Dom » Homeopatija » Izvještaj: Genetski inženjering - sadašnjost i budućnost. Što radi genetski inženjering

Izvještaj: Genetski inženjering - sadašnjost i budućnost. Što radi genetski inženjering

GENETIČKO INŽENJERSTVO, skup metoda biokemije i molekularne genetike, uz pomoć kojih se provodi usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. Genetski inženjering omogućuje prevladavanje prirodnih međuvrstskih barijera koje sprječavaju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama te stvaranje stanica i organizama s kombinacijama gena koji ne postoje u prirodi, sa zadanim nasljednim svojstvima. Glavni objekt utjecaja genetskog inženjeringa je nositelj genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čija se molekula obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost sparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog temeljne sličnosti strukture molekula DNA u svim vrstama organizama, a stvarna univerzalnost genetskog koda osigurava ekspresiju stranih gena (njihovu manifestaciju funkcionalna aktivnost) u svim vrstama stanica. Tome je pridonijela i akumulacija znanja u području kemije nukleinskih kiselina, identifikacija molekularnih značajki organizacije i funkcioniranja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnosti podređivanja gena djelovanju “ strani” regulatorni elementi), razvoj metoda sekvenciranja DNA, otkriće lančane reakcije polimeraze, što je omogućilo brzu sintezu bilo kojeg dijela DNA. Važni preduvjeti za nastanak genetskog inženjeringa bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijelaz iz jedne bakterijske stanice u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagima, što je omogućilo formuliranje koncepta vektora: molekule nositelji gena. Veliku važnost u razvoju metodologije genetskog inženjeringa imali su enzimi koji sudjeluju u pretvorbi nukleinskih kiselina: restrikcijski enzimi (prepoznaju strogo definirane sekvence u molekulama DNA – mjesta – i na tim mjestima “presijecaju” dvostruki lanac), DNA ligaze (kovalentno se vežu na nukleinske kiseline). pojedinačni fragmenti DNA), reverzna transkriptaza (sintetizira komplementarnu kopiju DNA, ili cDNA, na RNA predlošku) itd. Tek s njihovom prisutnošću stvaranje umjetnih struktura postalo je tehnički izvediv zadatak. Enzimi se koriste za dobivanje pojedinačnih fragmenata DNA (gena) i stvaranje molekularnih hibrida – rekombinantne DNA (recDNA) na temelju DNA plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u stanicu domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju (kloniranje) i stvaranje konačnog genskog proizvoda (njegova ekspresija) tamo.

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNA. Pojam "genetski inženjering" postao je raširen nakon što su P. Berg i njegovi suradnici 1972. godine prvi dobili rekombinantnu DNK, koja je predstavljala hibrid u kojem su fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njezinog virusa (bakteriofaga λ) i DNK virusa majmuna. SV40 su spojeni (slika 1). Godine 1973. S. Cohen i suradnici upotrijebili su plazmid pSC101 i restrikcijski enzim (EcoRI) koji ga razbija na jednom mjestu na način da nastaju kratki komplementarni jednolančani “repići” (obično 4-6 nukleotida). krajevi dvolančane molekule DNA. Nazvani su "ljepljivi" jer se mogu pariti (nekako se lijepiti) jedni s drugima. Kada je takva DNA pomiješana sa stranim DNA fragmentima tretiranim istim restrikcijskim enzimom i koji imaju iste ljepljive krajeve, dobiveni su novi hibridni plazmidi, od kojih je svaki sadržavao najmanje jedan strani DNA fragment umetnut u EcoRI mjesto plazmida (slika 2). Postalo je očito da se u takve plazmide mogu umetnuti fragmenti različitih stranih DNA dobivenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Glavna trenutna strategija za dobivanje recDNA je sljedeća:

1) fragmenti DNA koji pripadaju drugom organizmu koji sadrže određene gene ili umjetno dobivene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača umeću se u DNA plazmida ili virusa koji se mogu razmnožavati neovisno o kromosomu;

2) nastale hibridne molekule uvode se u osjetljive prokariotske ili eukariotske stanice, gdje se repliciraju (množe, umnožavaju) zajedno s fragmentima DNA ugrađenim u njih;

3) odabrati stanične klonove u obliku kolonija na posebnim hranjivim podlogama (ili viruse u obliku čistih zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih stanica ili kultura životinjskog tkiva) koji sadrže željene vrste molekula recDNA i podvrgnuti ih sveobuhvatnu konstrukcijsku i funkcionalnu studiju. Kako bi se olakšao odabir stanica u kojima je prisutna recDNA, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (selekcija stanica koje sadrže recDNA provodi se prema njihovoj sposobnosti rasta u prisutnosti jednog ili drugog antibiotika). RecDNA koje nose željene gene se odabiru i uvode u stanice primatelja. Od tog trenutka počinje molekularno kloniranje - dobivanje kopija recDNA, a time i kopija ciljnih gena u njenom sastavu. Samo ako je moguće odvojiti sve transficirane ili zaražene stanice, svaki klon će biti predstavljen zasebnom staničnom kolonijom i sadržavat će određenu recDNA. U završnoj fazi provodi se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Temelji se na činjenici da umetanje u recDNA određuje neko jedinstveno svojstvo stanice koja ga sadrži (na primjer, proizvod ekspresije umetnutog gena). U eksperimentima molekularnog kloniranja poštuju se 2 osnovna principa: niti jedna stanica u kojoj se odvija kloniranje recDNA ne smije primiti više od jedne molekule plazmida ili virusne čestice; potonji mora biti u stanju replicirati.

Širok raspon plazmida i virusne DNA koristi se kao vektorske molekule u genetičkom inženjeringu. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markera i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restriktaze. Takve zahtjeve, na primjer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruiran od izvornog prirodnog plazmida korištenjem metoda koje se koriste u radu s recDNA; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, kao i jedno mjesto prepoznavanja za 19 različitih restriktaza. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresijski vektori, koji uz amplificiranje osiguravaju pravilnu i učinkovitu ekspresiju stranih gena u stanicama primateljima. U nekim slučajevima molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNA u genom stanice ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka genetskog inženjeringa je stvaranje sojeva bakterija ili kvasaca, staničnih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgenski organizmi), koji bi osigurali učinkovitu ekspresiju gena kloniranih u ih. Visoka razina proizvodnja proteina postiže se ako su geni klonirani u višekopirne vektore, jer u ovom slučaju će ciljni gen biti prisutan u stanici u velikom broju. Važno je da kodirajuća sekvenca DNA bude pod kontrolom promotora kojeg učinkovito prepoznaje stanična RNA polimeraza, te da rezultirajuća mRNA bude relativno stabilna i učinkovito prevedena. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primateljima ne bi trebao biti podvrgnut brzoj razgradnji unutarstaničnim proteazama. Pri stvaranju transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija unesenih ciljnih gena.

Budući da je genetski kod univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisutnošću u njegovom sastavu signala za početak i završetak transkripcije i translacije, koje stanica domaćin ispravno prepoznaje. Budući da većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu strukturu egzon-intron, kao rezultat transkripcije takvih gena nastaje prekursor glasničke RNA (pre-mRNA) iz koje se, tijekom naknadnog spajanja, stvaraju nekodirajuće sekvence - introni se cijepaju i nastaje zrela mRNA. Takvi se geni ne mogu eksprimirati u bakterijskim stanicama koje nemaju sustav spajanja. Kako bi se prevladala ova prepreka, kopija DNA (cDNA) se sintetizira na zrelim molekulama mRNA pomoću reverzne transkriptaze, na koju se drugi lanac dovršava pomoću DNA polimeraze. Takvi fragmenti DNA koji odgovaraju kodirajućoj sekvenci gena (više nisu odvojeni intronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući aminokiselinsku sekvencu ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, dobivši takozvani ekvivalentni gen, te ga umetnuti u odgovarajući ekspresijski vektor. Pri stvaranju ekvivalentnog gena obično se uzima u obzir svojstvo degeneriranosti genetskog koda (20 aminokiselina kodirano je sa 61 kodonom) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u onim stanicama u koje je taj gen planiran. treba uvesti, budući da se sastav kodona može značajno razlikovati u različitim organizmima. Ispravno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u stanici primatelju.

