 37.

  ALI– Šema za uvođenje strane DNK u bakterijski plazmid pomoću enzima (restrikciona endonukleaza i ligaza).

  B– Šema prijenosa ljudskog gena odgovornog za sintezu hormona inzulina i formiranje vektorske DNK.

  Osobine plazmida: 1) ima sposobnost autonomne replikacije; 2) sadrži gene koji kodiraju antibiotike; 3) sposobni su da se integrišu u hromozom ćelije primaoca; 4) prepoznaje delove DNK koji mogu da preseku enzime – restrikcijski enzimi; 5) restrikcijski enzim može presjeći plazmid i prevesti ga u linearno stanje. Istraživači koriste ova svojstva plazmida da bi dobili rekombinantna (hibridna) DNK.

  Slijed uvođenja DNK u plazmid (plazmidni vektor) korištenjem restrikcionog enzima(Sl. 37 A):

  1) ograničenje- rezanje molekule DNK restrikcijskim enzimom, formiranje DNK fragmenata i izolaciju željenog gena;

  2) ugradnju izolovanog gena u plazmid, tj. dobijanje rekombinantne (hibridne) DNK uvođenjem fragmenta strane DNK u plazmid;

  3) ligacija- umrežavanje enzima ligaza plazmid (vektor) i strani fragmenti DNK; u isto vrijeme, krajevi vektora i strane DNK (tzv. "ljepljivi krajevi") su komplementarni jedni drugima;

  4) transformacija– uvođenje rekombinantnog plazmida u genom druge ćelije (ćelije primaoca), posebno bakterijske ćelije.

  Treba napomenuti da plazmidi prodiru samo u dio tretiranih bakterija. Transformirane bakterije, zajedno s plazmidima, stiču otpornost na određeni antibiotik, što im omogućava da se odvoje od netransformiranih bakterija koje umiru na mediju koji sadrži antibiotik. Svaka od transformiranih bakterija, smještena na hranjivu podlogu, umnožava se i formira koloniju od mnogo hiljada potomaka - klon.

  5) skrining– odabir među transformisanim bakterijama onih koje sadrže plazmide sa željenim genom.

  Transgene životinje i biljke

  Klonirani geni se mikroinjektiraju u jaja sisara ili biljne protoplaste (nedostaje izolirana stanica ćelijski zid), a zatim se iz njih uzgajaju životinje ili biljke u čijem genomu djeluju strani geni. Biljke i životinje čiji je genom modificiran operacijama genetskog inženjeringa nazivaju se transgeni organizmi (transgene biljke i životinje) jer sadrži strane gene. Primljeni su transgeni miševi, zečevi, svinje, ovce. Geni bakterija, sisara i ljudi rade u njihovom genomu. Dobivene su transgene biljke (kukuruz, biber, paradajz, pšenica, raž, mahunarke, krompir itd.) koje sadrže gene nesrodnih vrsta. Transgene biljke su otporne na herbicide, insekte, nepovoljne vremenske prilike itd. Problem promjene nasljednosti mnogih poljoprivrednih biljaka postepeno se rješava.

  Genetska mapa hromozoma. Genska terapija

  Genetska mapa hromozoma je dijagram međusobnog rasporeda gena koji su u istoj grupi veza. Takve mape se sastavljaju za svaki par homolognih hromozoma. Genetska mapa pokazuje redoslijed gena u hromozomu i udaljenost između njih (postotak križanja između određenih gena). Dakle, stvaranje novih sojeva mikroorganizama sposobnih da sintetiziraju hormone, proteine, lijekovi na osnovu poznavanja genetskih mapa mikroorganizama. Ljudske genetske karte su neophodne za medicinska genetika. Znanja o lokalizaciji gena na određenom hromozomu koriste se u dijagnostici niza nasljednih bolesti, kao i u genskoj terapiji za korekciju strukture i funkcije gena.

  
  
  

  genska terapija - zamjena defektnih gena neoštećenim, odnosno korekcija njihove strukture.

  Za borbu protiv nasljednih, onkoloških i bolesti povezanih sa starenjem razvijaju se metode genske terapije koje su sigurne za ljudske stanice. Korištenjem metoda genske terapije, defektni geni u kojima je došlo do tačkastih mutacija mogu se u tijelu zamijeniti neoštećenim. Danas naučnici razvijaju metode ljudska biološka sigurnost: uvođenje željenih gena u ćelije ljudskog organizma. Time ćete se riješiti mnogih nasljednih bolesti.

  Mikrobiološka sinteza

  Metode genetskog inženjeringa omogućile su izvođenje mikrobiološka sinteza(Sl. 37 B). Uz pomoć metoda genetskog inženjeringa, mikrobiolozi su uspjeli dobiti sojeve bakterija, zahvaljujući kojima se uspješno provodi mikrobiološka sinteza. Za to se odabiru potrebne bakterijske stanice koje ne sadrže plazmide. Molekuli DNK se izoluju sa datim nizom nukleotida koji određuju razvoj željene osobine. U bakterijsku ćeliju se uvodi plazmid sa integrisanim DNK regionom (genomom) u kome počinje da radi umetnuta DNK regija (u toku su procesi replikacije, transkripcije, translacije), a u bakterijskoj ćeliji se sintetiše željeni protein ( interferon, geneferon, imunoglobulin, insulin, somatotropin itd.). U industrijskim količinama dobijaju se hormoni (insulin, somatotropin), mnoge aminokiseline, antibiotici, vakcine itd. Takve bakterije se umnožavaju u industrijskim razmerama i proizvode potrebne proteine.

  Korišćenjem genetske metode dobijen je soj mikroorganizma Pseudomonas denitrificans koji proizvodi deset puta više vitamina C, B vitamina od originalnog oblika; Novi soj bakterije Micrococcus glutamicus luči stotine puta više aminokiseline lizina od originalne (divlje) kulture bakterije koja stvara lizin.

  Cell engineering

  Cell engineering- kultivacija pojedinačnih ćelija ili tkiva na posebnim vještačkim podlogama, razvoj metoda za stvaranje novih tipova ćelija hibridizacijom, zamjenom hromozoma i uzgojem hibrida iz njih.

  1. Metoda kulture tkiva

  Metoda se sastoji u kultivaciji izolovanih ćelija ili komada tkiva na veštačkoj hranljivoj podlozi u odgovarajućim mikroklimatskim uslovima. Kao rezultat uzgoja, biljne stanice ili dijelovi tkiva se regenerišu u cijelu biljku. Mikroklonskim razmnožavanjem pojedinačnih ćelija, ili komada tkiva (obično apikalni meristem stabljike ili korena), možete dobiti mnogo korisne biljke. Mikroklimatski uslovi i mediji kulture za regeneraciju ukrasnih, kultiviranih, ljekovitih biljaka odabiru se eksperimentalno. Kultura tkiva se također koristi za proizvodnju diploidnih biljaka nakon tretmana originalnih haploidnih oblika kolhicinom.

  2. Somatska hibridizacija

  Somatska hibridizacija uključuje dobijanje hibridnih ćelija, a iz njih - novih oblika; umjetna oplodnja jaja.

  Dobivanje novih hibridnih biljaka fuzijom protoplasta (nukleusa i citoplazme) različitih ćelija u kulturi tkiva. Da bi se protoplasti spojili uz pomoć enzima, uništava se stanični zid biljke i dobiva se izolirani protoplast. Prilikom uzgoja takvih protoplasta različite vrste biljaka, vrši se njihovo stapanje i formiranje oblika sa novim korisnim svojstvima. Umjetna oplodnja jajnih stanica provodi se metodom vantjelesne oplodnje (IVF), koja omogućava oplodnju jajnih stanica u epruveti uz naknadnu implantaciju embrija na rana faza razvoj i prevazilaženje nekih oblika neplodnosti kod ljudi.

  3. Hromozomski inženjering- zamjena pojedinačnih hromozoma u biljnim ćelijama ili dodavanjem novih. Diploidi imaju parove homolognih hromozoma, a takvi se organizmi nazivaju disomici. Ako u bilo kojem paru ostane jedan kromosom, tada se formira monosom. Ako se bilo kojem paru doda treći homologni hromozom, tada se formira trizomski itd. Moguće je zamijeniti pojedinačne hromozome jedne vrste hromozomima druge vrste. Primljeno oblici se nazivaju supstituisani.