Dom » ljudska anatomija » Glavne faze virološkog istraživanja. Smjernice za proučavanje teorijskog materijala iz predmeta „Privatna medicinska virologija. Indirektne virološke metode istraživanja

Glavne faze virološkog istraživanja. Smjernice za proučavanje teorijskog materijala iz predmeta „Privatna medicinska virologija. Indirektne virološke metode istraživanja

Dijagnoza akutnih crijevnih infekcija postavlja se na osnovu kliničkih i epidemioloških podataka, uz obaveznu laboratorijsku potvrdu. Bez laboratorijske potvrde, dijagnoza akutnih crijevnih infekcija može se postaviti samo u slučajevima kada postoje jasno utvrđeni epidemiološki podaci (u žarištu infekcije i laboratorijski dešifrovanim grupnim izbijanjem bolesti kod većine pacijenata).

Za konačnu dijagnozu koriste se bakteriološke, virološke i serološke metode istraživanja.Koprološka metoda, kao i rezultati sigmoidoskopije (za šigelozu) su od sekundarnog značaja.

I. Bakteriološka metoda je od najveće važnosti kod AII uzrokovane bakterijskom florom (invazivna i sekretorna dijareja). Najbolji rezultati se postižu sejanjem fekalija direktno uz krevet pacijenta, prije određivanja antibiotske terapije i njegovom dostavom u bakteriološku laboratoriju u prva dva sata od trenutka uzimanja uzorka. Za studiju je potrebno odabrati čestice koje sadrže patološke nečistoće, ali ne i krv. Biomaterijal se sije na selektivne podloge Ploskireva, Levina i drugih. Učestalost pozitivnih rezultata (inokulacija patogena i njegova identifikacija), čak i u prisustvu tipičnih kliničkih manifestacija AII. Ne prelazi 70-80%.

II. Serološke metode dijagnostika se u pravilu koristi u sumnjivim slučajevima i s negativnim rezultatima bakteriološkog pregleda fecesa. Kod djece prvih mjeseci života, to je neinformativno, ali u svim slučajevima je važno povećanje titra antitijela za 4 ili više puta. Provode se u dva smjera - određivanje titra specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta i antigena u stolici.

Za određivanje titra specifičnih antitijela obično se koristi RNHA, rjeđe RPHA ili RA. Kao antigeni uzima se suspenzija dnevne kulture bakterija (RA) ili dijagnostikum eritrocita. ( RPGA, RNGA). Pouzdanije treba smatrati povećanje titra antitijela u dinamici bolesti. Specifična antitijela u krvi bolesnika s AII pojavljuju se 3.-5. dana bolesti i povećavaju se do maksimuma u roku od 2-3 tjedna, a zatim se postepeno smanjuju. Kod male djece, posebno one sa izmijenjenom premorbidnom pozadinom, specifična antitijela u krvi nisu otkrivena ili imaju niske titre (1:50 - 1:100).

U prisustvu tipičnih kliničkih simptoma i otkrivanja dijagnostičkog titra specifičnih antitijela (1:200) i više uz odgovarajući dijagnostikum), ili povećanja njihovog titra u dinamici bolesti, klinička dijagnoza crijevne infekcije treba smatra se ustanovljenim čak iu odsustvu sjemena patogena iz fecesa pacijenta.

III. Metode ekspresne dijagnostike Intestinalne infekcije se zasnivaju na detekciji antigena patogena (bakterije ili virusa) iz fecesa, za šta se koristi direktna metoda luminescentnih antitijela (PMLA) ili imunoadsorpciona metoda - reakcija aglomeracije ugljena (RCA). preliminarni rezultat može se dobiti za 2-3 sata, a konačni za jedan dan. Specifičnost metode je 82-94,6%.

AT poslednjih godina za brzu dijagnozu dijareje koriste se enzimski imunosorbentni test (ELISA) i lateks aglutinacija (RLA).

Etiološko dekodiranje virusne dijareje provodi se virološkim i bakteriološkim metodama.

Optimalnim periodom za otkrivanje virusa u izmetu smatra se od 1 do 4 dana bolesti, iako uzročnik često traje duže.

Glavna metoda koja se koristi je metoda elektronske mikroskopije, koja dozvoljava morfološke karakteristike identificirati širok spektar virusnih agenasa koji uzrokuju gastroenteritis.

Koristi se i imunoelektronska mikroskopija (zasnovana na sposobnosti virusnih čestica u prisustvu homolognih seruma ili rekonvalescentnih seruma da formiraju agregate rotavirusnih čestica s imunoglobulinima.

Među metodama serodijagnostike, tradicionalne uključuju reakciju neutralizacije, inhibiciju hemaglutinacije, fiksaciju komplementa Dvo- do četiri puta povećanje antitijela u parnim serumima ima retrospektivnu vrijednost za dijagnozu. rotavirusna infekcija. ELISA, difuzna precipitacija, lateks aglutinacija, reakcija koaglutinacije koriste se za otkrivanje rotavirusa ili njihovih antigena.

U praktičnom radu IFA je zauzela najšire mjesto – izolacija rotavirusnih antigena u koprofilterima. Ove metode je bolje koristiti u dinamici (prvi dan hospitalizacije i nakon kliničkog oporavka).

Kako bi se isključila bakterijska etiologija AII, provodi se i bakteriološka studija fecesa inokulacijom na hranljive podloge.

sigmoidoskopija Metoda se rijetko koristi kod djece, uglavnom radi utvrđivanja uzroka produženog izlučivanja bakterija i dijagnoze dugotrajnih i kroničnih oblika bolesti. Ova metoda ispitivanja omogućava procjenu samo prirode morfoloških promjena na sluznicama. distalno crijeva, ali se ne može koristiti za postavljanje etiološke dijagnoze crijevne infekcije.

Indikacije za instrumentalni pregled (ultrazvuk, rendgenski pregled organa trbušne duplje, FGS) sa AII je potreba za diferencijalnom dijagnozom sa hirurškim oboljenjima trbušnih organa (invaginacija, apendicitis), somatskim oboljenjima (gastritis, peptički ulkus, holecistopankreatitis i dr.) i funkcionalnim poremećajima gastrointestinalnog trakta.

Određivanje kliničkog oblika toksikoze (neurotoksikoza, toksikoza sa eksikozom, TSS), njenog stepena (stadijuma), vrste dehidracije kod infektivne dijareje kod dece i hitne pomoći

metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se široko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako one prodiru u ćeliju i karakteristike reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih čestica. nukleinske kiseline i proteini. Razvijaju se metode za određivanje redoslijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koji su njima kodirani s nukleotidnom sekvencom i utvrditi uzroke unutarćelijskih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološki procesi(interakcija antigena s antitijelima), biološka svojstva virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemoliza, enzimska aktivnost), karakteristike interakcije virusa sa ćelijom domaćinom (priroda citopatskog efekta, stvaranje intracelularnih inkluzija itd. .).

U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao i u pripremi vakcinskih preparata, široko se koristi metoda kulture tkiva i ćelija. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne ćelijske kulture. Primarne kulture se dobijaju raspršivanjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor ćelija mogu biti tkiva i organi (češće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u takozvane madrace, boce ili Petrijeve posude, gdje se, nakon pričvršćivanja na površinu posude, stanice počinju razmnožavati. Za infekciju virusom obično se koristi stanični monosloj. Hranljiva tečnost se odvodi, virusna suspenzija se unosi u određenim razblaženjima, a nakon kontakta sa ćelijama dodaje se svež hranljivi medij, obično bez seruma.

Ćelije iz većine primarnih kultura mogu se subkulturisati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolazom ćelija formira se populacija ćelija sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, večina koji zadržava originalni skup hromozoma. To su takozvane diploidne ćelije. Serijskom kultivacijom ćelija dobijaju se stabilne kontinuirane ćelijske kulture. Tokom pasaža pojavljuju se brzo dijeleće se homogene ćelije sa heteroploidnim skupom hromozoma. Stabilne ćelijske linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u razna plovila korišćenjem miksera. Postoji preko 400 ćelijskih linija izvedenih iz 40 razne vrsteživotinje (uključujući primate, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, insekte) i ljude.

U vještačkom hranljive podloge komadi se mogu uzgajati pojedinačna tijela i tkiva (kulture organa). Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (na primjer, koronavirusi).

U zaraženim ćelijske kulture virusi se mogu otkriti promjenom stanične morfologije, citopatskim djelovanjem, koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u ćeliji i u tečnosti kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tečnosti kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećih embriona ili osetljivih životinja; otkrivanjem pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u ćelijama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Izvodi se kako bi se odredio tip ili varijanta virusa koji cirkulira u populaciji (na primjer, da bi se identificirala serovarijanta virusa gripe, divlje ili vakcinalni soj virus poliomijelitisa, itd.); u slučajevima kada je potrebno sprovesti hitne epidemiološke mere; kada se pojave novi tipovi ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; da ukaže na viruse u objektima okruženje. Prilikom izolacije virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane sa dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobijena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a proces njegovog dobijanja naziva se kloniranje.

Za izolaciju virusa, infekcije osjetljivih laboratorijskih životinja, koriste se pileći embriji, ali se najčešće koristi kultura tkiva. Prisustvo virusa se obično određuje specifičnom degeneracijom ćelije ( citopatski efekat), formiranje simplasta i sincicija, otkrivanje intracelularnih inkluzija, kao i specifičnog antigena otkrivenog imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. Ovi znakovi se mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, kao što su virusi gripe, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa koriste se novorođeni miševi. Identifikacija izolovanih virusa se vrši pomoću serološke reakcije i druge metode.

Prilikom rada s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa se obično provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i virusa specifičnih antigena. Metoda plaka može se koristiti za titriranje brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa su žarišta virusom uništenih ćelija jednoslojne kulture tkiva pod prevlakom agar. Brojanje kolonija dozvoljava kvantitativna analiza infektivno djelovanje virusa na osnovu toga da jedna infektivna čestica virusa formira jedan plak. Plakovi se identifikuju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralnom crvenom; plakovi ne adsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svjetlosne mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje formiraju plak u 1 ml.

Pročišćavanje i koncentracija virusa se obično provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u gradijentima koncentracije ili gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, ionsko-izmjenjivačka hromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje patogena ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinačnom slučaju ovisi o prirodi bolesti, periodu bolesti i mogućnostima laboratorije. Savremena dijagnostika virusne infekcije se baziraju na ekspresnim metodama koje vam omogućavaju da dobijete odgovor nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala ranih datuma nakon bolesti, to uključuje elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije, detekciju antitijela klase lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućava diferencijaciju virusa i određivanje njihove koncentracije. Upotreba elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve kada je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj grupi. Ovaj nedostatak se eliminiše upotrebom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se zasniva na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda specifični serum, a istovremeno dolazi do koncentracije virusnih čestica, što omogućava njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U svrhu ekspresne dijagnostike vrši se elektronski mikroskopski pregled ekstrakata tkiva, fecesa, tečnosti iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se široko koristi za proučavanje morfogeneze virusa; njene mogućnosti se proširuju upotrebom obilježenih antitijela.

Metoda molekularne hibridizacije, zasnovana na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućava otkrivanje pojedinačnih kopija gena i nema premca u smislu osjetljivosti. Reakcija se zasniva na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNK ili RNK (sonde) i formiranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Upotreba kolorimetrijskih reakcija je obećavajuća. Postoji nekoliko varijanti molekularne hibridizacije: tačkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dana bolesti) i nestaju nakon nekoliko sedmica, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Antitijela lgM klase detektuju se imunofluorescencijom ili upotrebom enzimski imunotest upotrebom anti-μ antiseruma (anti-lgM seruma teškog lanca).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanje) : reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove tehnike se kontinuirano usavršavaju. Ove metode se koriste za identifikaciju virusa korištenjem skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se utvrdilo povećanje antitijela u drugom serumu u odnosu na prvi (prvi serum se uzima u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 sedmice). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja antitijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela lgM klase ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela lgC klase perzistiraju nekoliko godina, a ponekad i doživotno.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i antitijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina, koristi se imunoblotiranje. Metoda kombinuje frakcionisanje proteina korišćenjem elektroforeze u poliakrilamidnom gelu sa naknadnim imunotestom proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za hemijskom čistoćom antigena i omogućava identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije imunološkog testa enzima uzrokovane prisustvom antitijela na ćelijskih antigena, koji su prisutni kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija antitela u serumu pacijenata na unutrašnje i spoljašnje virusne antigene omogućava određivanje stadijuma bolesti, au analizi populacija - varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i antitijela na njih. Prilikom analize populacija, metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. velika vrijednost Metoda se sastoji u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNK, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

20)Osnovni strukturna komponenta virioni(kompletne virusne čestice) je nukleokapsid, tj. proteinski omotač (kapsid) koji obuhvata virusni genom (DNK ili RNK). Nukleokapsid većine porodica virusa okružen je lipoproteinskom ovojnicom. Između ovojnice i nukleokapsida kod nekih virusa (orto-, paramikso-, rabdo-, filo- i retrovirusa) nalazi se neglikozilirani matriksni protein, koji virionima daje dodatnu krutost. Virusi većine porodica imaju omotač koji igra važnu ulogu u infektivnosti. Virioni stiču vanjski sloj ovojnice kada nukleokapsid pupanjem prodre u ćelijsku membranu. Virus kodira proteine omotača, a lipidi su posuđeni iz ćelijske membrane. Glikoproteini obično u obliku dimera i trimera formiraju peplomere (izbočine) na površini viriona (orto-, paramiksovirusi, rabdo-, filo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirusi). Glikozilirani fuzijski proteini povezani su s peplomerima i igraju ključnu ulogu u ulasku virusa u ćeliju. Kapsidi i ovojnice viriona formiraju se od mnogih kopija jedne ili više vrsta proteinskih podjedinica kao rezultat procesa samosastavljanja. Interakcija u proteinsko-proteinskom sistemu zbog slabe hemijske veze, dovodi do ujedinjenja simetričnih kapsida. Razlike u virusima u obliku i veličini viriona zavise od oblika, veličine i broja strukturnih proteinskih podjedinica i prirode interakcije između njih. Kapsid se sastoji od mnogih morfološki izraženih podjedinica (kapsomera) sastavljenih od virusnih polipeptida na strogo definisan način, u skladu sa relativno jednostavnim geometrijskim principima. Proteinske podjedinice, povezujući se jedna s drugom, formiraju kapside dvije vrste simetrije: izometrijske i spiralne. Struktura nukleokapsida virusa s ovojnicom slična je strukturi nukleokapsida virusa bez ovojnice. Na površini omotača virusa razlikuju se morfološki izražene glikoproteinske strukture - peplomeri. Sastav superkapsidne membrane uključuje lipide (do 20-35%) i ugljikohidrate (do 7-8%), koji su ćelijskog porijekla. Sastoji se od dvostrukog sloja ćelijskih lipida i proteina specifičnih za virus koji se nalaze izvan i unutar lipidnog biosloja. Vanjski sloj ljuske superkapsida predstavljen je peplomerima (izbočinama) jednog ili više tipova, koji se sastoje od jednog ili više molekula glikoproteina. Nukleokapsid virusa sa omotačem često se naziva jezgrom. centralni dio Virion koji sadrži nukleinsku kiselinu naziva se nukleoid. Kapsomeri (peplometri) se sastoje od strukturne jedinice izgrađen od jednog ili više homolognih ili heterolognih polipeptidnih lanaca (proteinskih podjedinica). klasifikacija virusa Izometrijski kapsidi nisu sfere, već pravilni poliedri (ikosaedri). Njihove linearne dimenzije su identične duž osi simetrije. Prema Kasparu i Klugu (1962), kapsomeri u kapsidima su raspoređeni prema ikosaedarskoj simetriji. Takvi kapsidi se sastoje od identičnih podjedinica koje formiraju ikosaedar. Imaju 12 vrhova (uglova), 30 lica i 20 površina u obliku jednakokračnih trouglova. U skladu sa ovim pravilom, kapsid virusa poliovirusa i virusa slinavke i šapa formira se od 60 proteinskih strukturnih jedinica, od kojih se svaka sastoji od četiri polipeptidna lanca. Ikosaedar optimalno rješava problem pakovanja ponavljajućih podjedinica u strogu kompaktnu strukturu s minimalnim volumenom. Samo neke konfiguracije strukturnih podjedinica mogu formirati površine, vrhove i lica virusnog ikosaedra. Na primjer, strukturne podjedinice adenovirusa formiraju heksagonalne kapsomere (heksone) na površinama i licu, i pentagonalne kapsomere (peptone) na vrhovima. Kod nekih virusa oba tipa kapsomera formiraju isti polipeptidi, a kod drugih različiti polipeptidi. Budući da se strukturne podjedinice različitih virusa razlikuju jedna od druge, čini se da su neki virusi više heksagonalni, drugi više sferični. Svi poznati virusi kralježnjaka koji sadrže DNK, osim virusa velikih boginja, kao i mnogi virusi koji sadrže RNK (7 porodica) imaju tip kubične simetrije kapsida. Reovirusi, za razliku od drugih virusa kralježnjaka, imaju dvostruki kapsid (vanjsku i unutrašnju), svaki se sastoji od morfoloških jedinica. Virusi sa spiralnim tipom simetrije imaju oblik cilindrične filamentne strukture, njihova genomska RNK ima oblik spirale i nalazi se unutar kapside. Svi životinjski virusi spiralne simetrije okruženi su lipoproteinskom ovojnicom. Helične nukleokapside karakteriziraju dužina, promjer, korak spirale i broj kapsomera po okretu spirale. Dakle, u Sendai virusu (paramiksovirusu), nukleokapsid je spirala duga oko 1 μm, prečnika 20 nm i korak spirale od 5 nm. Kapsida se sastoji od približno 2400 strukturnih jedinica, od kojih je svaka protein molekulske težine 60 kD. Postoji 11-13 podjedinica po okretu heliksa. Kod virusa sa spiralnim tipom nukleokapsidne simetrije, savijanje proteinskih molekula u heliks osigurava maksimalnu interakciju između nukleinske kiseline i proteinskih podjedinica. Kod ikosaedarskih virusa, nukleinska kiselina je umotana unutar viriona i stupa u interakciju s jednim ili više polipeptida koji se nalaze unutar kapside.

Antireceptori (receptori) Virusni- površinski virion proteini, na primjer, hemaglutinin, koji se na komplementaran način vezuju za odgovarajući receptor osjetljive ćelije.

21) Imunološke metode u virološkim istraživanjima.

Serološki testovi se razlikuju po svojoj sposobnosti da otkriju pojedinačne klase antitijela. Test aglutinacije je, na primjer, dobar u otkrivanju IgM antitijela, ali je manje osjetljiv za otkrivanje IgG antitijela. Testovi fiksacije komplementa i hemolize, koji zahtijevaju komplement, ne otkrivaju antitijela koja se ne vežu za komplement, kao što su IgA antitijela i IgE antitijela. U reakciji neutralizacije virusa učestvuju samo antitijela usmjerena protiv antigenskih determinanti površine viriona povezane s patogenošću. Osetljivost I. m. i. nadmašuje sve druge metode za proučavanje antigena i antitijela, a posebno radioimunoesej i enzimski imunotest omogućavaju hvatanje prisustva proteina u količinama mjerenim u nanogramima, pa čak i u pikogramima. Uz pomoć I. m. i. odredite grupu i provjerite sigurnost krvi (hepatitis B i HIV infekcija). Kod transplantacije tkiva i tijela I. m. omogućavaju određivanje kompatibilnosti tkiva i testiranje metoda suzbijanja inkompatibilnosti. U sudskoj medicini Castellanijeva reakcija se koristi za određivanje specifičnosti vrste proteina, a reakcija aglutinacije za određivanje krvne grupe.

Imunološke metode se široko koriste u laboratorijska dijagnostika zarazne bolesti. Etiologija bolesti se utvrđuje i na osnovu povećanja antitela na uzročnik u krvnom serumu rekonvalescenta u odnosu na uzorak uzet u prvim danima bolesti. Na osnovu I. m. i. proučavaju imunitet stanovništva u odnosu na masovne infekcije, kao što je gripa, a takođe procjenjuju efikasnost preventivnih vakcinacija.

U zavisnosti od njihovog mehanizma i računa rezultata I. m. i. mogu se podijeliti na reakcije zasnovane na fenomenu aglutinacije; reakcije zasnovane na fenomenu padavina; reakcije koje uključuju komplement; reakcija neutralizacije; reakcije hemijskim i fizičkim metodama.

Reakcije zasnovane na fenomenu aglutinacije. Aglutinacija je lijepljenje stanica ili pojedinačnih čestica - nosilaca antigena uz pomoć imunološkog seruma na ovaj antigen.

Test bakterijske aglutinacije korištenjem odgovarajućeg antibakterijskog seruma jedan je od najjednostavnijih seroloških testova. Različitim razblaženjima ispitivanog krvnog seruma dodaje se suspenzija bakterija i nakon određenog kontaktnog vremena na t°37° se bilježi pri kojem se najvećem razrjeđenju krvnog seruma javlja aglutinacija. Reakcija aglutinacije bakterija koristi se za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti: bruceloze, tularemije, trbušnog tifusa i paratifusa, bacilarne dizenterije i tifusa.

Reakcija pasivne, ili indirektne, hemaglutinacije (RPGA, RNGA). Koristi eritrocite ili neutralne sintetičke materijale (na primjer, čestice lateksa), na čijoj površini se adsorbiraju antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni.

Test pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama ( tifusne groznice i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera, itd.), protozoe (malarija) i virusi (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, boginje, krpeljni encefalitis, krimski hemoragijska groznica itd.), kao i za određivanje nekih hormona, identifikovati preosjetljivost bolestan lijekovi i hormone kao što su penicilin i insulin.

Test inhibicije hemaglutinacije (HITA) zasniva se na fenomenu prevencije (inhibicije) imunog seruma hemaglutinacije eritrocita virusima, a koristi se za otkrivanje i titriranje antivirusnih antitijela. Služi kao glavna metoda serodijagnostike gripe, malih boginja, rubeole, zauške, krpeljni encefalitis i druge virusne infekcije čiji uzročnici imaju hemaglutinirajuća svojstva. na primjer, za serodijagnostiku krpeljnog encefalitisa, dvostruka razrjeđenja pacijentovog seruma u otopini alkalnog boratnog pufera se sipaju u jažice panela. Zatim se dodaje određena količina, obično 8 AJ (aglutinirajuće jedinice), antigena krpeljnog encefalitisa, a nakon 18 sati izlaganja na t ° 4 °, unosi se suspenzija guščjih eritrocita pripremljena u kiseloj otopini fosfatnog pufera. Ako u krvnom serumu pacijenta postoje antitijela na virus krpeljnog encefalitisa, tada se antigen neutralizira i ne dolazi do aglutinacije eritrocita.

Reakcije zasnovane na fenomenu padavina. Precipitacija nastaje kao rezultat interakcije antitijela sa rastvorljivim antigenima. Najjednostavniji primjer precipitacijske reakcije je formiranje neprozirne precipitacijske trake u epruveti na granici naslaganja antigena na antitijelo. Široko se koriste različite vrste reakcija precipitacije u polutekućem agaru ili agaroznim gelovima (Ouchterlon dvostruka imunodifuzijska metoda, radijalna imunodifuzijska metoda, imunoelektroforeza), koje su i kvalitativne i kvantitativne. Kao rezultat slobodne difuzije u gelu antigena i antitijela u zoni njihovog optimalnog omjera nastaju specifični kompleksi - precipitacijske trake, koje se otkrivaju vizualno ili bojenjem. Karakteristika metode je da svaki par antigen-antitijelo formira individualni precipitacijski pojas, a reakcija ne ovisi o prisutnosti drugih antigena i antitijela u sistemu koji se proučava.

Reakcije koje uključuju komplement, koji se koristi kao svježi serum zamorčića, temelje se na sposobnosti podkomponente Clq komplementa, a zatim i drugih komponenti komplementa da se vežu za imunološke komplekse.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) omogućava titraciju antigena ili antitela prema stepenu fiksacije komplementa kompleksom antigen-antitelo. Ova reakcija se sastoji od dvije faze: interakcije antigena sa testnim krvnim serumom (test sistem) i interakcije hemolitičkog seruma sa eritrocitima ovna (indikatorski sistem). At pozitivna reakcija u sistemu koji se proučava dolazi do fiksacije komplementa, a zatim, kada se dodaju eritrociti osjetljivi na antitijela, hemoliza se ne opaža. Reakcija se koristi za serodijagnostiku sifilisa (Wassermannova reakcija), virusnih i bakterijskih infekcija.

Reakcija neutralizacije temelji se na sposobnosti antitijela da neutraliziraju određene specifične funkcije makromolekularnih ili topljivih antigena, kao što su aktivnost enzima, bakterijski toksini i patogenost virusa. Reakcija neutralizacije toksina može se procijeniti prema biološkom efektu, na primjer, titriraju se serumi protiv tetanusa i botulinuma. Mješavina toksina i antiseruma koja se daje životinjama ne uzrokuje njihovu smrt. U virologiji se koriste različite varijante reakcije neutralizacije. Kada se virusi pomiješaju s odgovarajućim antiserumom i ova mješavina se daje životinjama ili ćelijskim kulturama, neutralizira se patogenost virusa i životinje ne obolijevaju, a stanice kultura ne podliježu uništavanju.

Reakcije pomoću kemijskih i fizičkih oznaka. Imunofluorescencija se sastoji u upotrebi fluorohromom obeleženih antitela, tačnije, imunoglobulinske frakcije IgG antitela. Antitelo obeleženo fluorohromom formira kompleks antigen-antitelo sa antigenom, koji postaje dostupan za posmatranje pod mikroskopom u UV zracima koji pobuđuju luminescenciju fluorohroma. Reakcija direktne imunofluorescencije koristi se za proučavanje ćelijskih antigena, otkrivanje virusa u inficiranim stanicama i otkrivanje bakterija i rikecija u razmazima.

Metoda indirektne imunofluorescencije se više koristi. baziran na detekciji kompleksa antigen-antitijelo korištenjem luminiscentnog seruma anti-lgG antitijela i koristi se za otkrivanje ne samo antigena, već i titracije antitijela.

Imunoenzimske, ili enzimske imunološke, metode se zasnivaju na upotrebi antitijela konjugiranih s enzimima, uglavnom peroksidazom hrena ili alkalnom fosfatazom. Kao i imunofluorescencija, enzimski imunotest se koristi za otkrivanje antigena u ćelijama ili za titriranje antitela na ćelijama koje sadrže antigen.

Radioimunološka metoda temelji se na korištenju radioizotopske oznake antigena ili antitijela. To je najosetljivija metoda za određivanje antigena i antitela, koristi se za određivanje hormona, lekovite supstance i antibiotici, za dijagnostiku bakterijskih, virusnih, rikecija, protozoa, proučavanje proteina u krvi, tkivnih antigena.

Imunobloting se koristi za otkrivanje antitijela na pojedinačne antigene ili "prepoznavanje" antigena iz poznatih seruma. Metoda se sastoji od 3 faze: odvajanje bioloških makromolekula (na primjer, virusa) na pojedinačne proteine pomoću elektroforeze na poliakrilamidnom gelu; prenošenje izdvojenih proteina iz gela na čvrstu podlogu (blot) nanošenjem ploče od poliakrilamidnog gela na aktivirani papir ili nitrocelulozu (elektroblotiranje); detekcija željenih proteina na supstratu korišćenjem direktnog ili indirektnog enzimskog imunoeseja. Kao dijagnostička metoda, imunobloting se koristi za HIV infekciju. Dijagnostička vrijednost je otkrivanje antitijela na jedan od proteina vanjskog omotača virusa.

22) Tipovi simetrije virusa (kubični, spiralni, mješoviti). Interakcija proteina i nukleinskih kiselina u pakovanju genoma virusa.

Ovisno o interakciji kapsida s nukleinskom kiselinom, virusne čestice se mogu podijeliti u nekoliko tipova simetrije:

1). Tip kubične simetrije.

Kubični kapsidi su ikosideri sa otprilike 20 trokutastih površina i 12 vrhova. Oni formiraju strukturu koja liči na sfernu formaciju, ali u stvari je poliedar. U nekim slučajevima, posebne formacije lipoproteina koje se nazivaju šiljci su pričvršćene za vrhove takvih ikosaedarskih poliedara. Uloga ovih šiljaka se vjerovatno svodi na interakciju viriona ili virusnih čestica s odgovarajućim područjima ćelija domaćina koja su osjetljiva na njih. Sa kubičnom simetrijom, virusna nukleinska kiselina je čvrsto spakovana (smotana u kuglu), a proteinski molekuli je okružuju, formirajući poliedar (ikosaedar). Ikosaedar je poliedar sa dvadeset trokutastih lica kubične simetrije i približno sfernog oblika. Ikosaedrski virusi uključuju herpes simplex virus, reoviruse itd.

2). Tip spiralne simetrije. Spiralni kapsidi su nešto jednostavniji. One. Kapsomeri koji čine kapsid pokrivaju spiralni NK i formiraju prilično stabilnu proteinsku školjku ovih virusa. A kada se koriste elektronski mikroskopi visoke rezolucije i odgovarajuće metode pripreme, vide se spiralne strukture na virusima. Sa spiralnom simetrijom kapside, virusna nukleinska kiselina formira spiralnu (ili spiralnu) figuru, šuplju iznutra, a proteinske podjedinice (kapsomeri) su također složene oko nje u spiralu (cijevasta kapsida). Primjer virusa sa spiralnom simetrijom kapside je virus mozaika duhana, koji je u obliku štapa, a njegova dužina je 300 nm s promjerom od 15 nm. Sastav virusne čestice uključuje jedan RNA molekul veličine oko 6000 nukleotida. Kapsid se sastoji od 2000 identičnih proteinskih podjedinica raspoređenih u spiralu.

3). Mješoviti ili složenog tipa simetrija. U pravilu se ova vrsta simetrije nalazi uglavnom među bakterijskim virusima. A klasični primjeri su ti fagi, E. coli ili umjereni fagi. To su složene formacije koje imaju glavu sa unutrašnjim nukleinskim sadržajem, razne vrste dodataka, repni proces, različitim stepenima složenost uređaja. A svaka komponenta takvih čestica je obdarena specifičnom funkcijom koja se ostvaruje u procesu interakcije između virusa i ćelije. Drugim riječima, složena vrsta simetrije je kombinacija kubične simetrije, glava je ikoziderni poliedar, a štapićaste formacije su repni procesi. Iako među bakterijskim virusima postoje i prilično jednostavno organizirani virioni, koji su primitivni nukleokapsidi, sfernog ili kubičnog oblika. Bakterijski virusi su složeniji od biljnih i životinjskih virusa.

24) Interakcija faga sa ćelijom. Virulentni i umjereni fagi.

Adsorpcija.

Interakcija počinje vezivanjem virusnih čestica na površinu ćelije. Proces postaje moguć u prisustvu odgovarajućih receptora na površini ćelije i antireceptora na površini virusne čestice.

Virusi koriste ćelijske receptore dizajnirane za transport esencijalnih supstanci: hranljive čestice, hormone, faktore rasta, itd.

Receptori: proteini, ugljikohidratna komponenta proteina i lipida, lipidi. Specifični receptori određuju dalju sudbinu virusne čestice (transport, dostava u područja citoplazme ili jezgra). Virus se može vezati za nespecifične receptore i čak prodrijeti u ćeliju. Međutim, ovaj proces ne uzrokuje infekciju.

U početku se formira jedna veza između antireceptora i receptora. Ova veza je krhka i može puknuti. Za formiranje ireverzibilne adsorpcije potrebno je viševalentno vezivanje. Stabilno vezivanje nastaje zbog slobodnog kretanja receptorskih molekula u membrani. Tokom interakcije virusa sa ćelijom, uočava se povećanje fluidnosti lipida i formiranje receptorskih polja u području interakcije između virusa i ćelije. Receptori brojnih virusa mogu biti prisutni samo u ograničenom skupu ćelija domaćina. Ovo određuje osjetljivost organizma na ovaj virus. Dakle, virusna DNK i RNK imaju sposobnost da inficiraju širi spektar ćelija domaćina.

Antireceptori se mogu naći u jedinstvenim virusnim organelama: strukture izraslina u T-bakteriofagima, vlakna u adenovirusima, šiljci na površini virusnih membrana, korona u koronavirusima.

Penetracija.

2 mehanizma - endocitoza receptora i fuzija membrane.

Endocitoza receptora:

Uobičajeni mehanizam za ulazak hranjivih i regulatornih supstanci u ćeliju. Javlja se u specijalizovanim područjima - gdje postoje posebne jame prekrivene klatrinom, specifični receptori se nalaze na dnu jame. Jamice osiguravaju brzu invaginaciju i stvaranje vakuola prekrivenih klatrinom (ne prođe više od 10 minuta od trenutka adsorpcije, u jednoj minuti može se formirati do 2000 vakuola). Vakuole se spajaju s većim citoplazmatskim vakuolama i formiraju receptorosome (koji više ne sadrže klatrin), koji se zauzvrat spajaju s lizosomima.

Fuzija virusnih i ćelijskih membrana:

Kod virusa sa omotačem, fuzija je uzrokovana tačkaste interakcije virusni protein sa lipidima ćelijske membrane, usled čega se ovojnica virusnog lipoproteina integriše sa ćelijskom membranom. Kod virusa bez ovojnice, jedan od površinskih proteina također stupa u interakciju s lipidima. ćelijske membrane a unutrašnja komponenta prolazi kroz membranu (kod paramiksovirusa - F-protein, kod ortomiksovirusa - HA2 hemaglutinirajuća podjedinica). Na konformaciju površinskih proteina utiče pH.

Skinuti se.

U tom procesu nestaje infektivna aktivnost, često se javlja osjetljivost na nukleaze i javlja se otpor na antitijela. Krajnji proizvod skidanja su nukleinske kiseline vezane za unutrašnji virusni protein. Faza svlačenja takođe ograničava mogućnost infekcije (virusi se ne mogu svući u svakoj ćeliji). Svlačenje se dešava u specijalizovanim delovima ćelije: lizosomima, Golgijevom aparatu i perinuklearnom prostoru.

Svlačenje se dešava kao rezultat niza reakcija. Na primjer, kod picornavirusa svlačenje se nastavlja formiranjem srednjih subvirusnih čestica veličine od 156 do 12S. Kod adenovirusa u citoplazmi i nuklearnim porama i ima najmanje 3 stadijuma:

Formiranje subvirusnih čestica veće gustoće od viriona;

Formiranje jezgara u kojima nedostaju 3 virusna proteina;

Formiranje kompleksa DNK-protein u kojem je DNK kovalentno vezana za terminalni protein.

Karakterizacija virulentnih i umjerenih faga.

Kada je bakterija inficirana fagom dolazi do takozvane litičke infekcije, odnosno infekcije koja kulminira lizom ćelije domaćina, ali to je karakteristično samo za tzv. virulentne fage čija interakcija sa ćelijom dovodi do smrti ćelije i stvaranja potomstva faga.

U ovom slučaju razlikuju se sljedeće faze prema interakcijama faga sa ćelijom: miješanje faga sa staničnom kulturom (višestrukost infekcije je 1 fag na 10 stanica), a koncentracija mora biti dovoljno visoka da se fagi mogu kontaktirati ćelije. Da bi se izbjegla ponovna infekcija - nakon infekcije u trajanju od najviše 5 minuta, kada se fagi adsorbiraju - ova mješavina stanica sa fagom se razrjeđuje. Razlikuje se latentni period tokom kojeg se količina faga ne povećava, zatim vrlo kratak period izlaz, kada se broj fagnih čestica naglo poveća, kada se ćelija lizira i fagno potomstvo se oslobađa, a tada broj faga ostaje na istom nivou, jer ne dolazi do ponovne infekcije. Na osnovu ove krive mogu se razlikovati ove faze: vegetativni period "rasta" (latentni period), period izlaska i izračunati prinos faga po 1 inficiranoj ćeliji. Tokom latentnog perioda, u bakterijama se ne može naći ništa što bi ličilo na čestice faga i nije moguće izolovati infektivni princip iz takvih ćelija u latentnom periodu. Samo zrele čestice faga mogu inficirati bakterije. Dakle, virulentni fagi uvijek uzrokuju smrt bakterija i proizvode infekciju, koja se otkriva u stvaranju novih virusnih čestica sposobnih da inficiraju sljedeće i druge osjetljive stanice.

Za razliku od virulentnih, infekcija umjerenim fagima ne dovodi do lize bakterijskih stanica, već se ostvaruje formiranje posebnog stanja koegzistencije faga sa bakterijskom ćelijom. Ta koegzistencija se izražava u činjenici da je određeni početak faga prisutan u bakterijskoj ćeliji bez ikakvih nepovoljnih uslova za to i čuva se iz generacije u generaciju. U određenim fazama takve koegzistencije, fag se aktivira u ćeliji i ulazi u stanje litičkog ciklusa razvoja, uzrokujući ćelijsku lizu i oslobađanje fagnog potomstva. Takvi fagi se nazivaju lizogeni ili umjereni fagi, a stanje umjerenog postojanja s fagom je lizogenija, a bakterije koje sadrže takav latentni fag nazivaju se lizogene bakterije. Termin lizogene bakterije proizašao je iz činjenice da su svojevremeno otkrivene kulture u kojima se spontano pojavio fag, a taj bakteriofag se počeo smatrati kontaminacijom kulture, odnosno bakterijski virus uđe u kulturu, a takve kulture su nazvane lizogene, odnosno stvaraju lizu.

Virološke metode istraživanja- metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se široko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako one prodiru u ćeliju i karakteristike reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina. i proteini. Razvijaju se metode za određivanje redoslijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje oni kodiraju sa nukleotidnom sekvencom i utvrditi uzroke unutarćelijskih procesa koji igraju važnu ulogu u infekciji e-virusom.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s antitijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, enzimska aktivnost), osobinama interakcije virusa sa ćelijom domaćinom (priroda citopatske efekat, formiranje intracelularnih inkluzija itd.) .

Ćelije iz većine primarnih kultura mogu se subkulturisati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolaskom ćelija formira se populacija ćelija sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava originalni skup hromozoma. To su takozvane diploidne ćelije. Serijskom kultivacijom ćelija dobijaju se stabilne kontinuirane ćelijske kulture. Tokom pasaža pojavljuju se brzo dijeleće se homogene ćelije sa heteroploidnim skupom hromozoma. Stabilne ćelijske linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u različitim posudama uz pomoć miješalica. Postoji preko 400 ćelijskih linija koje potiču od 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, insekte) i ljudi.

Komadi pojedinih organa i tkiva (kulture organa) mogu se uzgajati u vještačkim hranjivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (na primjer, koronavirusi).

U inficiranim ćelijskim kulturama virusi se mogu otkriti promjenom ćelijske morfologije, citopatskim djelovanjem koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u ćeliji i u tečnosti kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tečnosti kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećih embriona ili osetljivih životinja; otkrivanjem pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u ćelijama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među populacijom (na primjer, da bi se identificirala serovarijanta virusa a, divlji ili vakcinalni soj virusa a, itd.); u slučajevima kada je potrebno sprovesti hitne epidemiološke mere; kada se pojave novi tipovi ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoline. Prilikom izolacije virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane sa dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobijena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a proces njegovog dobijanja naziva se kloniranje.

formiranje simplasta i sincicija, detekcija intracelularnih inkluzija, kao i specifičnog antigena otkrivenog imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. Ovi znakovi se mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, na primjer virusa a, koriste se pileći embrioni, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa - novorođenih miševa. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim testovima i drugim metodama.

Prilikom rada s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa se obično provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i virusa specifičnih antigena. Metoda plaka može se koristiti za titriranje brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa su žarišta virusom uništenih ćelija jednoslojne kulture tkiva pod prevlakom agar. Brojanje kolonija omogućava kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na osnovu toga da jedna čestica infektivnog virusa formira jedan plak. Plakovi se identifikuju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralnom crvenom; plakovi ne adsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svjetlosne mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje formiraju plak u 1 ml.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje patogena ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinačnom slučaju ovisi o prirodi bolesti, periodu bolesti i mogućnostima laboratorije. Savremena dijagnoza virusnih infekcija bazira se na ekspresnim metodama koje vam omogućavaju da dobijete odgovor nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim stadijumima nakon bolesti, uključujući elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju,

kao i imunofluorescencija, metoda molekularne hibridizacije, detekcija antitijela klase lgM itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dana bolesti) i nestaju nakon nekoliko sedmica, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Antitijela IgM klase se otkrivaju imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom korištenjem anti-m antiseruma (anti-IgM seruma teškog lanca).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanja ): reakcije fiksacije komplementa

inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove tehnike se kontinuirano usavršavaju. Ove metode se koriste za identifikaciju virusa korištenjem skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se utvrdilo povećanje antitijela u drugom serumu u odnosu na prvi (prvi serum se uzima u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 sedmice). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja antitijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela lgM klase ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela lgC klase perzistiraju nekoliko godina, a ponekad i doživotno.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i antitijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina, koristi se imunoblotiranje. Metoda kombinuje frakcionisanje proteina korišćenjem elektroforeze u poliakrilamidnom gelu sa naknadnim imunotestom proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za hemijskom čistoćom antigena i omogućava identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimske imunoanalize uzrokovane prisustvom antitijela na ćelijske antigene, koja su prisutna kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija antitela u serumu pacijenata na unutrašnje i spoljašnje virusne antigene omogućava određivanje stadijuma bolesti, au analizi populacija - varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i antitijela na njih. Prilikom analize populacija, metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode je u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNK, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

Bibliografija: Bukrinskaya A.G. Virologija, M., 1986; Virology, Methods, ur. B. Meikhi, trans. sa engleskog, M., 1988; Priručnik o mikrobiološkim i virološkim metodama istraživanja, ur. M.O. Birger, M., 1982.

Virološke studije su studije osmišljene da izoluju viruse i proučavaju njihova svojstva, kao i da utvrde etiološki odnos virusa sa određenim bolestima.

Materijal za studiju uzima se u zavisnosti od lokacije preovlađujućih virusa u telu pacijenta i načina na koji se izoluju tokom spoljašnje okruženje. Materijal se sakuplja u sterilnu posudu, dostavlja u laboratoriju što je brže moguće i čuva dok se studija ne zamrzne ili na ledu. Prije upotrebe, materijal za izolaciju virusa se obrađuje (i) radi suzbijanja strane mikroflore i podvrgava uklanjanju velikih čestica.

Izolacija virusa se provodi inficiranjem laboratorijskih životinja, pilećih embrija, kulture tkiva materijalom koji sadrži virus. Izbor metode izolacije ovisi o navodnom uzročniku bolesti. Dakle, kulture tkiva (vidi) se koriste kada se radi s virusima koji nisu patogeni za laboratorijske životinje, ili kada se otkriju u kulturi tkiva ranije nego kada su životinje zaražene. Pileći embrioni se inficiraju radi izolacije patogena, infektivnog parotitisa (u amnionskoj i alantoičnoj šupljini), (u žumančana vreća), male boginje (na horioalantoičkoj membrani).

Od laboratorijskih životinja za izolaciju virusa najčešće se koriste bijeli miševi, zatim zečevi, pacovi, zamorci, majmuni. Za arboviruse, najefikasnije unošenje materijala koji sadrži virus u glavu ili, za pneumotropne viruse - na sluznicu respiratornog trakta, za viruse malih boginja, na skarificiranoj rožnjači.

Izolacija virusa je najefikasnija u akutnom periodu bolesti. Bitna tačka u utvrđivanju virusne prirode bolesti su rezultati serološke studije serumi uzimani više puta od istog pacijenta na početku bolesti i tokom rekonvalescencije. Otkrivanje antitijela na izolirane viruse u drugom serumu u titru 4 ili više puta većem nego u prvom ukazuje na etiološku povezanost virusa sa ovom bolešću.

Rano i brza metoda detekcija virusnih antigena je metoda fluorescentnih antitela zasnovana na specifičnoj fiksaciji antitela obeleženih fluorohromom na površini antigena. Antigen se lako otkriva luminiscentnom mikroskopijom (vidi) zahvaljujući sjajnoj fluorescenciji antitijela adsorbiranih na antigenu. Metodom fluorescentnih antitijela ispituju se brisevi uzeti od pacijenata, histološki preseci zahvaćenih tkiva, preparati iz kulture tkiva. Također se primjenjuje na detekciju elementarnih tijela (viriona) (vidi). Od ostalih morfoloških metoda koriste se one koje otkrivaju intracelularne virusne inkluzije u dijelovima zahvaćenih organa i tkiva. Otkrivanje inkluzija ukazuje na infekciju i u nekim slučajevima doprinosi dijagnozi. virusna bolest. Koriste se različite metode za otkrivanje virusnih antitijela u krvi pacijenata i proučavanje antigenske strukture virusa. Reakcija neutralizacije se koristi kod gotovo svih virusnih infekcija. Temelji se na sposobnosti imunoloških antitijela da neutraliziraju infektivna svojstva virusa kada se smjesa unese u tijelo osjetljivih životinja ili u kulturu tkiva. Za određivanje indeksa neutralizacije, stalna doza seruma se miješa s različitim razrjeđenjima virusa, a za određivanje titra antitijela - razna razblaženja serum sa konstantnom dozom virusa. Kontrola je infekcija životinja (ili kultura tkiva) mješavinom virusa sa normalnim serumom ili sa fiziološki rastvor. Reakcija neutralizacije se postavlja ne samo za otkrivanje antitijela, već i za određivanje vrste i vrste virusa.

Reakcija fiksacije komplementa [na primjer, Borde - Zhangu reakcija (vidi)] se koristi za otkrivanje virusnih antigena i antitijela. U prvom slučaju, poznati imunološki serum stupa u interakciju sa materijalom u kojem se pretpostavlja prisustvo antigena: krvnim serumom, brisevima nazofarinksa, ekstraktima tkiva inficiranog organizma. U drugom slučaju, poznati antigen (diagnosticum) i serum pacijenta ili rekonvalescenta.

RSK se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih gripom, malim boginjama, adenovirusima i arbovirusima.

Virološka metoda uključuje dvije glavne faze: izolaciju virusa i njihovu identifikaciju. Materijali mogu biti krv, druge biološke i patološke tekućine, biopsije organa i tkiva.

Za dijagnosticiranje arbovirusnih infekcija često se provodi virusološko testiranje krvi. U pljuvački se mogu otkriti virusi bjesnoće, zaušnjaka i herpes simplex virusa. Brisevi nazofarinksa koriste se za izolaciju uzročnika gripe i drugih akutnih respiratornih virusnih infekcija, malih boginja. U ispiranjima iz konjunktive nalaze se adenovirusi. Iz fecesa se izoluju različiti entero-, adeno-, reo- i rotavirusi.

Za izolaciju virusa koriste se kulture stanica, pileći embriji, a ponekad i laboratorijske životinje. Većina patogenih virusa razlikuje se po prisutnosti tkiva i specifičnosti tipa, "na primjer, poliovirus se razmnožava samo u ćelijama primata, stoga se za izolaciju specifičnog virusa koristi odgovarajuća kultura tkiva. Da bi se izolirao nepoznati patogen, preporučljivo je istovremeno inficirati 3-4 ćelijske kulture, pod pretpostavkom da jedna od njih može biti osjetljiva. Prisustvo virusa u inficiranim kulturama određuje se razvojem specifične ćelijske degeneracije, tj. citopatogenim djelovanjem, otkrivanjem intracelularnih inkluzija, kao i na osnovu detekcija specifičnog antigena imunofluorescencijom, pozitivne reakcije hemadsorpcije i hemaglutinacije. Embrioni ptica sa svojim slabo diferenciranim tkivom pogodni su za kultivaciju velikog broja virusa. Najčešće se koriste pileći embrioni. Prilikom razmnožavanja u embrionima (virusi mogu uzrokovati njihovu smrt arbovirusi), pojava promjena na horion-alantoičnoj membrani (poksvirusi) ili u tijelu embrija, akumuliranih tj. u embrionalnim tečnostima hemaglutinina (virusi gripa, zaušnjaci) i virusni antigen koji fiksira komplement.

Virusi se identifikuju imunološkim metodama: inhibicija hemaglutinacije, fiksacija komplementa, neutralizacija, precipitacija gela, imunofluorescencija.

3.4 Biološka metoda

biološka metoda sastoji se u inficiranju laboratorijskih životinja različitim materijalom (kliničkim, laboratorijskim) za ukazivanje na patogen, kao i za određivanje određenih svojstava mikroorganizama koja karakterišu njihovu patogenost (toksičnost, toksičnost, virulencija). Kao laboratorijske životinje koriste se bijeli miševi, bijeli pacovi, zamorci, zečevi itd.

Reprodukcija bolesti kod životinje je apsolutni dokaz patogenosti izolovanog mikroorganizma (u slučaju bjesnila, tetanusa itd.). Stoga je biološki test na životinjama vrijedna i pouzdana dijagnostička metoda, posebno za one infekcije čiji se patogeni nalaze u niskim koncentracijama u proučavanim biološkim podlogama ljudskog tijela i slabo ili sporo rastu na umjetnim podlogama.

3.5 Imunološka metoda

Imunološka metoda(serološki) uključuje studije krvnog seruma, kao i drugih bioloških supstrata za detekciju specifičnih antitijela i antigena. Klasična serodijagnostika temelji se na određivanju antitijela na identificirani ili sumnjivi patogen. Pozitivan rezultat reakcije ukazuje na prisutnost u testnom krvnom serumu antitijela na antigene patogena, negativan rezultat ukazuje na odsutnost takvih. Otkrivanje antitijela na uzročnika niza zaraznih bolesti u ispitivanom krvnom serumu nije dovoljno za postavljanje dijagnoze, jer može odražavati prisutnost postinfektivnog ili postvakcinalnog imuniteta, dakle, „sparene“ krvi. serumi se ispituju, prvi se uzimaju u prvim danima bolesti, a drugi u razmaku od 7-10 dana. U ovom slučaju se procjenjuje dinamika povećanja nivoa antitijela.

Dijagnostički značajno povećanje titra antitijela u ispitivanom krvnom serumu je najmanje 4 puta u odnosu na početni nivo. Ovaj fenomen se naziva serokonverzija. Kod rijetkih zaraznih bolesti, kao i virusnog hepatitisa, HIV infekcije i nekih drugih, prisustvo antitijela ukazuje na to da je pacijent zaražen i ima dijagnostičku vrijednost.

Osim određivanja titra antitijela, serološke studije mogu odrediti izotip antitijela. Poznato je da se pri prvom susretu ljudskog tijela s patogenom u akutnom periodu bolesti otkriva brži porast antitijela koja pripadaju IgM, čiji se nivo, dostižući maksimalnu vrijednost, zatim smanjuje. U kasnijim stadijumima bolesti povećava se broj IgG antitela, koja duže perzistiraju i određuju se u periodu rekonvalescencije. Prilikom ponovnog susreta sa patogenom, zbog imunološkog pamćenja, humoralne imunološke reakcije se manifestuju bržom proizvodnjom IgG antitijela, a antitijela klase M se proizvode u malim količinama. Detekcija IgM antitela ukazuje na prisustvo struje infektivnog procesa, i prisustvo IgG antitijela - o prethodnoj infekciji ili imunitetu nakon vakcinacije.

S obzirom na karakteristike primarnog i sekundarnog imunološkog odgovora, analiza omjera IgM- i IgG-antitijela omogućava u nekim slučajevima da se razlikuje stadijum infektivnog procesa (visina bolesti, rekonvalescencija, recidiv). Na primjer, u slučaju virusnog hepatitisa A (HA), pouzdana dijagnostička metoda je određivanje anti-HAV IgM antitijela u krvnom serumu. Njihovo otkrivanje ukazuje na trenutnu ili nedavnu infekciju HAV-om.

Serološko testiranje za otkrivanje antitijela u zarazne bolesti je više pristupačna metoda laboratorijska dijagnoza nego izolacija patogena. Ponekad je pozitivna serološka reakcija jedini dokaz o susretu i interakciji organizma sa uzročnikom odgovarajuće zarazne bolesti. Osim toga, brojne bolesti sa sličnom kliničkom slikom (npr. rikecioza, enterovirusne infekcije) mogu se samo serološki diferencirati, što odražava važnost seroloških metoda u dijagnostici zaraznih bolesti.

Podijeli: