Reacciones de inmunodiagnóstico. Reacciones antígeno-anticuerpo y reacciones con componentes marcados. Uso para fines de identificación y diagnóstico microbiano. enfermedades infecciosas.

Las reacciones inmunes se utilizan en estudios diagnósticos e inmunológicos en pacientes y gente sana. Para ello utilizan métodos serológicos (del lat. suero - suero y logotipos - enseñanza), es decir, métodos para estudiar anticuerpos y antígenos utilizando reacciones antígeno-anticuerpo determinadas en suero sanguíneo y otros fluidos, así como en tejidos corporales.

La detección de anticuerpos contra antígenos patógenos en el suero sanguíneo del paciente permite realizar un diagnóstico de la enfermedad. Los estudios serológicos también se utilizan para identificar antígenos microbianos, diversas sustancias biológicamente activas, grupos sanguíneos, antígenos tisulares y tumorales, complejos inmunes, receptores celulares, etc.

Cuando se aísla un microbio de un paciente, el patógeno se identifica estudiándolo propiedades antigénicas utilizando sueros de diagnóstico inmunológico, es decir, sueros sanguíneos de animales hiperinmunizados que contienen anticuerpos específicos. Este es el llamado identificación serológica microorganismos.

En microbiología e inmunología, se utilizan ampliamente las reacciones de aglutinación, precipitación, neutralización, reacciones que involucran el complemento, utilizando anticuerpos y antígenos marcados (radioinmunológicos, inmunoensayo enzimático, métodos inmunofluorescentes). Las reacciones enumeradas difieren en el efecto registrado y la técnica de producción, sin embargo, todas son básicas. se basan en la reacción de interacción del antígeno con el anticuerpo y se utilizan para detectar tanto anticuerpos como antígenos. Las reacciones inmunes se caracterizan por una alta sensibilidad y especificidad.

A continuación se detallan los principios y esquemas de inmunología básica. reacciones diagnósticas. Técnica de detalle La formulación de reacciones se da en. Directrices prácticas para el inmunodiagnóstico.

Reacción de aglutinación - RA(del lat. aglutinar- nación- adhesión) es una reacción simple en la que los anticuerpos se unen a antígenos corpusculares (bacterias, eritrocitos u otras células, partículas insolubles con antígenos adsorbidos en ellas, así como agregados macromoleculares). Ocurre en presencia de electrolitos, por ejemplo, cuando se añade una solución isotónica de cloruro de sodio.

Se utilizan varias opciones para la reacción de aglutinación: extensiva, indicativa, indirecta, etc. La reacción de aglutinación se manifiesta por la formación de escamas o sedimentos.

La RA se utiliza para:

determinación de anticuerpos en el suero sanguíneo de pacientes, por ejemplo, con brucelosis (reacciones de Wright, Heddelson), fiebre tifoidea y fiebre paratifoidea (reacción de Vidal) y otras enfermedades infecciosas;

determinación del patógeno aislado del paciente;

determinación de grupos sanguíneos mediante anticuerpos monoclonales contra aloantígenos de eritrocitos.

Para determinar anticuerpos en un paciente. ponerreacción de aglutinación detallada: añadir a las diluciones del suero sanguíneo del paciente diagnóstico(suspensión de microbios muertos) y después de varias horas de incubación a 37 °C, se observa la dilución sérica más alta (título sérico), en la que se produjo la aglutinación, es decir, se formó un precipitado.

La naturaleza y la velocidad de la aglutinación dependen del tipo de antígeno y anticuerpos. Un ejemplo son las peculiaridades de la interacción de los diagnósticos (antígenos O y R) con anticuerpos específicos. Reacción de aglutinación con O-diagnóstico(bacterias muertas por el calor, reteniendo calor-estable antígeno O) Se produce en forma de aglutinación de grano fino. La reacción de aglutinación con H-diagnosticum (bacterias muertas por formaldehído que retienen el antígeno H flagelar termolábil) es burda y avanza más rápido.

Si es necesario determinar el patógeno aislado del paciente, poner reacción de aglutinación indicativa, utilizando anticuerpos de diagnóstico (suero aglutinante), es decir, se realiza la serotipación del patógeno. Se lleva a cabo una reacción indicativa sobre un portaobjetos de vidrio. Se añade un cultivo puro del patógeno aislado del paciente a una gota de suero aglutinante de diagnóstico en una dilución de 1:10 o 1:20. Se coloca un control cerca: en lugar de suero, se aplica una gota de solución de cloruro de sodio. Cuando aparece un sedimento floculento en una gota que contiene suero y microbios, se reacción de aglutinación extensa en tubos de ensayo con diluciones crecientes de suero aglutinante, a los que se añaden 2-3 gotas de la suspensión del patógeno. La aglutinación se tiene en cuenta por la cantidad de sedimento y el grado de claridad del líquido. La reacción se considera positiva si se observa aglutinación en una dilución cercana al título del suero de diagnóstico. Al mismo tiempo, se tienen en cuenta los controles: el suero diluido con una solución isotónica de cloruro de sodio debe ser transparente, la suspensión de microbios en la misma solución debe estar uniformemente turbia, sin sedimentos.

Diferentes bacterias relacionadas pueden ser aglutinadas por un mismo suero aglutinante diagnóstico, lo que dificulta su identificación. Por eso usan sueros aglutinantes adsorbidos, de los cuales se han eliminado los anticuerpos de reacción cruzada mediante adsorción a bacterias relacionadas. Estos sueros retienen anticuerpos que son específicos únicamente de una bacteria determinada. A. Castellani (1902) propuso la producción de sueros aglutinantes de diagnóstico monorreceptores especiales.

Reacción de hemaglutinación indirecta (pasiva) (RNGA, RPGA) se basa en el uso de eritrocitos con antígenos o anticuerpos adsorbidos en su superficie, cuya interacción con los anticuerpos o antígenos correspondientes del suero sanguíneo hace que los eritrocitos se peguen y caigan al fondo de la prueba. tubo o celda V en forma de sedimento festoneado (Fig. 13.2). En caso de reacción negativa, los glóbulos rojos se depositan ■ en forma de “botón”. Normalmente, los anticuerpos se detectan en el RNGA mediante un diagnóstico de eritrocitos antigénico, que son eritrocitos con adsorbidos. en con antígenos. A veces se utilizan diagnósticos de eritrocitos con anticuerpos, en los que se adsorben los anticuerpos. Por ejemplo, la toxina botulínica se puede detectar agregándole toxina botulínica de anticuerpos eritrocitarios (esta reacción se llama reacción de hemaglutinación indirecta inversa- RONG). RNGA se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas y determinar la hormona gonadotrópica. V orina al establecer el embarazo, para detectar hipersensibilidad A medicamentos, hormonas y en algunos otros casos.

Reacción de coaglutinación . Las células patógenas se determinan utilizando estafilococos pretratados con suero de diagnóstico inmunológico. Estafilococos que contienen proteínas. A, tener afinidad por fc - fragmento de inmunoglobulinas que adsorben de forma inespecífica anticuerpos antimicrobianos, que luego interactúan con centros activos con los microbios correspondientes aislados de los pacientes. Como resultado de la coaglutinación, se forman escamas que consisten en estafilococos, anticuerpos séricos de diagnóstico y el microbio detectado.

Reacción de inhibición de la hemaglutinación. (RTGA) se basa en el bloqueo, la supresión de los antígenos virales mediante anticuerpos séricos inmunes, como resultado de lo cual los virus pierden su capacidad para aglutinar glóbulos rojos (fig. 13.3). RTGA se utiliza para diagnosticar muchas enfermedades virales, cuyos agentes causantes (virus de la influenza, sarampión, rubéola, encefalitis transmitida por garrapatas, etc.) pueden aglutinar los glóbulos rojos de varios animales.

Reacción de aglutinación para determinar los grupos sanguíneos. se utiliza para establecer el sistema ABO (ver sección 10.1.4.1) mediante la aglutinación de glóbulos rojos con anticuerpos séricos inmunes contra los antígenos del grupo sanguíneo A (II), B (III). El control es: suero que no contiene anticuerpos, es decir suero AB (GU) tipos de sangre; antígenos contenidos en los glóbulos rojos de los grupos A (II), B (III). El control negativo no contiene antígenos, es decir, se utilizan eritrocitos del grupo 0 (I).

EN reacciones de aglutinación para determinar el factor Rh(ver sección 10.1.4.1) utilizar sueros anti-Rhesus (al menos dos series diferentes). Si hay un antígeno Rh en la membrana de los eritrocitos en estudio, se produce la aglutinación de estas células. Como control sirven eritrocitos estándar Rh positivos y Rh negativos de todos los grupos sanguíneos.

Reacción de aglutinación para determinar anticuerpos anti-Rhesus ( reacción indirecta Coombs)utilizado en pacientes con hemólisis intravascular. En algunos de estos pacientes se detectan anticuerpos anti-Rhesus, que son incompletos y monovalentes. Interactúan específicamente con los eritrocitos Rh positivos, pero no provocan su aglutinación. La presencia de tales anticuerpos incompletos se determina mediante la prueba de Coombs indirecta. Para ello, se añade suero antiglobulina (anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas) al sistema de anticuerpos anti-Rh + eritrocitos Rh positivos, lo que provoca la aglutinación de los eritrocitos (fig. 13.4). Utilizando la reacción de Coombs, se diagnostican afecciones patológicas asociadas con la lisis intravascular de eritrocitos de origen inmunológico, por ejemplo, enfermedad hemolítica del recién nacido: los eritrocitos de un feto Rh positivo se combinan con anticuerpos incompletos contra el factor Rh que circula en la sangre, que tienen pasó a través de la placenta de una madre Rh negativa.

Reacciones de precipitación

Reacción de precipitación - RP (delat. praecipito- precipitado): esta es la formación y precipitación de un complejo de antígeno molecular soluble con anticuerpos en forma de turbidez, llamado precipitado. Se forma mezclando antígenos y anticuerpos en cantidades equivalentes; un exceso de uno de ellos reduce el nivel de formación de complejos inmunes.

Las reacciones de precipitación se realizan en tubos de ensayo. (reacción de precipitación del anillo), en geles, medios nutritivos, etc. Se han generalizado diversas reacciones de precipitación en geles semilíquidos de agar o agarosa: Doble inmunodifusión según Ouchterlony. inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis y etc.

Reacción de precipitación en anillo . La reacción se lleva a cabo en tubos de precipitación estrechos con suero inmune, sobre los cuales se coloca un antígeno soluble. Con una proporción óptima de antígeno y anticuerpos, se forma un anillo opaco de precipitado en el borde de estas dos soluciones (fig. 13.5). Un exceso de antígeno no afecta el resultado de la reacción de precipitación del anillo debido a la difusión gradual de los reactivos hacia el límite líquido. Si se utilizan extractos acuosos de órganos o tejidos hervidos y filtrados como antígenos en la reacción de precipitación del anillo, entonces esta reacción se llama reacción de termoprecipitación (reacción de Ascoli, con ántrax/

Doble reacción de inmunodifusión según Ouchteruny . Para preparar la reacción, se vierte gel de agar derretido en una capa fina sobre una placa de vidrio y, después de que se endurezca, se cortan pocillos de 2 a 3 mm de tamaño. Los antígenos y los sueros inmunes se colocan por separado en estos pocillos, que se difunden entre sí. En el punto de encuentro, en proporciones equivalentes, forman un precipitado en forma de franja blanca. En los sistemas multicomponente, aparecen varias líneas de precipitado entre los pocillos con diferentes antígenos y anticuerpos séricos; para antígenos idénticos, las líneas de precipitado se fusionan; para los no idénticos, se cruzan (Fig. 13.6).

Reacción de inmunodifusión radial . Se vierte uniformemente suero inmunológico con gel de agar fundido sobre el vaso. Después de la solidificación en el gel, se hacen pocillos en los que se coloca el antígeno. varias diluciones. El antígeno, al difundirse en el gel, forma zonas de precipitación en forma de anillo alrededor de los pocillos con anticuerpos (fig. 13.7). El diámetro del anillo de precipitación es proporcional a la concentración de antígeno. La reacción se utiliza para determinar el contenido en la sangre de inmunoglobulinas de diversas clases, componentes del sistema del complemento, etc.

Inmunoelectroforesis- una combinación de electroforesis e inmunoprecipitación: se introduce una mezcla de antígenos en los pocillos del gel y se separan en el gel mediante electroforesis. Luego, se introduce suero inmune en el surco paralelo a las zonas de electroforesis, cuyos anticuerpos, al difundirse en el gel, forman líneas de precipitación en el punto de encuentro con el antígeno.

Reacción de floculación(según Ramón) (del lat. floco - copos de lana): la aparición de opalescencia o masa floculenta (inmunoprecipitación) en un tubo de ensayo durante una reacción de toxina-antitoxina o toxoide-antitoxina. Se utiliza para determinar la actividad del suero o toxoide antitóxico.

Microscopía electrónica inmune- microscopía electrónica de microbios, a menudo virus, tratados con anticuerpos adecuados. Los virus tratados con suero inmune forman agregados inmunes (microprecipitados). Alrededor de los viriones se forma una “corola” de anticuerpos, en contraste con el ácido fosfotúngstico u otras preparaciones electrónicamente densas.

Reacciones que involucran complemento

Reacciones que involucran complementose basan en la activación del complemento por el complejo antígeno-anticuerpo (reacción de fijación del complemento, hemólisis radial, etc.).

Reacción de fijación del complemento (RSK) es que cuando los antígenos y los anticuerpos se corresponden entre sí, forman un complejo inmunológico, al cual, a través de fc -El fragmento de anticuerpo está unido al complemento (C), es decir, el complemento está unido al complejo antígeno-anticuerpo. Si no se forma el complejo antígeno-anticuerpo, el complemento permanece libre (fig. 13.8). RSK se lleva a cabo en dos fases: 1ª fase: incubación de una mezcla que contiene tres componentes antígeno + anticuerpo + complemento; Segunda fase (indicador): detección del complemento libre en la mezcla agregándole un sistema hemolítico que consiste en eritrocitos de oveja y suero hemolítico que contiene anticuerpos contra ellos. En la primera fase de la reacción, cuando se forma el complejo antígeno-anticuerpo, el complemento se une y luego, en la segunda fase, no se producirá hemólisis de los eritrocitos sensibilizados por los anticuerpos; la reacción es positiva. Si el antígeno y el anticuerpo no coinciden (no hay antígeno ni anticuerpo en la muestra de prueba), el complemento permanece libre y en la segunda fase se unirá al complejo eritrocito-anticuerpo antieritrocito, provocando hemólisis; la reacción es negativa.

RSC se utiliza para diagnosticar muchas enfermedades infecciosas, en particular la sífilis (reacción de Wassermann).

Reacción de hemólisis radial (RRH) ) colocados en los pocillos de un gel de agar que contiene glóbulos rojos de oveja y complemento. Después de introducir suero hemolítico (anticuerpos contra glóbulos rojos de oveja) en los pocillos del gel, se forma una zona de hemólisis a su alrededor (como resultado de la difusión radial de anticuerpos). De esta forma, es posible determinar la actividad del complemento y del suero hemolítico, así como de los anticuerpos en el suero sanguíneo de pacientes con influenza, rubéola y encefalitis transmitida por garrapatas. Para ello, los antígenos correspondientes del virus se adsorben en los eritrocitos y se añade suero sanguíneo del paciente a los pocillos del gel que contiene estos eritrocitos. Los anticuerpos antivirales interactúan con los antígenos virales adsorbidos en los glóbulos rojos, después de lo cual

Luego los componentes del complemento se unen a este complejo, provocando hemólisis.

Reacción de inmunoadherencia (IAR) ) Se basa en la activación del sistema del complemento mediante antígenos corpusculares (bacterias, virus) tratados con suero inmune. Como resultado, se forma un tercer componente activado del complemento (C3b), que se une al antígeno corpuscular como parte del complejo inmunológico. Los eritrocitos, plaquetas y macrófagos tienen receptores para C3b, por lo que, cuando estas células se mezclan con complejos inmunes que transportan C3b, se combinan y aglutinan.

Reacción de neutralización

Los anticuerpos del suero inmunológico son capaces de neutralizar el efecto dañino de los microbios o sus toxinas en células y tejidos sensibles, lo que está asociado con el bloqueo de los antígenos microbianos por parte de los anticuerpos, es decir. neutralización. Reacción de neutralización(RN) se lleva a cabo mediante la introducción de una mezcla de antígeno y anticuerpo en animales o en objetos de prueba sensibles (cultivos celulares, embriones). En ausencia de los efectos dañinos de los microorganismos o sus antígenos o toxinas en animales y objetos de prueba, se habla del efecto neutralizante del suero inmune y, en consecuencia, de la especificidad de la interacción del complejo antígeno-anticuerpo (fig. 13.9).

Reacción de inmunofluorescencia - RIF (método de Coons)

Hay tres tipos principales de método: directo, indirecto (fig. 13.10) y con complemento. La reacción de Koons es un método de diagnóstico rápido para identificar antígenos microbianos o determinar anticuerpos.

Método RIF directo se basa en el hecho de que los antígenos tisulares o microbios tratados con sueros inmunes con anticuerpos marcados con fluorocromos pueden brillar con los rayos ultravioleta de un microscopio fluorescente.

Las bacterias en un frotis tratado con un suero luminiscente brillan a lo largo de la periferia de la célula en forma de un borde verde.

Método RIF indirecto Consiste en identificar el complejo antígeno-anticuerpo mediante suero antiglobulina (antianticuerpo) marcado con fluorocromo. Para ello, se tratan frotis de una suspensión de microbios con anticuerpos procedentes de suero de diagnóstico antimicrobiano de conejo. Luego se lavan los anticuerpos que no están unidos a los antígenos microbianos y los anticuerpos que quedan en los microbios se detectan tratando el frotis con suero antiglobulina (anti-conejo) marcado con fluorocromos. Como resultado, se forma un complejo de microbio + anticuerpos antimicrobianos de conejo + anticuerpos anticonejo marcados con fluorocromo. Este complejo se observa en un microscopio fluorescente, como en el método directo.

Método o análisis inmunoabsorbente enzimático (ELISA)

ELISA-detección de antígenos utilizando sus correspondientes anticuerpos conjugados con una enzima etiqueta (peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina). Después de combinar el antígeno con el suero inmune marcado con enzima, se añade el sustrato/cromógeno a la mezcla. La enzima escinde el sustrato y el color del producto de reacción cambia: la intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de moléculas de antígeno y anticuerpo unidas.

ELISA en fase sólida - la variante más común de una prueba inmunológica, cuando uno de los componentes de la reacción inmune (antígeno o anticuerpos) se absorbe en un soporte sólido, por ejemplo, en pocillos de placas de poliestireno.

Al determinar los anticuerpos, a los pocillos de las placas con antígeno absorbido se añaden secuencialmente el suero sanguíneo del paciente, el suero antiglobulina marcado con una enzima y un sustrato (cromógeno) para la enzima.

Cada vez que se añade otro componente, los reactivos no unidos se eliminan de los pocillos mediante un lavado minucioso. Si el resultado es positivo, el color de la solución de cromógeno cambia. Un portador en fase sólida puede sensibilizarse no solo con antígeno, sino también con anticuerpos. Luego se agrega el antígeno deseado a los pocillos con anticuerpos absorbidos, se agrega suero inmune contra el antígeno marcado con una enzima y luego se agrega un sustrato para la enzima.

Opción ELISA competitiva . el antígeno diana y el antígeno marcado con enzima compiten entre sí para unirse a una cantidad limitada de anticuerpos séricos inmunes. Otra prueba: los anticuerpos que buscas

y los anticuerpos marcados compiten entre sí por los antígenos.

Método o análisis radioinmunológico (RIA)

Método muy sensible basado en la reacción antígeno-anticuerpo utilizando antígenos o anticuerpos marcados con radionúclidos (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, etc.). Después de su interacción, el complejo inmune radiactivo resultante se separa y se determina su radiactividad en el contador apropiado (radiación beta o gamma):

la intensidad de la radiación es directamente proporcional al número de moléculas de antígeno y anticuerpo unidas.

En versión RIA de fase sólida Uno de los componentes de la reacción (antígeno o anticuerpos) se absorbe en un soporte sólido, por ejemplo, en pocillos de micropaneles de poliestireno. Otra opción de método es RIA competitiva. el antígeno deseado y el antígeno marcado con radionúclido compiten entre sí para unirse a una cantidad limitada de anticuerpos séricos inmunes. Esta opción se utiliza para determinar la cantidad de antígeno en el material de prueba.

RIA se utiliza para identificar antígenos microbianos, determinar hormonas, enzimas, sustancias medicinales e inmunoglobulinas, así como otras sustancias contenidas en el material de prueba en concentraciones menores - 10~ |0 -10~ 12 g/l. El método presenta un cierto riesgo medioambiental.

inmunotransferencia

Inmunotransferencia (IB)- un método altamente sensible basado en una combinación de electroforesis y ELISA o RIA.

El antígeno se aísla mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida y luego se transfiere (transferencia, del inglés). mancha, colorante) del gel sobre papel activado o membrana de nitrocelulosa y revelado usando ELISA. Las empresas producen este tipo de tiras con "blots"

antígenos. Sobre estas tiras se aplica el suero del paciente. Luego, después de la incubación, se lava al paciente para quitarle los anticuerpos no unidos y se le aplica suero contra inmunoglobulinas humanas marcadas con una enzima. El complejo antígeno + anticuerpo del paciente + anticuerpo contra Ig humana formado en la tira se detecta añadiendo un sustrato/cromógeno que cambia de color bajo la acción de una enzima (fig. 13.12).

El IB se utiliza como método de diagnóstico de la infección por VIH, etc.

Reacción de aglutinación Reacción de aglutinación

(RA) es un método para identificar y cuantificar Ag y Ab, basado en su capacidad para formar aglomerados visibles a simple vista. En el departamento de enfermedades infecciosas. enfermedades o para otros fines se utiliza para identificar microbios y células desconocidos, para determinar la presencia y cantidad de Ab en la sangre y otros líquidos. El principio de determinación se basa en la especificidad de la interacción entre Ag y Ab y consiste en encontrar lo conocido a partir de lo desconocido. Hay muchas opciones para la AR: métodos cuantitativos y cualitativos, en tubo de ensayo y de vidrio, volumétricos y en gotas, convencionales, acelerados y exprés. Para estadificar la AR necesita: 1) sangre s-ka. En la variante con determinación del tipo (var) de bacteria, se utilizan pruebas de aglutinación industrial, realizadas mediante la inmunización de conejos. En la variante con determinación del tipo de Ab, del test se extrae una muestra de sangre. personas o animales. La solución debe ser estéril y libre de partículas en suspensión. Preparar la dilución básica en solución salina. Debe ser de 2 a 4 veces menor que el título de diagnóstico de esta enfermedad; 2) Ag. En la versión de reacción con determinación del tipo Ab se utilizan kits de diagnóstico industrial; en la variante con determinación de Ag, los diagnósticos se preparan ellos mismos en forma de una suspensión de 1 a 3 mil millones en una solución salina de agar de 18 a 20 horas (con menos frecuencia caldo). microbio inactivado calentándolo en un baño de agua a 70°C durante 1 hora o mediante incubación de 24 horas a 37°C con formaldehído (concentración final 0,2%); 3) electrolito en forma de solución salina. Técnica de puesta en escena tubo serie volumétrico RA para determinar el título de Ab en s-ki: se preparan varias filas de diluciones de trabajo a partir de la dilución principal de s-ki. El número de filas depende del número de diagnósticos tomados en el experimento; el número y los factores de dilución están determinados por el título diagnóstico de la enfermedad sospechada. La serie debe contener al menos una dilución correspondiente al título de Ab diagnóstico, dos diluciones por debajo y dos diluciones por encima. por ejemplo, si el título diagnóstico es 1:100, entonces con el método volumétrico de estadificación de la AR se deben preparar las siguientes diluciones: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; con el goteo método, la primera dilución (1:25) no es necesaria, pero se requiere otra dilución más alta: 1:800 B. investigación científica s-ku se titula ante una reacción negativa. Se diluye de la siguiente manera: se vierten 0,25 ml de solución salina en todos los tubos, excepto en el primero, cuando la reacción se realiza en un volumen de 0,5 ml, y 0,5 ml cuando la reacción se realiza en un volumen de 1 ml. Vierta 0,25 (0,5) ml de la dilución principal en el 1.º y 2.º tubo de ensayo, del 2.º tubo de ensayo al volumen cortado y crianza sk y aumentado 2 veces, se transfieren 0,25 (0,5) ml al 3º, del 3º al 4º, etc. hasta el último, del corte se vierten 0,25 (0,5) ml en todo para equilibrar los volúmenes. Cada dilución se realiza utilizando una pipeta separada. Si se llevan a cabo varios diagnósticos, para cada uno de ellos se prepara de la misma manera su propia serie de diluciones. Se agrega Diagnosticum a cada dilución del tubo de ensayo en un volumen igual al volumen del tubo de ensayo, como resultado de lo cual se duplica la dilución en cada tubo de ensayo. El experimento corresponde al control s-ki (0,25 - 0,5 ml de la dilución principal de s-ki y la misma cantidad de solución salina) y al control Ag (0,25 - 0,5 ml de diagnosticum y la misma cantidad de solución salina). Si se utilizan varios diagnósticos en el experimento, cada uno tiene su propio control de antígeno. La gradilla con los tubos de ensayo se agita bien y se coloca en un termostato a 37°C durante 4 horas, y luego se deja a temperatura ambiente hasta que Día siguiente, tras lo cual se tiene en cuenta la RA, en función de la cantidad de sedimento y del grado de claridad del líquido. La determinación de estos indicadores, dependiendo de la naturaleza de los aglutinados, se realiza a simple vista sobre un fondo oscuro, en un aglutinoscopio o sobre la superficie cóncava de un espejo microscópico. La contabilidad comienza con los controles: el control C debe ser transparente, Ag debe estar uniformemente turbio (después de agitar el tubo). Si los controles son buenos, establezca la presencia y el grado de aglutinación en todos los tubos de ensayo, que están designados con ventajas: sedimento grande y aclaramiento completo del líquido - 4 ventajas; sedimento grande y limpieza incompleta del líquido: 3 ventajas; Un sedimento notable y un aclaramiento notable del líquido son 2 ventajas. Después de eso, se determina el título: la dilución más alta con una intensidad de aglutinación de al menos 2 plus. investigación de títulos s-ki se comparan con el título de diagnóstico de esta enfermedad. Si se examina el título. s-ki es 2 veces menor que el valor de diagnóstico, la reacción se evalúa como dudosa; si el título es igual al diagnóstico, como débilmente positivo; si es de 2 a 4 veces mayor, se considera positivo; si es 8 o más veces mayor, se considera marcadamente positivo; Cuando Ab está muy extendido en personas sanas, se utiliza un aumento en el título de Ab para evaluar la AR. Para determinar el tipo de Ar en la serie RA, el número de filas debe corresponder al número tomado para la identificación. pruebas de diagnóstico. A partir de la dilución principal de la prueba diagnóstica, se preparan una serie de diluciones dobles sucesivas de la misma forma que en la AR para determinar el título de Ab. Los factores de dilución dependen del título de la prueba aglutinante. En el experimento, es necesaria la presencia de una dilución igual al título de la prueba, así como 2, 4, 6, 8 veces menor que éste, por ejemplo. El título de la prueba de diagnóstico es 1 3200, entonces se deben usar diluciones 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200. Se agrega el mismo volumen de Ag probado a las diluciones de la prueba, como resultado, la dilución de la prueba se multiplica por 2. Se agregan 2 controles de prueba y Ag al experimento. Si en el experimento participan varios s-k, cada uno de ellos necesita su propio control. Al finalizar la reacción, el soporte se agita vigorosamente y se coloca. en un termostato a 37 ° C. Los resultados se tienen en cuenta como se describe anteriormente. La evaluación de la reacción tiene características para sacar una conclusión sobre el cumplimiento del estudio. Ag tomado en el experimento, el título de la reacción debe corresponder al menos a la mitad del título de la prueba de diagnóstico estándar. Los títulos de 1 4 e inferiores se consideran una reacción grupal. goteo md La estadificación de la RA se diferencia de la volumétrica en que s-ku se diluye en un volumen de 1 ml, se utiliza Ag en una concentración más alta (10 mil millones/ml) y se añade 1 - 2 gotas en un tubo de ensayo La dilución del fármaco después de agregar Ag se considera sin cambios. De lo contrario, el método de configuración, registro y evaluación es similar al método volumétrico.

(Fuente: Diccionario de términos de microbiología)

Reacción de aglutinación (del lat. aglutinación- pegado) - pegado de corpúsculos (bacterias, glóbulos rojos, etc.) mediante anticuerpos en presencia de electrolitos.

Reacción de aglutinación se manifiesta en forma de escamas o sedimentos que consisten en corpúsculos (por ejemplo, bacterias) "pegados" por anticuerpos (fig. 7.37). La reacción de aglutinación se utiliza para: determinar el patógeno aislado del paciente; determinación de anticuerpos en el suero sanguíneo del paciente; determinación de grupos sanguíneos.

Arroz. 7.37 a, b. Reacción de aglutinación conIgM-anticuerpos (a) yIgG-anticuerpos (b)

1. Determinación del patógeno aislado del paciente. Reacción de aglutinación aproximada sobre vidrio (fig. 7.38). Se añade una suspensión de bacterias aisladas del paciente a una gota de suero aglutinante (dilución 1:20). Se forma un precipitado floculento.

Arroz. 7.38.

Una reacción de aglutinación extensa con un patógeno aislado de un paciente (fig. 7.39). A las diluciones del suero aglutinante se les añade una suspensión de bacterias aisladas del paciente.

Arroz. 52

2. Determinación de anticuerpos en el suero sanguíneo del paciente.
Reacción de aglutinación detallada con el suero sanguíneo del paciente (fig. 7.39). Diagnosticum se añade a las diluciones del suero del paciente.
- La aglutinación con O-diagnosticum (bacterias muertas por el calor que retienen el antígeno O) se produce en forma de aglutinación de grano fino.
- La aglutinación con H-diagnosticum (bacterias muertas por el formaldehído que retienen el antígeno H flagelar) es grande y ocurre más rápido.
3. Reacción de aglutinación para determinar los grupos sanguíneos. La reacción de aglutinación para determinar los grupos sanguíneos se utiliza para establecer el sistema ABO (Tabla b) mediante la aglutinación de eritrocitos con anticuerpos séricos inmunes contra los antígenos de los grupos sanguíneos A (I), B (III). El control es: suero que no contiene anticuerpos, es decir. grupo sanguíneo AB (IV) en suero; antígenos contenidos en los glóbulos rojos de los grupos A (II), B (III). El control negativo no contiene antígenos, es decir, se utilizan eritrocitos del grupo O (I).

Tabla 7.6. Determinación de los grupos sanguíneos ABO.

1.1. REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN (RA)

REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN (RA)

Debido a su especificidad, facilidad de ejecución y demostratividad, la reacción de aglutinación se ha generalizado en la práctica microbiológica para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas.

La reacción de aglutinación se basa en la especificidad de la interacción de los anticuerpos (aglutininas) con células microbianas enteras u otras células (aglutinógenos). Como resultado de esta interacción se forman partículas y aglomerados que precipitan (aglutinan) en forma de escamas.

La reacción de aglutinación puede involucrar tanto bacterias vivas como muertas, espiroquetas, hongos, protozoos, rickettsias, así como glóbulos rojos y otras células. La reacción se produce en dos fases: la primera (invisible) específica, la combinación de antígeno y anticuerpos, la segunda (visible) no específica, la unión de antígenos, es decir. formación de aglutinados.

Un aglutinado se forma cuando uno centro activo Anticuerpo divalente con un grupo de antígeno determinante. La reacción de aglutinación, como cualquier reacción serológica, se produce en presencia de electrolitos.

Externamente, la manifestación de una reacción de aglutinación positiva tiene un doble carácter. En los microbios flagelados que sólo tienen antígeno O2 somático, las propias células microbianas se unen directamente. Esta aglutinación se llama de grano fino. Ocurre dentro de las 18 22 horas. v

Los microbios flagelados tienen dos antígenos: el antígeno O2 somático y el antígeno H2 flagelar. Si las células se unen mediante flagelos, se forman escamas grandes y sueltas y esta reacción de aglutinación se denomina de grano grueso. Ocurre dentro de 2 a 4 horas.

La reacción de aglutinación se puede realizar tanto para la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos específicos en el suero sanguíneo del paciente como para determinar la especie del patógeno aislado. v

La reacción de aglutinación se puede realizar tanto en una versión ampliada, que permite trabajar con suero diluido hasta un título de diagnóstico, como en una versión de reacción indicativa, que permite, en principio, detectar anticuerpos específicos o determinar la especie del patógeno.

Al realizar una reacción de aglutinación detallada, para detectar anticuerpos específicos en el suero sanguíneo del sujeto, el suero problema se toma en una dilución de 1:50 o 1:100. Esto se debe al hecho de que los anticuerpos normales pueden estar presentes en concentraciones muy altas en el suero entero o ligeramente diluido, y entonces los resultados de la reacción pueden ser inexactos. El material que se prueba en esta versión de la reacción es la sangre del paciente.

La sangre se extrae con el estómago vacío o no antes de 6 horas después de una comida (de lo contrario, pueden aparecer gotas de grasa en el suero sanguíneo, lo que lo vuelve turbio y no apto para la investigación). El suero sanguíneo del paciente generalmente se obtiene en la segunda semana de la enfermedad, recogiendo 3 × 4 ml de sangre de forma estéril de la vena cubital (en este momento se concentra la cantidad máxima de anticuerpos específicos). Como antígeno conocido se utiliza un diagnóstico preparado a partir de células microbianas muertas pero no destruidas de una especie específica con una estructura antigénica específica.

Cuando se realiza una reacción de aglutinación detallada para determinar la especie y el tipo de patógeno, el antígeno es un patógeno vivo aislado del material en estudio. Se conocen los anticuerpos contenidos en el suero de diagnóstico inmunológico. v

El suero de diagnóstico inmunológico se obtiene de la sangre de un conejo vacunado. Una vez determinado el título (la dilución máxima a la que se detectan los anticuerpos), el suero de diagnóstico se vierte en ampollas con la adición de un conservante. Este suero se utiliza para la identificación mediante la estructura antigénica del patógeno aislado.

OPCIONES DE LA REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN

En estas reacciones intervienen antígenos en forma de partículas (células microbianas, glóbulos rojos y otros antígenos corpusculares), que se unen mediante anticuerpos y precipitan.

Para realizar una reacción de aglutinación (AR), se requieren tres componentes: 1) antígeno (aglutinógeno); 2) anticuerpo (aglutinina) y 3) electrolito (solución isotónica de cloruro de sodio).

REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN (RA) ORIENTATIVA (PLACA)

Se coloca una AR indicativa o en placa sobre un portaobjetos de vidrio a temperatura ambiente. Para hacer esto, use una pipeta Pasteur para aplicar por separado una gota de suero en una dilución de 1:10 a 1:20 y una gota de control de solución isotónica de cloruro de sodio sobre el vaso. Se introducen colonias o un cultivo diario de bacterias (una gota de diagnosticum) en ambos asas bacteriológicas y se mezclan bien. Las reacciones se tienen en cuenta visualmente al cabo de unos minutos, a veces utilizando una lupa (x5). Con AR positivo, se nota la aparición de escamas grandes y pequeñas en una gota de suero; con AR negativo, el suero permanece uniformemente turbio;

REACCIÓN DE HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (PASIVA) (RNGA, RPGA)

La reacción se realiza: 1) para detectar polisacáridos, proteínas, extractos de bacterias y otras sustancias altamente dispersas, rickettsias y virus, cuyos complejos con aglutininas no se pueden observar en la AR convencional, o 2) para detectar anticuerpos en el suero de pacientes contra estas sustancias altamente dispersas y los microorganismos más pequeños.

Se entiende por aglutinación indirecta o pasiva una reacción en la que los anticuerpos interactúan con antígenos preadsorbidos en partículas inertes (látex, celulosa, poliestireno, óxido de bario, etc. o eritrocitos de oveja, grupo sanguíneo humano I(0)).

En la reacción de hemaglutinación pasiva (RPHA), los glóbulos rojos se utilizan como portador. Los glóbulos rojos cargados de antígeno se unen en presencia de anticuerpos específicos contra este antígeno y precipitan. Los eritrocitos sensibilizados a antígenos se utilizan en RPGA como diagnóstico de eritrocitos para la detección de anticuerpos (serodiagnóstico). Si los glóbulos rojos están cargados de anticuerpos (diagnóstico de anticuerpos eritrocitarios), se pueden utilizar para detectar antígenos.

Puesta en escena. Se preparan una serie de diluciones seriadas de suero en los pocillos de placas de poliestireno. Añadir 0,5 ml de suero obviamente positivo al penúltimo pocillo y 0,5 ml de solución fisiológica (controles) al último pocillo. Luego agregue 0,1 ml de eritrocitos diagnosticum diluidos a todos los pocillos, agite y coloque en un termostato durante 2 horas v.

Contabilidad. En el caso positivo, los glóbulos rojos se depositan en el fondo del orificio en forma de una capa uniforme de células con un borde doblado o dentado (paraguas invertido; en el caso negativo, se depositan en forma de botón o anillo); .

1.2. REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN. LISIS,
REACCIÓN OPSONOFAGOCÍTICA, REACCIÓN DE HIPERSENSIBILIDAD

REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN DE EXOTOXINA CON ANTITOXINA (RN)

La reacción se basa en la capacidad del suero antitóxico para neutralizar el efecto de la exotoxina. Se utiliza para la valoración de sueros antitóxicos y la determinación de exotoxinas.

Al titular el suero, se añade una determinada dosis de la toxina correspondiente a diferentes diluciones del suero antitóxico. Cuando el antígeno está completamente neutralizado y no quedan anticuerpos no utilizados, se produce la floculación inicial. La reacción de floculación se puede utilizar no sólo para la titulación de suero (por ejemplo, difteria), sino también para la titulación de toxinas y toxoides. La reacción de neutralizar una toxina con una antitoxina tiene una gran significado práctico como método para determinar la actividad de sueros terapéuticos antitóxicos. El antígeno en esta reacción es una verdadera exotoxina.

La fuerza del suero antitóxico se determina mediante unidades convencionales de AE.

1 EA de suero botulínico su cantidad neutraliza 1000 DLM de toxina botulínica. La reacción de neutralización para determinar la especie o tipo de exotoxina (para el diagnóstico de tétanos, botulismo, difteria, etc.) se puede realizar in vitro (según Ramón), y para determinar la toxigenicidad de las células microbianas, en un gel ( según Ouchterlony).

Reacción de lisis (RL)

Una de las propiedades protectoras del suero inmunológico es su capacidad para disolver microbios o elementos celulares que ingresan al cuerpo.

Los anticuerpos específicos que provocan la disolución celular (lisis) se denominan lisinas. Dependiendo de la naturaleza del antígeno, pueden ser bacteriolisinas, citolisinas, espiroquetalisinas, hemolisinas, etc.

Las lisinas muestran su efecto sólo en presencia de un factor de complemento adicional. El complemento como factor inespecífico inmunidad humoral, que se encuentra en casi todos los fluidos corporales excepto fluido cerebroespinal y líquido de la cámara anterior del ojo. Se observó un contenido bastante alto y constante de complemento en el suero sanguíneo humano y hay mucho en el suero sanguíneo. conejillo de indias. En otros mamíferos, el contenido de complemento en el suero sanguíneo es diferente.

El complemento es un sistema complejo. proteínas de suero. Es inestable y colapsa a 55 grados durante 30 minutos. A temperatura ambiente, el complemento se destruye en dos horas. Muy sensible a sacudidas prolongadas, ácidos y rayos ultravioleta. Sin embargo, el complemento se almacena durante mucho tiempo (hasta seis meses) en estado seco a bajas temperaturas. El complemento promueve la lisis de células microbianas y glóbulos rojos.

Se hace una distinción entre las reacciones de bacteriólisis y hemólisis.

La esencia de la reacción de bacteriólisis es que cuando un suero inmunológico específico se combina con sus correspondientes células microbianas vivas homólogas en presencia de complemento, se produce la lisis microbiana.

La reacción de hemólisis consiste en que cuando los eritrocitos se exponen a un suero específico que les es inmune (hemolítico) en presencia de complemento, se observa la disolución de los eritrocitos, es decir. hemólisis.

La reacción de hemólisis en la práctica de laboratorio se utiliza para determinar el rango del complemento, así como para tener en cuenta los resultados de las reacciones diagnósticas de fijación del complemento. El título del complemento es su cantidad más pequeña, que provoca la lisis de los glóbulos rojos en 30 minutos en un sistema hemolítico en un volumen de 2,5 ml. La reacción de lisis, como todas las reacciones serológicas, se produce en presencia de un electrolito.

REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD (ALÉRGICAS)

Ciertas formas de antígeno, tras el contacto repetido con el cuerpo, pueden provocar una reacción que es específica en su base, pero que incluye factores celulares y moleculares inespecíficos de una respuesta inflamatoria aguda. Hay dos formas conocidas de mayor reactividad: hipersensibilidad tipo inmediato(DHT) y la hipersensibilidad de tipo retardado (DHT). El primer tipo de reacción ocurre con la participación de anticuerpos y la reacción se desarrolla a más tardar 2 horas después del contacto repetido con el alérgeno. El segundo tipo se realiza con la ayuda de las células T inflamatorias (Tgc) como principales efectores de la reacción, asegurando la acumulación de macrófagos en el área de la inflamación; la reacción se manifiesta después de 6-8 horas y más tarde;

El desarrollo de una reacción de hipersensibilidad está precedido por un encuentro con un antígeno y la aparición de sensibilización, es decir, la aparición de anticuerpos, linfocitos sensibilizados activamente y anticuerpos citófilos sensibilizados pasivamente de otros leucocitos (macrófagos, granulocitos).

Las reacciones de hipersensibilidad tienen tres fases de desarrollo: inmunológica; patoquímico; fisiopatológico.

En la primera fase, específica, el alérgeno interactúa con anticuerpos y (o) células sensibilizadas. En la segunda fase se produce la liberación biológica. sustancias activas de células activadas. Los mediadores liberados (histamina, serotonina, leucotrienos, bradiquinina, etc.) provocan diversos efectos periféricos característicos del correspondiente tipo de reacción de la tercera fase.

Reacciones de hipersensibilidad tipo 4

Las reacciones de este tipo son causadas por interacciones intercelulares patógenas de células T colaboradoras sensibilizadas, linfocitos T citotóxicos (células T asesinas) y células activadas del sistema fagocítico mononuclear, causadas por una estimulación prolongada del sistema inmunológico por antígenos bacterianos, lo que provoca una relativa incapacidad. del sistema inmunológico del cuerpo para eliminar del ambiente interno patógenos bacterianos enfermedades infecciosas. Estas reacciones de hipersensibilidad provocan cavidades pulmonares tuberculosas, su necrosis caseosa e intoxicación general en pacientes con tuberculosis. La granulomatosis cutánea en la tuberculosis y la lepra en términos morfopatogenéticos se compone en gran medida de reacciones de hipersensibilidad del cuarto tipo.

El ejemplo más famoso de un cuarto tipo de reacción de hipersensibilidad es la reacción de Mantoux, que se desarrolla en el lugar de la inyección intradérmica de tuberculina a un paciente cuyo cuerpo y sistema están sensibilizados a los antígenos micobacterianos. Como resultado de la reacción, se forma una pápula hiperémica densa con necrosis en el centro, que aparece solo unas horas (lentamente) después de la inyección intradérmica de tuberculina. La formación de una pápula comienza con la salida de lecho vascular en los espacios intercelulares de los fagocitos mononucleares de la sangre circulante. Al mismo tiempo, comienza la emigración de células polimorfonucleares desde el lecho vascular. Luego, la infiltración por neutrófilos cede y el infiltrado comienza a estar formado predominantemente por linfocitos y fagocitos mononucleares. Esto se diferencia de la reacción de Mantoux de la reacción de Arthus, en la que se acumulan predominantemente leucocitos polimorfonucleares en el sitio de la lesión.

En las reacciones de hipersensibilidad de tipo 4, la estimulación prolongada de linfocitos sensibilizados con antígenos conduce a cambios patologicos tejidos a una liberación patológicamente intensa y prolongada de citoquinas por parte de las células T colaboradoras. La intensa liberación de citocinas en los lugares de daño tisular provoca la hiperactivación de las células del sistema de fagocitos mononucleares ubicadas allí, muchas de las cuales, en un estado hiperactivado, forman hebras de células epitelioides y algunas se fusionan entre sí para formar células gigantes. Los macrófagos, en cuya superficie están expuestos los antígenos bacterianos y virales, pueden destruirse mediante el funcionamiento de Tkillers (asesinos naturales).

El cuarto tipo de reacción de hipersensibilidad es inducido por el reconocimiento de un antígeno bacteriano extraño por parte de las células T auxiliares sensibilizadas a él. Una condición necesaria para el reconocimiento es la interacción de los inductores con los antígenos expuestos en la superficie de las células presentadoras de antígenos después de la endocitosis y el procesamiento de inmunógenos extraños por parte de fagocitos mononucleares. Otro condición necesaria exposición de antígenos en combinación con moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad. Después del reconocimiento del antígeno, las células auxiliares sensibilizadas liberan citocinas y, en particular, interleucina2, que activa las células asesinas naturales y los fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares activados liberan enzimas proteolíticas y radicales libres de oxígeno, que dañan el tejido.

Pruebas de alergia cutánea pruebas para establecer la sensibilización del cuerpo a los alérgenos, determinar su nivel de infección, por ejemplo, tuberculosis, brucelosis, la inmunidad de grupo, por ejemplo, a la tularemia. Según el lugar de administración del alérgeno, existen: 1) pruebas cutáneas; 2) escarificación; 3) intradérmico; 4) subcutáneo. La reacción clínica a un alérgeno durante una prueba de alergia cutánea se divide en local, general y focal, así como inmediata y retardada.

Las reacciones locales del tipo mediador GNT ocurren después de 520 minutos, se expresan en forma de eritema y ampolla, desaparecen después de unas horas y se evalúan mediante el método plus por el tamaño del eritema, medido en mm. Las reacciones locales a la TRH ocurren dentro de las 24-48 horas, duran mucho tiempo, aparecen en forma de infiltrado, a veces con necrosis en el centro, y se evalúan por el tamaño del infiltrado en mm, también utilizando el sistema plus. Con los tipos de HNT citotóxicos e inmunocomplejos, la hiperemia y la infiltración se observan después de 3 a 4 horas, alcanzan un máximo a las 6-8 horas y desaparecen después de aproximadamente un día. A veces se observan reacciones combinadas.

1.3. REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (FFR)

Esta reacción se utiliza cuando investigación de laboratorio para la detección de anticuerpos en el suero sanguíneo durante diversas infecciones, así como para identificar el patógeno por su estructura antigénica.

La reacción de fijación del complemento es una reacción serológica compleja y muy sensible y específica.

Una característica de esta reacción es que el cambio en el antígeno durante su interacción con anticuerpos específicos ocurre solo en presencia de complemento. El complemento se adsorbe únicamente en el complejo "anticuerpo antígeno". El complejo “antígeno anticuerpo” se forma sólo si existe afinidad entre el antígeno y el anticuerpo en el suero.

La adsorción del complemento en el complejo “antígeno-anticuerpo” puede tener diferentes efectos sobre el destino del antígeno dependiendo de sus características.

Algunos de los antígenos están sujetos a graves cambios morfológicos, hasta la disolución (hemólisis, fenómeno de Isaev-Pfeiffer, efecto citolítico). Otros cambian la velocidad del movimiento (inmovilización por treponema). Otros mueren sin ningún cambio repentino. cambios destructivos(efecto bactericida o citotóxico). Por último, la adsorción del complemento puede no ir acompañada de cambios antigénicos que sean fácilmente observables.

Según el mecanismo RSC, se produce en dos fases:

1. La primera fase es la formación del complejo “antígeno-anticuerpo” y la adsorción en este complejo del complemento. El resultado de la fase no es visualmente visible (interacción de antígenos y anticuerpos con la participación obligatoria del complemento).
2. La segunda fase es un cambio de antígeno bajo la influencia de anticuerpos específicos en presencia de complemento. El resultado de la fase puede ser visible visualmente o no (detección de los resultados de la reacción mediante un sistema hemolítico indicador (glóbulos rojos de oveja y suero hemolítico).

La destrucción de los glóbulos rojos por el suero hemolítico ocurre sólo si se agrega complemento al sistema hemolítico. Si el complemento se adsorbió previamente en el complejo antígeno-anticuerpo, no se produce hemólisis de los eritrocitos.

El resultado del experimento se evalúa observando la presencia o ausencia de hemólisis en todos los tubos de ensayo. La reacción se considera positiva cuando la hemólisis se retrasa por completo, cuando el líquido del tubo de ensayo es incoloro y los glóbulos rojos se depositan en el fondo, negativa cuando los glóbulos rojos están completamente lisados, cuando el líquido tiene un color intenso ("barniz" sangre). El grado de retraso de la hemólisis se evalúa según la intensidad del color del líquido y el tamaño del sedimento de glóbulos rojos en el fondo (++++, +++, ++, +).

En el caso de que los cambios en el antígeno permanezcan inaccesibles para la observación visual, es necesario utilizar un segundo sistema, que actúa como indicador, permitiendo evaluar el estado del complemento y sacar una conclusión sobre el resultado de la reacción.

Este sistema indicador está representado por los componentes de la reacción de hemólisis, que incluyen eritrocitos de oveja y suero hemolítico, que contiene anticuerpos específicos contra los eritrocitos (hemolisinas), pero no contiene complemento. Este sistema indicador se agrega a los tubos de ensayo una hora después de colocar el RSC principal. Si la reacción de fijación del complemento es positiva, se forma un complejo antígeno-anticuerpo que adsorbe el complemento sobre sí mismo. Dado que el complemento se utiliza en la cantidad necesaria para una sola reacción, y la lisis de los eritrocitos solo puede ocurrir en presencia del complemento, cuando se adsorbe en el complejo "antígeno-anticuerpo", se producirá la lisis de los eritrocitos en el sistema hemolítico (indicador). no ocurrió. Si la reacción de fijación del complemento es negativa, no se forma el complejo “antígeno-anticuerpo”, el complemento permanece libre y cuando se añade el sistema hemolítico se produce la lisis de los eritrocitos.

1.4. SONDAS DE ADN. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR),
MÉTODO DE INMUNOENZIMA (ELISA), MÉTODO DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES (FFA)

MÉTODOS DE SONdeo GENÉTICO

El desarrollo intensivo de la biología molecular y la creación de una base metodológica perfecta para la investigación genética fueron la base. Ingeniería genética. En el campo del diagnóstico ha surgido y se está desarrollando rápidamente una dirección para determinar secuencias de nucleótidos específicas de ADN y ARN, el llamado sondeo de genes. Estas técnicas se basan en la capacidad de los ácidos nucleicos para hibridarse y formar estructuras bicatenarias debido a la interacción de nucleótidos complementarios (AT, GC).

Para determinar la secuencia de ADN (o ARN) deseada, se crea especialmente una sonda de polinucleótidos con una secuencia de bases específica. Se introduce una etiqueta especial en su composición, que permite identificar la formación del complejo.

Aunque el sondeo genético no puede clasificarse como un método de análisis inmunoquímico, su principio básico (la interacción de estructuras complementarias) se implementa metódicamente de la misma manera que los métodos indicadores de inmunodiagnóstico. Además, los métodos de sondeo genético permiten reponer información sobre un agente infeccioso en ausencia de su expresión fenotípica (virus incrustados en el genoma, genes "silenciosos").

Para realizar el análisis de ADN se desnaturaliza la muestra con el fin de obtener estructuras monocatenarias con las que reaccionan las moléculas sonda de ADN o ARN. Para preparar las sondas, utilice Varias áreas ADN (o ARN) aislado de una fuente natural (por ejemplo, un microorganismo particular), generalmente presentado en forma de secuencias genéticas en plásmidos vectoriales u oligonucleótidos sintetizados químicamente. En algunos casos, se utilizan como sonda preparaciones de ADN genómico hidrolizado en fragmentos, a veces preparaciones de ARN y, especialmente, ARN ribosomal. Se utilizan como etiqueta los mismos indicadores que para varios tipos análisis inmunoquímico: isótopos radiactivos, fluoresceínas, biotopo (con manifestación adicional por el complejo enzimático avidina), etc.

El orden de análisis está determinado por las propiedades de la sonda disponible.

Actualmente se utilizan cada vez más kits comerciales que contienen todos los ingredientes necesarios.

En la mayoría de los casos, el procedimiento de análisis se puede dividir en las siguientes etapas: preparación de la muestra (incluida la extracción y desnaturalización del ADN), fijación de la muestra en un soporte (normalmente un filtro de membrana polimérica), prehibridación, hibridación en sí, lavado de productos no unidos, detección . Con ausencia medicamento estándar Primero se obtiene y marca una sonda de ADN o ARN.

Para preparar una muestra, puede ser necesario "cultivar" previamente el material de prueba para identificar colonias individuales de bacterias o aumentar la concentración de virus en cultivo de células. Análisis directo de muestras de suero sanguíneo, orina, elementos con forma sangre o Sangre pura por la presencia de un agente infeccioso. Para liberar ácidos nucleicos de las estructuras celulares, se lleva a cabo la lisis celular y, en algunos casos, la preparación de ADN se purifica con fenol.

La desnaturalización del ADN, es decir, su transición a una forma monocatenaria, se produce cuando se trata con álcali. Luego, la muestra de ácido nucleico se fija a un soporte, una membrana de nitrocelulosa o nailon, generalmente mediante incubación durante 10 minutos a 4 horas a 80°C al vacío. Además, en el proceso de prehibridación, se logra la inactivación de los sitios de unión libres para reducir la interacción no específica de la sonda con la membrana. El proceso de hibridación dura de 2 a 20 horas, dependiendo de la concentración de ADN de la muestra, la concentración de la sonda utilizada y su tamaño.

Una vez completada la hibridación y eliminados por lavado los productos no unidos, se detecta el complejo formado. Si la sonda contiene una etiqueta radiactiva, para demostrar la reacción, la membrana se expone a una película fotográfica (autorradiografía). Para otras etiquetas se utilizan los procedimientos correspondientes.

Lo más prometedor es obtener sondas no radiactivas (las llamadas frías). Sobre la misma base, se está desarrollando una técnica de hibridación que permite establecer la presencia de un patógeno en preparaciones de cortes y punciones de tejidos, lo que es especialmente importante en el análisis patomorfológico (hibridación in situ).

Un paso importante en el desarrollo de métodos de sondeo de genes fue el uso de la reacción de amplificación de la polimerasa (PCR). Este enfoque permite aumentar la concentración de una secuencia de ADN específica (preconocida) en una muestra mediante la síntesis de múltiples copias in vitro. Para llevar a cabo la reacción, a la muestra de ADN en estudio se le añade una preparación de enzima ADN polimerasa, un exceso de desoxinucleótidos para la síntesis y los llamados cebadores: dos tipos de oligonucleótidos con un tamaño de 2025 bases correspondientes a las secciones terminales del Secuencia de ADN de interés. Uno de los cebadores debe ser una copia del comienzo de la región de lectura de la cadena de ADN codificante en la dirección de lectura 53, y el segundo debe ser una copia del extremo opuesto de la cadena no codificante. Luego, con cada ciclo de la reacción de la polimerasa, el número de copias de ADN se duplica.

Para lograr la unión del cebador, es necesaria la desnaturalización (fusión) del ADN a 94°C, seguido de llevar la mezcla a 40-55°C.

Para llevar a cabo la reacción se han diseñado incubadoras de micromuestras programables para alternar fácilmente los cambios de temperatura óptima para cada etapa de la reacción.

La reacción de amplificación puede aumentar significativamente la sensibilidad del análisis durante el sondeo de genes, lo cual es especialmente importante en concentraciones bajas del agente infeccioso.

Una de las ventajas importantes del sondeo de genes con amplificación es la capacidad de estudiar cantidades submicroscópicas de material patológico.

Otra característica del método, más importante para el análisis de material infeccioso, es la capacidad de identificar genes ocultos (silenciosos). Los métodos asociados con el uso de sondeo genético ciertamente se introducirán más ampliamente en la práctica del diagnóstico de enfermedades infecciosas a medida que se vuelvan más simples y baratos.

Los métodos ELISA y RIF son en gran medida de naturaleza cualitativa o semicuantitativa. En muy bajas concentraciones componentes, la formación del complejo antígeno-anticuerpo no se puede registrar ni visualmente ni con medios instrumentales simples. La indicación del complejo antígeno-anticuerpo en tales casos se puede llevar a cabo si se introduce un marcador en uno de los componentes iniciales antígeno o anticuerpo, que se puede detectar fácilmente en concentraciones comparables a la concentración determinada del analito.

Como marcadores se pueden utilizar isótopos radiactivos (por ejemplo, 125I), sustancias fluorescentes y enzimas.

Dependiendo de la etiqueta utilizada, existen métodos de análisis radioinmune (RIA), inmune fluorescente (FIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), etc. últimos años ancho uso práctico recibió ELISA, lo que está asociado con la posibilidad determinaciones cuantitativas, alta sensibilidad, especificidad y automatización contable.

Los métodos de inmunoensayo enzimático son un grupo de métodos que permiten la detección del complejo antígeno-anticuerpo utilizando un sustrato que es escindido por una enzima y produce un color.

La esencia del método es combinar los componentes de la reacción antígeno-anticuerpo con un marcador enzimático medido. El antígeno o anticuerpo que reacciona se marca con una enzima. Según la transformación del sustrato bajo la acción de la enzima, se puede juzgar la cantidad del componente que interactúa en la reacción antígeno-anticuerpo. La enzima en este caso sirve como marcador de la reacción inmune y permite observarla visual o instrumentalmente.

Las enzimas son etiquetas muy convenientes porque sus propiedades catalíticas les permiten actuar como amplificadores, ya que una molécula de enzima puede promover la formación de más de 1 × 105 moléculas de producto de reacción catalítica por minuto. Es necesario seleccionar una enzima que conserve su actividad catalítica durante mucho tiempo, no la pierda al unirse a un antígeno o anticuerpo y tenga una alta especificidad con respecto al sustrato.

Los principales métodos para producir anticuerpos o antígenos y conjugados marcados con enzimas son: ingeniería química, inmunológica y genética. Las enzimas más utilizadas para ELISA son la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la galactosidasa, etc.

Para detectar la actividad de la enzima en el complejo antígeno-anticuerpo con el fin de registrar visual e instrumentalmente la reacción, se utilizan sustratos cromogénicos, cuyas soluciones, inicialmente incoloras, durante el proceso. reacción enzimática adquieren un color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de enzima. Así, para detectar la actividad de la peroxidasa de rábano picante en ELISA en fase sólida, se utilizan como sustrato ácido 5-aminosalicílico, que produce un color marrón intenso, y ortofenilendiamina, que produce un color amarillo anaranjado. Para detectar la actividad de la fosfatasa alcalina y la β-galatosidasa se utilizan nitrofenilfosfatos y nitrofenilgalactósidos, respectivamente.

El resultado de la reacción en la formación de un producto coloreado se determina visualmente o mediante un espectrofotómetro que mide la absorción de luz con una determinada longitud de onda.

Hay muchas opciones para realizar ELISA. Hay opciones homogéneas y heterogéneas.

Según el método de producción se distinguen métodos ELISA competitivos y no competitivos. Si en la primera etapa sólo están presentes en el sistema el compuesto analizado y sus correspondientes centros de unión (antígeno y anticuerpos específicos), entonces el método no es competitivo. Si en la primera etapa el compuesto analizado (antígeno) y su análogo (antígeno marcado con enzima) están presentes, compitiendo entre sí por la unión a los centros de unión específicos (anticuerpos) que escasean, entonces el método es competitivo. En este caso, cuanto más antígeno de prueba contenga la solución, más menos cantidad unión a antígenos marcados.

MÉTODO DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES (MFA) o REACCIÓN DE INMUNOFLORESCENCIA (RIF)

El método de inmunofluorescencia es el método de elección para la detección e identificación rápida de un microorganismo desconocido en el material de prueba.

Ag + AT + electrolito = complejo que brilla con rayos UV

Suero microbiano marcado con fluorocromo

El colorante que se utiliza con frecuencia es el isotiocianato de fluoresceína FITC.

Al estudiar este método, se utiliza un microscopio fluorescente.

Puesta en escena del RIF

Se aplican al frotis 30 µl de solución de anticuerpo marcada con FITC.

Colocar el vaso en una cámara húmeda y mantenerlo a temperatura ambiente durante 20-25 minutos, o en un termostato a 37°C durante 15 minutos.

Lave el vaso con agua corriente del grifo durante 2 minutos, enjuáguelo con agua destilada y séquelo al aire.

Se aplica una gota de líquido de montaje al frotis seco, el frotis se cubre con un cubreobjetos y se examina con un microscopio fluorescente o un accesorio fluorescente para un microscopio óptico convencional.

en microbiología

"Reacción de aglutinación y sus tipos (RA)"

Plan:

1. Introducción………………………………………………………………………………..3

2. RA sobre vidrio……………………………………………………………………………….4

3. Tubo de ensayo RA………………………………………………………………………………………….5

4. Literatura utilizada……………………………………………………………………..7

1. Introducción.

La interacción del antígeno microbiano y los anticuerpos es de naturaleza estrictamente específica y tiene como objetivo en el cuerpo del animal neutralizar el patógeno y sus toxinas. La interacción de antígenos y anticuerpos in vitro, en determinadas condiciones, se acompaña de fenómenos visibles (aglutinación, precipitación, lisis inmunitaria), lo que permite utilizar reacciones AG-AT, llamadas serológicas (del latín suero), con fines prácticos. Las biofábricas producen antígenos y sueros inmunes (anticuerpos) de naturaleza específica conocida (diagnóstico). Usando tales sueros en reacciones serológicas, es posible identificar un microorganismo desconocido o, usando un antígeno conocido, detectar en el cuerpo anticuerpos sintetizados en respuesta a la introducción de un patógeno y así hacer un diagnóstico (diagnóstico serológico). Además, las reacciones serológicas se pueden utilizar para evaluar la intensidad de la respuesta inmune después de una vacunación o una enfermedad infecciosa.

Las reacciones de aglutinación, como la aglutinación indirecta y Coombs, se basan en la interacción in vitro de antígenos corpusculares con anticuerpos y la capacidad de los complejos resultantes para precipitar. Como antígenos corpusculares se utilizan células bacterianas o antígenos solubles extraídos de microorganismos y absorbidos en corpúsculos portadores: glóbulos rojos, partículas de látex, etc.

Los determinantes antigénicos de los antígenos corpusculares interactúan específicamente con anticuerpos homólogos (fase invisible y específica de la reacción), y luego los complejos antígeno-anticuerpo forman grandes conglomerados visibles a simple vista, que precipitan: un aglutinado (fase visible y no específica de la reacción). ). Las formas de microbios libres de flagelados (Brucellae) producen aglutinantes granulares, mientras que las formas flageladas (Escherichia, Salmonella) producen aglutinantes de algodón de gran tamaño, que se depositan en el fondo del tubo de ensayo en forma de paraguas invertido y se rompen fácilmente cuando se agitan. Los antígenos y anticuerpos interactúan solo en presencia de un electrolito (solución de cloruro de sodio al 0,8%). El curso de la reacción está influenciado por la concentración de sal en el electrolito, el número de células microbianas en la suspensión, la concentración sérica, el pH, la temperatura y otros factores.

Reacción de aglutinación (ra).

Existen aglutinaciones específicas, que se basan en la interacción del antígeno. Con anticuerpo homólogo , contenido en el cuerpo del animal al que se le introdujo este antígeno (inmunoaglutinación); no específico (químico), que surge de cambios en el pH del medio ambiente, la concentración de electrolitos; espontáneo, que se observa cuando las bacterias (en forma R) se suspenden en una solución fisiológica y cuando se calientan, lo que se asocia con un cambio en el estado coloidal de la célula bacteriana. Antígeno , involucrado en la AR se llama aglutinógeno, el anticuerpo se llama aglutinina y el precipitado resultante se llama aglutinado. Cuando se forma un aglutinado, la proporción cuantitativa de antígeno y anticuerpos es importante (el fenómeno óptimo). Con un exceso o deficiencia de anticuerpos, se produce un retraso.

La reacción de aglutinación (AR) es una de las primeras reacciones inmunológicas utilizadas en la práctica microbiológica. Por primera vez (1895), F. Vidal utilizó la AR para diagnosticar la fiebre tifoidea. Posteriormente (1897), A. Wright utilizó la misma reacción para diagnosticar la brucelosis en humanos. La RA también ha encontrado aplicación en el diagnóstico de pullorosis en pollos, leptospirosis, aborto infeccioso de yeguas, así como para tipificar cultivos microbianos desconocidos utilizando un suero aglutinante conocido. La AR es muy sensible; se puede utilizar para detectar 0,01 μg de nitrógeno proteico de anticuerpos en 1 ml.

Se han desarrollado varias variantes de la reacción de aglutinación, que se diferencian en la ejecución metodológica y el propósito del estudio.

2. Ra sobre vidrio.

En esta variante de la AR, los sujetos de prueba pueden ser suero o antígeno, pero la mayoría de las veces esta opción se utiliza para identificar microorganismos.

1. Para identificar el microorganismo (m/o), se aplican por separado una gota de un suero aglutinante conocido, por ejemplo suero de Salmonella, y una gota de solución fisiológica (control) sobre un portaobjetos de vidrio sin grasa. Luego, mediante un asa bacteriológica, se toma la masa bacteriana del cultivo en estudio de una colonia en una placa de Petri o de la superficie de un MPA inclinado en un tubo de ensayo y se suspende por separado en suero inmune y solución fisiológica hasta obtener una suspensión homogénea. obtenido. El resultado se tiene en cuenta al cabo de 2...4 minutos.

Contabilización de resultados: no debe haber cambios en la muestra de control. Si el cultivo bacteriano coincide específicamente con el suero inmune, aparecen escamas aglutinadas (resultado positivo, si no hay fenómeno de aglutinación, se concluye que el cultivo bacteriano en estudio no corresponde al suero inmune);

2. Consideremos la detección de anittels en el suero sanguíneo de prueba usando el ejemplo de la prueba de rosa de bengala utilizada en el serodiagnóstico de la brucelosis. Se aplican 0,3 ml del suero sanguíneo del animal de prueba y 0,03 ml de antígeno de brucelosis (células de Brucella teñidas con rosa de Bengala) sobre un portaobjetos de vidrio. Los componentes se mezclan bien agitando el vaso y el resultado se cuenta después de 4 minutos.

Registro de resultados: si la reacción es positiva aparecen escamas de aglutinado de color rosa. Una reacción serológica de este tipo se clasifica como cualitativa, ya que con ella se pueden detectar anticuerpos contra el patógeno en el suero sanguíneo del animal, pero es imposible evaluar su contenido cuantitativo.