Vrijednost genetskog inženjeringa. Genetski inženjering uvelike je proširio eksperimentalne granice molekularne biologije, jer je postalo moguće uvesti stranu DNA u različite vrste stanica i proučavati njezine funkcije. To je omogućilo otkrivanje općih bioloških obrazaca organizacije i izražavanja genetskih informacija u različitim organizmima. Ovaj pristup otvorio je izglede za stvaranje potpuno novih mikrobioloških proizvođača bioloških proizvoda djelatne tvari, kao i životinje i biljke koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mnogi ranije nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uključujući interferone, interleukine, peptidni hormoni, faktori krvi, počeli su se proizvoditi u velikim količinama u stanicama bakterija, kvasca ili sisavaca i naširoko se koriste u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju kimerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti genetskog inženjeringa su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i Bacilltis subtilis (bacil sene), pekarski kvasac Saccharomices cerevisiae, razne stanične linije sisavaca. Raspon objekata utjecaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju smjerovi istraživanja stvaranja transgenih biljaka i životinja. Najnovije generacije cjepiva protiv različitih uzročnika infekcija stvaraju se metodama genetskog inženjeringa (prvo od njih je stvoreno na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein ljudskog virusa hepatitisa B). Velika pozornost posvećuje se razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisavaca i njihovoj uporabi za stvaranje živih polivalentnih cjepiva za potrebe veterine i medicine, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju kancerogenih tumora i nasljednih bolesti. Razvijena je metoda izravnog unošenja recDNA u ljudske i životinjske organizme, koja usmjerava proizvodnju antigena različitih uzročnika infekcija u njihovim stanicama (DNA vakcinacija). Najnoviji trend u genetičkom inženjeringu je stvaranje jestivih cjepiva na bazi transgenih biljaka poput rajčice, mrkve, krumpira, kukuruza, salate itd., koje proizvode imunogene proteine uzročnika infekcija.

Strahovi povezani s provođenjem eksperimenata genetskog inženjeringa. Ubrzo nakon prvih uspješnih pokusa dobivanja recDNA, skupina znanstvenika predvođena P. Bergom predložila je ograničenje niza eksperimenata genetskog inženjeringa. Ti su se strahovi temeljili na činjenici da je svojstva organizama koji sadrže strane genetske informacije teško predvidjeti. Mogu poprimiti nepoželjne znakove, narušiti ekološku ravnotežu, dovesti do pojave i širenja neobičnih bolesti kod ljudi, životinja i biljaka. Osim toga, istaknuto je da je ljudska intervencija u genetski aparat živih organizama nemoralna i može izazvati nepoželjne društvene i etičke posljedice. Godine 1975. o tim se problemima raspravljalo na međunarodnoj konferenciji u Asilomaru (SAD). Sudionici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti s primjenom metoda genetskog inženjeringa, ali uz obvezno poštivanje određenih pravila i preporuka. Kasnije su ta pravila, uspostavljena u nizu zemalja, znatno ublažena i reducirana na metode uobičajene u mikrobiološka istraživanja, stvaranje posebnih zaštitnih uređaja koji sprječavaju širenje bioloških agenasa u okoliš, korištenje sigurnih vektora i stanica primatelja koje se ne razmnožavaju u prirodi.

Često se pod genetskim inženjeringom podrazumijeva samo rad s recDNA, a pojmovi "molekularno kloniranje", "kloniranje DNA", "kloniranje gena" koriste se kao sinonimi za genetski inženjering. Međutim, svi ti pojmovi odražavaju sadržaj samo pojedinih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu "genetski inženjering". U Rusiji se izraz "genetski inženjering" široko koristi kao sinonim za genetski inženjering. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je drugačiji: genetski inženjering ima za cilj stvoriti organizme s novim genetskim programom, dok pojam "genetski inženjering" objašnjava kako se to radi - manipuliranjem gena.

Lit.: Shchelkunov S. N. Kloniranje gena. Novosib., 1986.; on je. genetski inženjering. 2. izdanje, Novosib., 2004.; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Rekombinantna DNA. M., 1986.; kloniranje DNK. Metode. M., 1988.; Novo u kloniranju DNA: metode. M., 1989.

Uz pomoć kojih se provodi usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. Genetski inženjering (GE) omogućuje prevladavanje prirodnih međuvrstskih barijera koje onemogućuju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama te stvaranje stanica i organizama s kombinacijama gena koji ne postoje u prirodi, sa zadanim nasljednim svojstvima.

Glavni objekt utjecaja genetskog inženjeringa je nositelj genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čija se molekula obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost sparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog temeljne sličnosti u strukturi molekula DNA u svim vrstama organizama, te stvarne univerzalnosti genetike. Kod omogućuje ekspresiju stranih gena (očitovanje njihove funkcionalne aktivnosti) u bilo kojoj vrsti stanice. Tome je pridonijela i akumulacija znanja iz područja kemije, identifikacija molekularnih značajki organizacije i funkcioniranja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnost podređivanja gena djelovanju "stranih" regulatorni elementi), razvoj metoda sekvenciranja DNK, otkriće lančane reakcije polimeraze koja je omogućila brzu sintezu bilo kojeg dijela DNK.

Važni preduvjeti za pojavu G. i. bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijelaz iz jedne bakterijske stanice u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagima, što je omogućilo formuliranje koncepta vektora - molekula nositelja gena.

Od velike važnosti u razvoju metodologije G.I. odigrali su enzimi koji sudjeluju u pretvorbi nukleinskih kiselina: restrikcijski enzimi (prepoznaju strogo definirane sekvence (mjesta) u molekulama DNA i na tim mjestima "režu" dvostruki lanac), DNA ligaze (kovalentno vežu pojedine fragmente DNA), reverzna transkriptaza (sintetizira na RNA predlošku komplementarna kopija DNA, ili cDNA), itd. Samo ako su dostupni, stvaranje umjetnosti. struktura postala je tehnički izvediv zadatak. Enzimi se koriste za dobivanje pojedinačnih fragmenata DNA (gena) i stvaranje molekularnih hibrida – rekombinantne DNA (recDNA) na temelju DNA plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u stanicu domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju (kloniranje) i stvaranje konačnog genskog proizvoda (njegova ekspresija) tamo.

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNA

Izraz "G. i." postala široko rasprostranjena nakon što je 1972. P. Berg i sur. Po prvi put je dobivena rekombinantna DNA, koja je predstavljala hibrid u kojem su spojeni fragmenti DNA bakterije Escherichia coli, njezin virus (bakteriofag λ) i DNA virusa majmuna SV40. Godine 1973. S. Cohen i sur. korišteni plazmid pSC101 i restrikcijski enzim ( Eko RI), koji ga na jednom mjestu lomi na način da se na krajevima dvolančane molekule DNA formiraju kratki komplementarni jednolančani "repići" (obično 4-6 nukleotida). Nazvani su "ljepljivi" jer se mogu pariti (nekako se držati zajedno) jedni s drugima. Kada je takva DNA pomiješana s fragmentima strane DNA tretirane istim restrikcijskim enzimom i s istim ljepljivim krajevima, dobiveni su novi hibridni plazmidi od kojih je svaki sadržavao najmanje jedan fragment strane DNA umetnut u Eko RI mjesto plazmida. Postalo je očito da se u takve plazmide mogu umetnuti fragmenti različitih stranih DNA dobivenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Glavna trenutna strategija za dobivanje recDNA je sljedeća:

u DNA plazmida ili virusa sposobnog za reprodukciju neovisno o kromosomu umetnuti su fragmenti DNA koji pripadaju drugom organizmu koji sadrže određeni. geni ili umjetno dobivene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača;
rezultirajuće hibridne molekule uvode se u osjetljive prokariotske ili eukariotske stanice, gdje se repliciraju (množe, umnožavaju) zajedno s fragmentima DNA ugrađenim u njih;
stanični klonovi se odabiru u obliku kolonija na posebnim hranjivim podlogama (ili virusi - u obliku kliring zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih stanica ili kultura životinjskog tkiva) koji sadrže željene tipove recDNA molekula i podvrgavaju se njihovoj svestrano strukturalno i funkcionalno proučavanje.

Kako bi se olakšao odabir stanica u kojima je prisutna recDNA, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (selekcija stanica koje sadrže recDNA provodi se prema njihovoj sposobnosti rasta u prisutnosti jednog ili drugog antibiotika). RecDNA koje nose željene gene se odabiru i uvode u stanice primatelja. Od tog trenutka počinje molekularno kloniranje - dobivanje kopija recDNA, a time i kopija ciljnih gena u njezinom sastavu. Samo ako je moguće odvojiti sve transficirane ili zaražene stanice, svaki klon će biti predstavljen zasebnom staničnom kolonijom i sadržavat će određeni broj stanica. recDNA. U završnoj fazi provodi se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Temelji se na činjenici da umetanje u recDNA određuje neko jedinstveno svojstvo stanice koja ga sadrži (npr. proizvod ekspresije umetnutog gena). U eksperimentima molekularnog kloniranja promatraju se 2 glavna principa:

niti jedna stanica u kojoj se odvija kloniranje recDNA ne smije primiti više od jedne molekule plazmida ili virusne čestice;
potonji mora biti u stanju replicirati.

Kao vektorske molekule u G.I. koristi se širok raspon plazmida i virusne DNA. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markere i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restriktaze. Ovaj zahtjev, na primjer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruiran od prirodnog plazmida korištenjem metoda koje se koriste u radu s recDNA; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, sadrži jedno mjesto prepoznavanja za 19 različitih restriktaza. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresijski vektori, koji uz amplificiranje osiguravaju pravilnu i učinkovitu ekspresiju stranih gena u stanicama primateljima. U nekim slučajevima molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNA u genom stanice ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka G.I. - stvaranje sojeva bakterija ili kvasaca, staničnih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgenski organizmi), koji bi osigurali učinkovitu ekspresiju gena koji su u njima klonirani. Visoka razina proizvodnje proteina postiže se ako su geni klonirani u višekopirne vektore, jer u ovom slučaju će ciljni gen biti prisutan u stanici u velikom broju. Važno je da kodirajuća sekvenca DNA bude pod kontrolom promotora kojeg učinkovito prepoznaje stanična RNA polimeraza, te da rezultirajuća mRNA bude relativno stabilna i učinkovito prevedena. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primateljima ne bi trebao biti podvrgnut brzoj razgradnji unutarstaničnim proteazama. Pri stvaranju transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija unesenih ciljnih gena.

Jer genetski kod je univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisutnošću u njegovom sastavu signala za početak i završetak transkripcije i translacije, koje stanica domaćin ispravno prepoznaje. Jer većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu strukturu egzon-intron; kao rezultat transkripcije takvih gena nastaje prekursor glasničke RNA (pre-mRNA), iz koje se nekodirajuće sekvence, introni, cijepaju tijekom naknadnog spajanja, te nastaje zrela mRNA. Takvi se geni ne mogu eksprimirati u bakterijskim stanicama koje nemaju sustav spajanja. Kako bi se prevladala ova prepreka, kopija DNA (cDNA) se sintetizira na zrelim molekulama mRNA pomoću reverzne transkriptaze, na koju se drugi lanac dovršava pomoću DNA polimeraze. Takvi fragmenti DNA koji odgovaraju kodirajućoj sekvenci gena (više nisu odvojeni intronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući aminokiselinsku sekvencu ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, dobivajući tzv. ekvivalentni gen i umetnite ga u odgovarajući vektor ekspresije. Pri stvaranju ekvivalentnog gena obično se uzima u obzir svojstvo genetske degeneracije. kod (20 aminokiselina kodira 61 kodon) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u onim stanicama u koje se ovaj gen planira uvesti, tk. sastav kodona može značajno varirati u različitim organizmima. Ispravno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u stanici primatelju.

Značaj genetskog inženjeringa

G.i. značajno je proširio eksperimentalne granice, jer je omogućio ulazak u razgradnju. tipove stanica stranoj DNA i istražiti njezine funkcije. To je omogućilo prepoznavanje općih bioloških obrasci organizacije i izražavanja genetskih. informacija u raznim organizmi. Ovaj pristup otvorio je izglede za stvaranje temeljno novih mikrobioloških sustava. proizvođači biološki aktivnih tvari. kao i životinje i biljke koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mn. prethodno nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uklj. interferoni, interleukini, peptidni hormoni, faktori krvi počeli su se u velikim količinama proizvoditi u stanicama bakterija, kvasaca ili sisavaca, a naširoko se koriste u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju kimerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti G.I. su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i bacil subtilis (štapić sijena), pekarski kvasac Saharomije cerevisiae, razlika stanične linije sisavaca. Raspon objekata utjecaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju smjerovi istraživanja stvaranja transgenih biljaka i životinja. Metode G.I. stvaraju se najnovije generacije cjepiva protiv različitih uzročnika infekcija (prvo je nastalo na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein ljudskog virusa hepatitisa B). Velika pozornost posvećuje se razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisavaca i njihovoj uporabi za stvaranje živih polivalentnih cjepiva za potrebe veterine i medicine, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju kancerogenih tumora i nasljednih bolesti. Razvijena je metoda za izravno unošenje recDNA u tijelo čovjeka i životinje, koja usmjerava proizvodnju dekomp.antigena u njihovim stanicama. infektivni agensi (DNA cijepljenje). Najnoviji smjer G.i. je stvaranje jestivih cjepiva na bazi transgenih biljaka kao što su rajčica, mrkva, krumpir, kukuruz, zelena salata itd., koje proizvode imunogene proteine uzročnika infekcije.

Brige povezane s provođenjem eksperimenata genetskog inženjeringa

Ubrzo nakon prvih uspješnih pokusa dobivanja recDNA, skupina znanstvenika predvođena P. Bergom predložila je ograničenje niza eksperimenata genetskog inženjeringa. Ti su se strahovi temeljili na činjenici da svojstva organizama sadrže tuđu genetiku. informaciju je teško predvidjeti. Oni mogu dobiti neželjene znakove, narušiti ekološki. ravnoteže, dovesti do pojave i širenja neobičnih bolesti ljudi, životinja, biljaka. Osim toga, primijećeno je da ljudska intervencija u genetskom aparat živih organizama je nemoralan i može izazvati nepoželjne društvene i etičke posljedice. Godine 1975. o tim se problemima raspravljalo na međunar. konferenciji u Asilomaru (SAD). Sudionici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti s korištenjem metoda G.I. ali uz obvezno poštivanje pravila i preporuke. Kasnije su ta pravila, uspostavljena u nizu zemalja, značajno ublažena i reducirana na uobičajene metode u mikrobiologiji. istraživanje, stvaranje posebnih zaštitne naprave koje sprječavaju širenje biološke. sredstava u okolišu, korištenje sigurnih vektora i stanica primatelja koje se ne razmnožavaju u prirodi.

Često pod G. i. razumjeti samo rad s recDNA, ali kao sinonime za G.I. koriste se pojmovi "Molekularno kloniranje", "kloniranje DNA", "kloniranje gena". Međutim, svi ti koncepti odražavaju sadržaj samo pojedinačnih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu G.I. U Rusiji se kao sinonim za G.i. pojam "genetski inženjering" široko se koristi. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je različit: G.i. ima za cilj stvoriti organizme s novom genetikom. program, dok izraz "genetski inženjering" objašnjava kako se to radi, tj. kroz manipulaciju genima.

Književnost

Ščelkunov S.N. Kloniranje gena. Novosibirsk, 1986.; Watson J., Ace J.,Kurtz D. Rekombinantna DNA: Kratki tečaj. M., 1986.; kloniranje DNK. Metode M., 1988; Novo u kloniranju DNA: Metode M., 1989. Ščelkunov S.N. genetski inženjering. 2. izdanje, Novosibirsk, 2004.

Gospodarski značaj

Genetski inženjering služi za dobivanje željenih kvaliteta modificiranog ili genetski modificiranog organizma. Za razliku od tradicionalnog uzgoja, tijekom kojeg se genotip samo neizravno mijenja, genetski inženjering omogućuje izravno uplitanje u genetski aparat, koristeći tehniku molekularnog kloniranja. Primjeri primjene genetskog inženjeringa su proizvodnja novih genetski modificiranih sorti usjeva, proizvodnja humanog inzulina korištenjem genetski modificiranih bakterija, proizvodnja eritropoetina u kulturi stanica ili nove pasmine pokusnih miševa za znanstvena istraživanja.

Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska stanica. Stanice potrebne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim kriterijima, od kojih je najvažniji sposobnost da proizvode, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeni spoj - aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organske kiseline. Ponekad je potrebno imati mikroorganizam koji može, primjerice, iskoristiti naftu ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine sasvim pogodne za dodatke stočnoj hrani. Ponekad su potrebni organizmi koji mogu rasti na povišenim temperaturama ili u prisutnosti tvari koje su nedvojbeno smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

Zadatak dobivanja takvih industrijskih sojeva vrlo je važan, za njihovu modifikaciju i selekciju razvijene su brojne metode aktivnog utjecaja na stanicu - od liječenja jakim otrovima do radioaktivnog zračenja. Svrha ovih tehnika je ista - postići promjenu nasljednog, genetskog aparata stanice. Njihov rezultat je proizvodnja brojnih mutiranih mikroba, od kojih stotine i tisuće znanstvenici zatim pokušavaju odabrati najprikladnije za određenu svrhu. Stvaranje tehnika kemijske ili radijacijske mutageneze bilo je izvanredno postignuće u biologiji i naširoko se koristi u modernoj biotehnologija.

Ali njihove su mogućnosti ograničene prirodom samih mikroorganizama. One nisu u stanju sintetizirati niz vrijednih tvari koje se nakupljaju u biljkama, prije svega ljekovito i eterično ulje. Oni ne mogu sintetizirati tvari koje su vrlo važne za život životinja i ljudi, niz enzima, peptidnih hormona, imunoloških proteina, interferona i još mnogo jednostavno složenih spojeva koji se sintetiziraju u životinjama i ljudima. Naravno, mogućnosti mikroorganizama nisu ni izdaleka iscrpljene. Od obilja mikroorganizama znanost, a posebno industrija, koristi samo mali dio. Za potrebe selekcije mikroorganizama od velikog su interesa, primjerice, anaerobne bakterije koje mogu živjeti bez kisika, fototrofi koji koriste svjetlosnu energiju poput biljaka, kemoautotrofi, termofilne bakterije koje mogu živjeti na temperaturi, kako je nedavno otkriveno. , od oko 110 °C, itd.

Pa ipak, ograničenja "prirodnog materijala" su očita. Pokušali su i pokušavaju zaobići ograničenja uz pomoć staničnih kultura i tkiva biljaka i životinja. Ovo je vrlo važan i perspektivan način, koji se također provodi u biotehnologija. Tijekom posljednjih nekoliko desetljeća znanstvenici su razvili metode kojima se pojedinačne stanice biljnog ili životinjskog tkiva mogu natjerati da rastu i razmnožavaju se odvojeno od tijela, poput bakterijskih stanica. To je bilo važno postignuće - dobivene stanične kulture koriste se za pokuse i za industrijsku proizvodnju određenih tvari koje se ne mogu dobiti korištenjem bakterijskih kultura.

Povijest razvoja i dostignuta razina tehnologije

U drugoj polovici 20. stoljeća došlo je do nekoliko važnih otkrića i izuma koji su u osnovi genetski inženjering. Višegodišnji pokušaji "čitanja" bioloških informacija koje su "zabilježene" u genima uspješno su okončani. Taj su rad započeli engleski znanstvenik F. Sanger i američki znanstvenik W. Gilbert (Nobelova nagrada za kemiju). Kao što znate, geni sadrže informacije-upute za sintezu RNA molekula i proteina u tijelu, uključujući i enzime. Da bi se stanica natjerala da sintetizira nove, za nju neobične tvari, potrebno je da se u njoj sintetiziraju odgovarajući skupovi enzima. A za to je potrebno ili namjerno promijeniti gene u njemu, ili u njega unijeti nove, prethodno odsutne gene. Promjene gena u živim stanicama su mutacije. Nastaju pod utjecajem npr. mutagena – kemijskih otrova ili zračenja. Ali takve se promjene ne mogu kontrolirati niti usmjeravati. Stoga su znanstvenici usredotočili svoje napore na pokušaje razvoja metoda za uvođenje u stanicu novih, vrlo specifičnih gena koji su potrebni čovjeku.

Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

1. Dobivanje izoliranog gena. 2. Uvođenje gena u vektor za prijenos u organizam. 3. Prijenos vektora s genom u modificirani organizam. 4. Transformacija tjelesnih stanica. 5. Selekcija genetski modificiranih organizama ( GMO) i eliminiranje onih koji nisu uspješno modificirani.

Proces sinteze gena trenutno je vrlo dobro razvijen i čak u velikoj mjeri automatiziran. Postoje posebni uređaji opremljeni računalima, u čijoj su memoriji pohranjeni programi za sintezu različitih sekvenci nukleotida. Takav uređaj sintetizira segmente DNA duljine do 100-120 dušičnih baza (oligonukleotidi). Rasprostranjena je tehnika koja omogućuje upotrebu lančane reakcije polimeraze za sintezu DNK, uključujući mutantnu DNK. U njemu se koristi termostabilni enzim DNA polimeraza za sintezu DNA predloška koji se koristi kao klica za umjetno sintetizirane komadiće nukleinske kiseline - oligonukleotide. Enzim reverzne transkriptaze omogućuje, pomoću takvih početnica (primera), sintetizirati DNA na matrici RNA izolirane iz stanica. Ovako sintetizirana DNA naziva se komplementarna (RNA) ili cDNA. Izolirani, "kemijski čisti" gen također se može dobiti iz biblioteke faga. Ovo je naziv pripravka bakteriofaga, u čiji su genom umetnuti nasumični fragmenti iz genoma ili cDNA, koje fag reproducira zajedno sa svom svojom DNA.

Tehnika uvođenja gena u bakterije razvijena je nakon što je Frederick Griffith otkrio fenomen bakterijske transformacije. Taj se fenomen temelji na primitivnom spolnom procesu, koji je kod bakterija popraćen izmjenom malih fragmenata nekromosomske DNA, plazmida. Plazmidne tehnologije bile su osnova za uvođenje umjetnih gena u bakterijske stanice.

Značajne poteškoće bile su povezane s uvođenjem gotovog gena u nasljedni aparat biljnih i životinjskih stanica. Međutim, u prirodi postoje slučajevi kada se strana DNA (virusa ili bakteriofaga) uključi u genetski aparat stanice i uz pomoć svojih metaboličkih mehanizama počinje sintetizirati “vlastiti” protein. Znanstvenici su proučavali značajke uvođenja strane DNK i upotrijebili ga kao princip za uvođenje genetskog materijala u stanicu. Taj se proces naziva transfekcija.

Ako se modificiraju jednostanični organizmi ili kulture višestaničnih stanica, tada u ovoj fazi počinje kloniranje, odnosno selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su podvrgnuti modificiranju. Kada je zadatak dobivanja višestanični organizmi, zatim se stanice s promijenjenim genotipom koriste za vegetativno razmnožavanje biljaka ili se ubrizgavaju u blastociste surogat majke kada je riječ o životinjama. Zbog toga se rađaju mladunci s promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se odabiru i međusobno križaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

Primjena u znanstvenim istraživanjima

Iako u maloj mjeri, genetski inženjering se već koristi kako bi ženama s nekim vrstama neplodnosti dala priliku zatrudnjeti. Za to se koriste jaja. zdrava žena. Kao rezultat toga, dijete nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke.

Međutim, mogućnost uvođenja značajnijih promjena u ljudski genom suočava se s nizom ozbiljnih etičkih problema.

Gospodarski značaj

Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska stanica. Stanice potrebne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim kriterijima, od kojih je najvažniji sposobnost da proizvode, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeni spoj - aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organsku kiselinu. . Ponekad je potrebno imati mikroorganizam koji može, primjerice, iskoristiti naftu ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine sasvim pogodne za dodatke stočnoj hrani. Ponekad su potrebni organizmi koji mogu rasti na povišenim temperaturama ili u prisutnosti tvari koje su nedvojbeno smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

Povijest razvoja i dostignuta razina tehnologije

Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

Ako se modificiraju jednostanični organizmi ili kulture višestaničnih stanica, tada u ovoj fazi počinje kloniranje, odnosno selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su podvrgnuti modificiranju. Kada se postavlja zadatak dobivanja višestaničnih organizama, stanice s izmijenjenim genotipom koriste se za vegetativno razmnožavanje biljaka ili se ubrizgavaju u blastociste surogat majke kada je riječ o životinjama. Zbog toga se rađaju mladunci s promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se odabiru i međusobno križaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

Primjena u znanstvenim istraživanjima

Iako u maloj mjeri, genetski inženjering se već koristi kako bi ženama s nekim vrstama neplodnosti dala priliku zatrudnjeti. Da biste to učinili, koristite jajašca zdrave žene. Kao rezultat toga, dijete nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke.

Međutim, mogućnost uvođenja značajnijih promjena u ljudski genom suočava se s nizom ozbiljnih etičkih problema.

Udio: