Citotoksični t limfociti cd3 cd8 su povećani. Poremećaji T-limfocita. CD8 limfopenija. Indikacije za imenovanje laboratorijskog testa
), nivo cirkulirajućih imunoloških kompleksa, glavne klase imunoglobulina periferna krv, akcenat je na naprednoj analizi NK ćelija (Prirodni ubice - "prirodni ubice"), kao i na evaluaciji aktiviranih T-limfocita (CD3 + HLA-DR + CD45 +) i aktiviranih citotoksičnih limfocita (CD8 + HLA-DR + CD45 +) odgovoran za antivirusni imunitet. Analiza gore navedenih populacija ćelija pomoći će da se shvati da li imunološki sistem adekvatno reaguje na virusnu infekciju i da li je pacijentu potrebna imunostimulirajuća terapija.
* Rezultati studije se izdaju uz zaključak ljekara - alergologa-imunologa, doktora medicinskih nauka.
T-ćelijske leukemije
Uz svaki imunogram prilaže se pisano mišljenje imunologa.
Važne napomene
Da bi se dijagnosticirala patologija, rezultati ove studije moraju se uporediti s kliničkim podacima i pokazateljima drugih laboratorijske pretrage. Također treba napomenuti da se klinički značaj studije značajno povećava procjenom imunološkog statusa pacijenta tokom vremena.
Književnost
- Khaitov, R. M. Alergologija i imunologija: nacionalno uputstvo / ur. R. M. Khaitova, N. I. Ilyina. - M. : GEOTAR-Media, 2009. - 656 str.
- Khaitov, R. M. Smjernice za kliničku imunologiju. Dijagnoza bolesti imunološki sistem: vodič za liječnike / R. M. Khaitov, B. V. Pinegin, A. A. Yarilin. - M. : GEOTAR-Media, 2009. - 352 str.
- Zueva E. E., Rusanova E. B., Kurtova A. V., Ryzhak A. P., Gorchakova M. V., O V. Galkina - Sankt Peterburg. - Tver: DOO "Izdavačka kuća "Triada", 2008. - 60 str.
- Ketlinsky, S.A. Imunologija za doktora / S.A. Ketlinsky, N.M. Kalinina. SPb. : Hipokrat, 1998. - 156 str. Yarilin, A. A. Imunologija: udžbenik / A. A. Yarilin. - M. : GEOTAR-Media, 2010. - 752 str.
- Khaitov, R. M. Imunologija: Atlas / R. M. Khaitov, A. A. Yarilin, B. V. Pinegin.M. : GEOTAR-Media, 2011. - 624 str.
- Khaitov, R.M. Imunologija: udžbenik / R.M. Khaitov. - M. : GEOTAR-Media, 2009. - 320 str.
- Khaitov, R. M. Procjena imunološkog statusa osobe u normalnim i patološkim stanjima / R. M. Khaitov, B. V. Pinegin // Imunologija. - 2001. - N4. - str. 4-6.
- Whiteside, T. L. Uloga ljudskih prirodnih ćelija ubica u zdravlju i bolesti / T. L. Whiteside, R. B. Herberman // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. - 1994. - Vol. 1, #2. - str. 125-133.
- Ginadi, L. Diferencijalna ekspresija antigena T-ćelija u normalnim limfocitima periferne krvi: kvantitativna analiza protočnom citometrijom / L. Ginadi, N. Farahat, E. Matutes // J. Clin. Pathol. - 1996. - Vol. 49, br. 1. - P. 539-544.
- Mercer, J.C. Prirodne T-ćelije ubice: brzi odgovori koji kontroliraju imunitet i bolesti / J.C. Mercer, M.J. Ragin, A. August // International J. Biochemistry & Cell Biology. - 2005. - br. 37. - P. 1337-1343.
- Nikitin, V. Yu. Markeri aktivacije na T-helperima i citotoksičnim limfocitima u različitim fazama kroničnog virusnog hepatitisa C / V. Yu. Nikitin, I. A. Sukhina, V. N. Tsygan [et al.] // Vestn. Ros. Vojno-med. akad. - 2007. - T. 17, br. 1. - S. 65-71.
- Boettler, T. T ćelije sa CD4 + CD25 + regulatornim fenotipom suzbijaju in vitro proliferaciju CD8 + T ćelija specifičnih za virus tokom hronične infekcije virusom hepatitisa C / T. Boettler, H.C. Spangenberg, C. Neumann-Haefelin // J. Virology. - 2005. - Vol. 79, br. 12. - P. 7860-7867.
- Ormandy, L.A. Povećana populacija regulatornih T ćelija u perifernoj krvi pacijenata sa hepatocelularnim karcinomom / L.A. Ormandy, T. Hillemann, H. Wedemeyer // J. Cancer Res. - 2005. - Vol. 65, br. 6. - P. 2457-2464.
- Sakaguchi, S. Prirodne CD4 + CD25 + regulatorne T ćelije koje eksprimiraju FoxP3 u imunološkoj toleranciji na sebe i ne-sebe / S. Sakaguchi // Nature Immunol. - 2005. - Vol. 6, br. 4. - P. 345-352.
- Romagnani, S. Regulacija odgovora T stanica / S. Romagnani // Clin. Exp. Alergija. - 2006. - Vol. 36. - P. 1357-1366.
- Khaidukov S. V., Glavne i manje populacije limfocita ljudske periferne krvi i njihove normativne vrijednosti (metoda višebojne citometrijske analize) / Khaidukov S. V., Zurochka A. V., Totolyan A. A., Chereshnev V. A. // Med. imunologija. - 2009. - T. 11 (2-3). - S. 227-238.
Prva faza laboratorijske dijagnostike je kvantitativna procjena stanica periferne krvi i njihovih morfoloških elemenata - brojanje leukocitna formula. U ovoj analizi pažnju treba obratiti ne samo na relativni, već i na apsolutni broj krvnih zrnaca.
Prilikom određivanja normalnih pokazatelja formule krvi u relativnim vrijednostima, preračunavanje u apsolutne vrijednosti može otkriti patologiju i obrnuto.
Broj leukocita i drugih krvnih zrnaca zavisi od brzine oslobađanja ćelija iz koštane srži i njihovog priliva u tkiva. Broj leukocita u perifernoj krvi iznad 10109 ćelija/l se definiše kao leukocitoza, ispod 4*109 ćelija/l - kao leukopenija. Glavni uzroci leukocitoze su sve vrste infekcija, upalna stanja, maligne neoplazme, traume, leukemija, uremija, djelovanje adrenalina i steroidnih hormona. Leukopenija se javlja uz aplaziju i hipoplaziju crvene koštane srži, hipersplenizam, akutna leukemija, mijelofibroza, plazmacitomi, metastaze neoplazme u koštanoj srži, teške infekcije, kolagenoza (nepovoljni simptom), pod uticajem lekova.
Poznata su različita odstupanja formule leukocita, koja u kombinaciji sa drugim laboratorijskim podacima mogu ukazivati na različita patološka stanja.
Može se uočiti leukocitoza sa pomakom ulijevo bakterijske infekcije(nespecifične i specifične), intoksikacije (trovanja ugljen monoksid, gljive itd.), koma (uremija, dijabetička, hepatična, itd.), nakon akutni gubitak krvi, tokom hemolitička kriza. Takođe se pojavljuje na ranim fazama postoperativni period, nakon velikih hirurške intervencije, tokom i nakon porođaja, sa malignim neoplazmama, leukemijom, radijaciona bolest(u ranoj fazi masivne radijacijske ozljede).
Leukocitoza sa pomakom udesno može se primijetiti kod virusnih i kroničnih bakterijskih (tuberkuloza, sifilis, bruceloza, itd.) infekcija, manjka folna kiselina, radijaciona bolest, sepsa.
Neutropenija se obično kombinuje sa leukopenijom kod teških i virusnih infekcija, autoimune i medicinske leukopenije, Bi2-deficijencije anemije, hipoksije, gladovanja, nedostatka vitamina.
Eozinofilija se javlja kod alergijskih bolesti ( bronhijalna astma, alergije na lijekove, itd.), helmintička invazija, kožne, autoimune i infektivne bolesti u toku razvoja kliničke slike iu fazi oporavka, sa malignim neoplazmama, sa limfogranulomatozom.
Eozinopenija se javlja kada stresne situacije, akutne infekcije, intoksikacija, šok, infarkt miokarda.
Bazofilija se javlja pri liječenju heparinom, primjeni seruma, dijabetesa, miksedema, nefroze, u predmenstrualnom periodu, kod autoimune trombocitopenije, kronične mijeloične leukemije, mijelofibroze, eritremije.
Apsolutna limfocitoza se uočava kod djece mlađe od 4 godine kao fiziološko stanje. Kod odraslih se uočava povećanje broja limfocita kod zaraznih bolesti. virusna etiologija kod hronične leukemije.
Limfopenija se nalazi kod radijacijske bolesti, AIDS-a, kronične aleukemične mijeloične leukemije.
Monocitopenija - kod teških hipertoksičnih oblika trbušnog tifusa i drugih zaraznih bolesti i jedan je od znakova poremećenih procesa regeneracije.
Monocitoza - kod reumatizma, posebno u periodu egzacerbacije, kod novorođenčadi se može primijetiti bruceloza, sifilis, tuberkuloza, infektivna mononukleoza.
Pojava plazma ćelija u perifernoj krvi ukazuje na intenzitet imunološkog procesa, na primjer, kod dječjih infekcija (ospice, rubeola, zaušnjaci, Infektivna mononukleoza), kod odraslih - kod akutnih respiratornih virusnih infekcija, gripe, radijacijske bolesti, leukemije, hepatitisa.
Detaljnija procjena ćelijskog sastava može biti dodatna istraživanja, a prije svega korištenjem metoda laserske protočne citometrije. Ovo je tehnologija za brzo mjerenje različitih karakteristika ćelija ili njihovih organela. Suspenzija ćelija, prethodno označena fluorescentnim monoklonskim antitelima ili fluorescentnim bojama, dovodi se u element za protok. Ćelije slijede jedna drugu, gdje se ukrštaju laserskim snopom u protočnoj ćeliji, pod čijom djelovanjem obojene ćelije fluoresciraju. Zatim, preko optičkog sistema, zračenje ulazi u uređaj za snimanje, gdje se dalje obrađuje. Protočna citometrija se može koristiti za određivanje veličine ćelije, odnosa jezgra i citoplazme, stepena asimetrije i intenziteta fluorescencije. Dozvoljeno je bojenje do deset maraka po ćeliji. U studiji je prihvatljiva procjena svojstava od nekoliko desetina do nekoliko miliona ćelija.
Opseg protočne citometrije je vrlo raznolik. Osim morfološke karakteristikećelije pomoću monoklonskih antitijela mogu pouzdano odrediti populacijski i subpopulacijski sastav limfocita, identificirati stadij stanične diferencijacije i aktivacije, procijeniti nivo funkcionalne aktivnosti limfocita, odrediti intracelularne i izlučene citokine, provesti studije fagocitoze, analizirati ćelijski ciklus, procijeniti apoptozu i proliferaciju. Glavne populacije limfocita periferne krvi zdravih osoba prikazane su u tabeli 3.2. Ovi pokazatelji se mogu smatrati normativnim u imunološkim studijama.
T a b l e 3.2
Intervali distribucije glavne i male populacije limfocita u perifernoj krvi praktički zdravih osoba ___________________ [Khaidukov S.V. et al., 2009]________________
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Smanjenje apsolutnog broja T-limfocita ukazuje na nedostatak ćelijskog imuniteta (nedostatak ćelijske efektorske veze imuniteta). Često se javlja kod raznih infekcija, nespecifičnih upalnih procesa, malignih
prirodni tumori, u postoperativnom periodu, sa srčanim udarom itd. Povećanje broja T-limfocita u dinamici bolesti je klinički povoljan znak. Potpuni završetak bolesti obično je praćen normalizacijom broja T-limfocita.
Povećati apsolutni broj CD4+-limfociti ukazuju na stimulaciju imunog sistema na bilo koji antigen i služe kao potvrda hiperreaktivnih sindroma. Međutim, mora se imati na umu da njihov porast najčešće nije ništa drugo do normalna fiziološka reakcija na antigen, što opažamo kod specifičnih i nespecifičnih zaraznih bolesti. Proliferacija CD4+T-limfocita se nastavlja 3-5 dana nakon aktivacije. Osigurava povećanje broja ćelija u klonovima uključenih u imunološki odgovor – proliferativnu ekspanziju klonova. T ćelije prolaze kroz 6-8 podjela, što osigurava povećanje njihovog broja za oko 100-200 puta. Dakle, ako se početni broj T-ćelija u klonu može procijeniti kod ljudi na oko 2^10 (na osnovu procjene ukupnog broja T-ćelija pomagača - na 7x10 i
mogući broj klonova je 3x10), onda nakon proliferacije njihov broj može premašiti 106. Time se osigurava odgovarajuća efikasnost imunološkog odgovora, jer je formiranje aktivnih T-pomagača neophodno za uspješnu implementaciju gotovo svih njegovih grana. Smanjenje broja T-pomagača ukazuje na hiporeaktivni sindrom s kršenjem regulatorne veze imuniteta. Ovo je posebno vidljivo kod HIV infekcije.
U gotovo svim virusnim, bakterijskim, protozoalnim infekcijama utvrđuje se povećanje broja citotoksičnih T-limfocita. Relativno povećanje broja CD8+ ćelija obično je posledica smanjenja broja T pomagača, iako se ovaj obrazac ne primećuje uvek. To je zbog činjenice da citotoksični T-limfociti sintetiziraju IFN-y, koji inhibira proliferaciju T-ćelija, i zato što su CD8+-limfociti ranije smatrani T-supresorima. Smanjenje broja citotoksičnih T-limfocita potvrđuje insuficijenciju ćelijske efektorske veze imuniteta, što je posebno važno u liječenju kroničnih virusnih infekcija (virusni hepatitis, herpes i dr.).
Broj B-limfocita u perifernoj krvi određuje se pomoću CD^-markera, koji je prisutan na svim B-ćelijama u perifernoj krvi, ali ga nema na plazma ćelijama.
Sa dijagnostičke tačke gledišta, NK-limfociti imaju dva važna CD markera - 16 i 56. Njihov ukupan broj u krvi je: CD16 + ćelije - 6-26%, CD56 + ćelije - 7-31% (0,09-0,6x10 %). Smanjenje broja ovih ćelija, patognomoničan znak ćelijske efektorske imunodeficijencije, zbog težine toka onkoloških i virusnih infekcija, uočava se i pri uzimanju imunosupresiva. Povećanje broja NK ćelija povezano je sa aktivacijom antitransplantacionog imuniteta, u nekim slučajevima se primećuje kod bronhijalne astme, tj. je patognomoničan znak ćelijski posredovane citotoksičnosti.
Danas takozvani regulatorni (diferencijacijski) indeks, odnos CD4+- i CD8+-limfocita, gubi svoje kliničko značenje. Vjeruje se da vrijednost ovog indeksa ispod 1,0 odgovara imunodeficijencije, više od 2,5 - hiperaktivnosti. Sa savremenih pozicija bilo bi pogrešno tumačiti ovaj pokazatelj na ovaj način u današnje vrijeme. Više informacija za takve zaključke je apsolutni broj subpopulacija T-limfocita i markera aktivacije.
Manifestacija aktivacije je ekspresija na ćelijama različitih markera aktivacije. Tako se na T-limfocitima nakon stimulacije već nakon 2-3 sata pojavljuje na površini CD69 - najraniji aktivacijski antigen, djelimično mobiliziran iz intracelularnih depoa, a djelomično eksprimiran de novo. Njegova ekspresija traje nešto više od jednog dana. Ubrzo nakon CD69, drugi marker rane aktivacije, CD25, pojavljuje se na površini ćelije. Sledeće manifestacije aktivacije primećuju se jedan dan nakon dejstva stimulansa, kada se eksprimira receptorski molekul za transferin (CD71). U narednim danima (3-6 dana) eksprimiraju se molekuli MHC-II, koji se klasifikuju kao kasni markeri aktivacije T-ćelija, a zatim integrini, označeni kao vrlo kasni aktivacioni antigeni VLA (Very late activation antigens), i hemokini se izlučuju. Ove kasne manifestacije aktivacije ćelija su kombinovane sa proliferativnim procesom.
O funkcionalnom stanju T-limfocita svjedoči broj ćelija koje eksprimiraju IL-2 receptore (CD25+ limfociti). Normalno u njihovoj krvi relativni broj iznosi 13-24%. Kod hiperreaktivnih sindroma broj ovih stanica se povećava, a kod imunodeficijencije smanjuje. Indikator imunološke hiperreaktivnosti je i broj limfocita koji nose dva receptora - CD3 i HLA-DR. Normalno, oni ne bi trebali biti veći od 12%.
Ostali markeri se trenutno upisuju, sada ih ima oko 263 varijante. Ovo je posebno važno u onkohematologiji radi razjašnjenja dijagnoze.
Pored utvrđivanja kvantitativnog sastava ćelija imunog sistema, veoma je važno dati kvalitativni opis njihove funkcionalne aktivnosti. Zahvaljujući nedavno korišćenoj višebojnoj protočnoj citometriji, prisustvo određenih receptora može se koristiti za procenu funkcionalne aktivnosti ćelija. Sa kliničke tačke gledišta, najvažniji receptori su:
CD5 je adhezioni molekul koji regulira aktivaciju stanica. Određuje se na T-limfocitima, timocitima, B1-klonu B-ćelija;
CD11b - odnosi se na najvažnije integrine za migraciju ćelija, koji određuju aktivnost fagocitoze, ćelijsku citotoksičnost, hemotaksiju i ćelijsku aktivaciju T-efektora, NK ćelija, makrofaga i granulocita;
CD16 - je receptor za Fc fragment IgG, posreduje u fagocitozi i ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitijela, kada se aktivira, povećava se citotoksičnost NK ćelija, stimuliše se lučenje interferona i faktora tumorske nekroze;
CD23 se eksprimira na aktiviranim B ćelijama, makrofagima, epitelnim ćelijama timusa, eozinofilima, trombocitima. Indikator aktivnosti B-ćelija.
CD25 - a-lanac IL2 receptora. Izraženo na razne vrstećelije periferne krvi: CD4+-, CD8+-, NK-limfociti, NKT-ćelije, B-limfociti, monociti. Marker rane aktivacije T-limfocita. Povećanje njihovog broja, kao i opšte populacije CD25-pozitivnih limfocita, može ukazivati na upalni proces bilo koje prirode (infektivni, autoimuni);
CD27 je dodatni marker B2-limfocita. Ukazuje na prijelaz B-limfocita iz naivnih stanica u memorijske ćelije;
CD28 se eksprimira na većini aktiviranih T limfocita, NK ćelija i plazma ćelija. Neophodan kao kostimulirajući faktor za indukciju imunološkog odgovora (proliferacija i aktivacija ćelija);
CD38 - ciklična ADP-ribozilhidrolaza, koja se nalazi na površini limfocita, obezbeđuje adheziju, prenos signala, takođe je marker aktivacije ćelije (metabolički marker). Smanjuje se kod HIV infekcije, leukemije, mijeloma, solidnih tumora, dijabetesa tipa II;
CD50 je međućelijski adhezioni molekul (ICAM-3) i također je moćan signalni molekul. Prisutan na svim leukocitima, endotelnim i dendritskim ćelijama. Pruža kostimulatorne signale za T ćelije i reguliše ćelijsku adheziju interakcijom sa integrinima. Pokazano je smanjenje broja CD50+ ćelija kod tumorskih bolesti;
CD57 - eksprimiran je na subpopulacijama od 15-20% mononuklearnih ćelija periferne krvi, u 60% NK- i T-ćelija. Utvrđuje se povećanje pokazatelja kod pacijenata sa karcinomom, pacijenata nakon transplantacije, kod pacijenata sa HIV-om, kao i sa reumatoidnim artritisom i Feltyjevim sindromom. Smanjenje je patognomonično kod kronične lajmske bolesti;
T-limfociti su brojni podtip agranulocita. Učestvuju u ćelijskom i humoralnom imunitetu, štiteći organizam od patogenih efekata.
T-limfociti
Pažnja! Prva analiza u općem kliničkom testu krvi je izračun formule leukocita. IN opšta analiza krvi, procjenjuje se relativni i apsolutni sadržaj limfocita u krvi. Odstupanja od normalnih vrijednosti ukazuju na patologiju.
Šta su T-limfociti i gdje se formiraju?
Prekursori agranulocita pojavljuju se u koštanoj srži. U timusu se odvija proces sazrevanja. Određeni hormoni i tkiva uključeni završna faza sazrevanja utiču na diferencijaciju limfocita. Svaka vrsta T ćelija se strukturno i funkcionalno razlikuje jedna od druge. Limfociti se proizvode u koštanoj srži iu malim količinama u slezeni i limfnim čvorovima. Kod poremećaja u radu koštane srži ili leukemije različite etiologije povećavaju se limfni čvorovi, što je prvi znak patoloških stanja.
T ćelije se mogu razlikovati od drugih limfocita po prisustvu posebnog receptora na membrani. Većina T-limfocita nosi na membrani ćelijski receptor koji se sastoje od alfa i beta lanaca. Takvi limfociti se nazivaju alfa-β-T ćelije. Oni su dio stečenog imunološkog sistema. Specijalizovane gama delta T ćelije (manje uobičajen tip T limfocita u ljudskom telu) imaju invarijantne T ćelijske receptore sa ograničenom raznovrsnošću.
Vrste T-limfocita i njihove funkcije
Postoji nekoliko tipova T ćelija:
- Efektori.
- Pomagači.
- Citotoksični
- Regulatorno.
- Ubice.
- Gama delta.
- Memorija.
Bitan! Glavna funkcija T-limfocita je identifikacija i uništavanje patogena ili stranih čestica.
Pomoćne T ćelije pomažu drugim leukocitima imunološki procesi, u transformaciji B-limfocita u plazma ćelije. Pomoćne T ćelije poznate su kao CD4 T limfociti jer imaju CD4 glikoprotein na svojoj membrani. Pomoćne T ćelije se aktiviraju kada se vežu za molekularne antigene MHC klase II koji se nalaze na površini ćelija koje predstavljaju antigen. Kada se aktiviraju, T-limfociti se dijele i oslobađaju proteine koji se nazivaju citokini koji reguliraju aktivni imunološki odgovor. Ćelije se mogu diferencirati u jedan od nekoliko podtipova limfocita - TH1, TH2, TH3, TH17, TH9 ili TFH. T-limfociti ove vrste mogu biti predstavljeni fenotipom CD3. Ovi glikoproteini (CD4 i CD3) pomažu u mobilizaciji imunološkog sistema i uništavanju patogena.
Citotoksični T-limfociti (CTL) uništavaju kancerogene ili virusom inficirane ćelije i učestvuju u odbacivanju transplantata. Poznate kao CD8 T ćelije jer imaju CD8 glikoprotein na svojoj membrani. Mete se prepoznaju vezivanjem za molekule peptida MHC klase I koji su prisutni na membrani zametne ćelije.
Regulatorni T limfociti igraju ključnu ulogu u održavanju imunološke tolerancije. Njihov glavni zadatak je da se isključe imuni odgovor u uništavanju patogenog mikroorganizma. Ovu funkciju zajednički obavljaju T-ubice i T-pomagači.
Normalne vrijednosti T-limfocita u testu krvi
Normalan broj limfocita varira u zavisnosti od starosne grupe. Povezan sa individualnim karakteristikama imunog sistema. Volume timus, u kojem se nalazi glavni dio agranulocita, opada u procesu starenja. Do šeste godine u krvotoku prevladavaju limfociti, a od šeste godine neutrofili.
Procenat broja T-limfocita u krvi u različitim starosnim grupama:
- Kod novorođenčadi, indikator je 14-36% ukupnog broja leukocita.
- Kod dojenčadi varira između 41-78%.
- Kod djece od 12 mjeseci do 15 godina postepeno se smanjuje na 23-50%.
- Kod odraslih varira u rasponu od 18-36%.
Analiza broja T-limfocita je poseban slučaj općeg kliničkog testa krvi. Ova studija omogućava vam da odredite relativni i apsolutni sadržaj limfocita u krvotoku. (imunogram) se radi za otkrivanje koncentracije limfocita. Imunogram prikazuje indikatore B i T ćelija. Smatra se da je norma T-limfocita 48-68%, a B-ćelija - 4-18%. Omjer T-helpera i T-ubica normalno ne bi trebao prelaziti 2,0.
Imunološki test krvi (imunogram) Indikacije za imunogram
Ljekari propisuju imunogram za proučavanje statusa imunološkog sistema. Kao prvo ovo istraživanje krv je neophodna za pacijente sa HIV infekcijom ili drugim zaraznim bolestima.
Uobičajene bolesti kod kojih je indiciran prolaz imunološke studije:
- Bolesti gastrointestinalnog trakta.
- Perzistentne ili kronične zarazne bolesti.
- Alergijske reakcije nepoznatog porijekla.
- Anemija različite etiologije (nedostatak željeza, hemolitička).
- Kronične bolesti jetre virusne ili idiopatske prirode (hepatitis, ciroza).
- Postoperativne komplikacije.
- Sumnja na rak.
- Teški upalni procesi koji traju nekoliko sedmica.
- Procjena efikasnosti imunostimulirajućih lijekova.
- Sumnja na autoimune bolesti (reumatoidni artritis, mijastenija gravis).
U zavisnosti od lekara, mogu postojati i druge indikacije za imunološki pregled.
Interpretacija rezultata ispitivanja
Ukupan sadržaj limfocita u krvi
Prekomjerno povećanje nivoa limfocita (CD3+ T ćelija) u krvi može ukazivati na infektivni ili upalni proces. Ovo stanje se primećuje kada hronična leukemija ili bakterijske infekcije. Smanjenje apsolutnog broja T ćelija ukazuje na nedostatak ćelijskog efektorskog imuniteta. Smanjen broj T-limfocita uočava se kod malignih neoplazmi, srčanog udara, upotrebe citotoksičnih lijekova ili ozljeda različite etiologije.
B ćelije
Povišeni nivoi B-limfocita (CD19+ T-ćelija) uočeni su kod autoimunih bolesti, bolesti jetre, bronhijalne astme, gljivičnih ili bakterijskih infekcija. Hronična limfocitna leukemija može uzrokovati visokog sadržaja B-limfociti u krvotoku. Smanjeni nivoi B-limfocita se javljaju sa benigne neoplazme, agamaglobulinemija ili nakon uklanjanja slezene.
T-pomagači
Ako se povećaju pokazatelji apsolutnog i relativnog sadržaja T-ćelija sa fenotipom CD3 + CD4 (T-pomagači), to ukazuje na prisutnost autoimunih bolesti, alergijskih reakcija ili zaraznih bolesti. Ako nivoi T-ćelija u krvi prekomerno padnu, to je znak HIV-a, upale pluća, malignih neoplazmi ili leukemije.
CTL
Prirodne (N) ubice
Smanjenje ukupnog broja prirodnih ubica sa fenotipom CD16 dovodi do razvoja onkoloških, virusnih i autoimunih bolesti. Povećanje dovodi do odbacivanja grafta i komplikacija različite etiologije.
Savjet! Gore navedeni podaci su dati samo u informativne svrhe. Samo kvalificirani stručnjak može izvršiti analizu indikatora. Potrebni su dodatni pregledi kako bi se potvrdila ili isključila dijagnoza. Nemojte se baviti samodijagnozom ili liječenjem - potražite savjet svog ljekara.
Više:
Razlozi za povećanje i smanjenje limfocita u krvi, općeprihvaćene norme
imunoglobulini (na početku imunološkog odgovora B ćelije sintetiziraju IgM, kasnije prelaze na proizvodnju IgG, IgE, IgA).Enciklopedijski YouTube
1 / 5
✪ B-limfociti i T-limfociti CD4+ i CD8+ populacije
✪ Citotoksični T-limfociti
✪ T-limfociti
✪ Limfociti
✪ B-limfociti (B-ćelije)
Titlovi
Već sam govorio o glavnim ćelijama specifičnog imunog sistema, a sada ćemo još jednom sumirati ono što smo naučili. Krenimo od B-limfocita koji uvijek crtam plavom bojom. Evo ga ispred vas. Membranski imunoglobulini su prisutni na površini B-limfocita, a svaki takav limfocit ima svoju varijantu varijabilnog domena. Ponavljam: B-limfociti imaju membranske imunoglobuline na površini, a svaki takav limfocit ima svoju verziju varijabilnog domena. Nacrtaću varijabilne domene ružičastom bojom. Drugi B-limfocit će imati različite varijabilne domene. Stoga mogu odgovoriti na razne antigene koji su ušli u tijelo. U tom slučaju se aktiviraju B-limfociti. Šta je za to potrebno i šta se dešava u ovom slučaju? Hajde da razgovaramo o tome šta se dešava kada se B-limfociti aktiviraju. Šta vam je potrebno za početak aktivacije? Ovo zahtijeva da se patogen veže za membranski imunoglobulin. Pišemo da se patogen vezuje. Uzročnik se vezuje za membranski imunoglobulin. Ali ovo nije dovoljno. Normalno, B-limfocitu je potrebna stimulacija od T-limfocita. Tako pišemo: stimulacija T-limfocitom. U kojoj situaciji je takva stimulacija neophodna? B-limfocit je ćelija koja predstavlja antigen. On apsorbuje antigen, cepa ga i pokazuje zajedno sa MHC klasom 2. Sada ćemo ga takođe nacrtati. Ovo je MHC klase 2. Za njega se vežu fragmenti antigena. Ovaj kompleks se vezuje za aktivirani T pomoćnik, koji ima receptor sa varijabilnim domenom specifičnim za taj određeni antigen. Da, ispostavilo se da je receptor kriv, ali suština je jasna, barem se nadam da je tako. Nakon aktivacije slijedi diferencijacija: ćelija se dijeli, a njeni potomci mogu postati efektorske ćelije. Ovo važi i za T- i B-limfocite. Kada se aktivira, limfocit proizvodi efektorske i memorijske ćelije. Memorijske ćelije se pohranjuju dugo vremena, a kao rezultat podjele, dobiva se puno njih. Kada isti patogen ponovo uđe, veća je vjerovatnoća da će naletjeti na memorijsku ćeliju, što će izazvati brzi imunološki odgovor. Efektor B-limfociti su fabrike za proizvodnju imunoglobulina. Dakle, efektorski B-limfociti - proizvode imunoglobulin. Logika je sledeća: pošto se antitelo približava antigenu koji je ušao u telo, trebalo bi da se sintetiše više. Sav proizvodni kapacitet ćelije koristi se za sintezu antitijela. Reći ću vam jednu činjenicu koju mi je supruga sugerirala. Čujem kako sam snimio zadnji video. Ona je specijalista za hematologiju i razumije se u imunologiju, tako da joj vjerujem u ovome: ona je stručnjak za to. U prošlom videu sam nepromišljeno izjavio da antitijela proizvode aktivirani efektorski B-limfociti. Tako je i stvarno - antitijela proizvode isključivo B-limfociti. Međutim, ćelije koje luče antitijela imaju svoje ime. Ovi efektorski B limfociti se obično nazivaju plazma ćelijama. Zapisaću termin. U toku diferencijacije naziv se mijenja. Ovo je naziv B-limfocita, koji je počeo da luči antitela. Nakon toga se isključivo naziva plazma ćelija. Dakle, na pitanje koje ćelije proizvode antitijela, nemojte odgovoriti da su to B-limfociti. Tačan odgovor je: plazma ćelije. Ovo je uobičajen izraz koji se koristi u imunologiji kao i u reumatologiji. Izvinite, jesam li rekao da mi je žena hematolog? Ne, ona je reumatolog. Ponekad se zbunim oko ovoga. Dakle, suština B-limfocita je proizvodnja antitijela koja će se vezati za antigene virusa ili bakterija i učiniti ih vidljivima za makrofage i druge fagocite. Ali to je sve o njima, sada pređimo na T-limfocite. Reći ću o njima ono što nije bilo u prethodnim videima. Dakle, postoje dvije vrste T-limfocita. Već znate za pomagače i citotoksične T-limfocite, ali postoji još jedna klasifikacija limfocita, o kojoj ću vam reći. Dakle, postoje dvije varijante. Oba imaju T-ćelijski receptor. Nacrtaću ga ovako. T-ćelijski receptor. Osim toga, na njihovim membranama postoji niz drugih proteina. Neki T-limfociti imaju membranski protein koji se zove CD4. CD4. Drugi T-limfociti imaju još jedan protein - ovo je CD8. I mi ćemo to potpisati. CD8. Limfocit na desnoj strani naziva se CD8-pozitivni T-limfocit. Ima CD8 na svojoj membrani. A evo i CD4-pozitivnog T-limfocita. Evo dvije varijante. Dijele se prema ovim proteinima. CD4 protein je receptor koji ima afinitet za proteine MHC klase 2. Većina CD4-pozitivnih ćelija su T pomoćnici. U većini slučajeva, ako se u razgovoru spominju CD4-pozitivne ćelije, onda se iz navike misli upravo na pomoćne T-limfocite. Obično pričaju o njima. Možda ću potpisati - T-helper. CD8 receptor ima afinitet za MHC klasu 1. Ovo pokazujemo na slici. U ćelijama raka, MHC klase 1 na membrani je povezan sa antigenima raka. Stoga je CD8 karakterističan za citotoksične limfocite. CD8 je karakterističan za citotoksične limfocite. Obično, prije nego što se ćelija aktivira, naziva se CD4- ili CD8-pozitivna, a funkcija limfocita se kaže nakon aktivacije. Već posle. Ovo su terminološke karakteristike. Nadam se da ste shvatili suštinu. Sada se prisjetimo šta radi ovaj limfocit. Veže se za MHC proteine koji se nalaze na membrani zajedno sa antigenima. Evo MHC klase 1. Kao što sam rekao u prošlom videu, svaka ćelija sa jezgrom ga ima. Recimo da se nešto loše dogodilo u kavezu. Nešto loše, možda je virus. Možda rak. Zahvaćena stanica mora umrijeti, inače će kopirati virus ili će se umnožiti ako je tumor. Dakle, CD8-pozitivni T-limfociti ubijaju ćelije zahvaćene virusom ili onkologijom. Oni ubijaju zahvaćene ćelije koje bi inače mogle ugroziti cijelo tijelo u cjelini. T-pomagači su sasvim druga stvar. Uzmimo dendritsku ćeliju, ćeliju koja predstavlja antigen. Ona ima MHC klasu 2, na koju su povezani fragmenti digestiranog antigena. Aktivira pomoćne T-limfocite, koji se dijele i diferenciraju u efektorske i memorijske ćelije. Efektorski T-limfocit ima nekoliko funkcija. Pomoćni T-limfocit aktivira B-limfocite i oslobađa citokine. Oslobađa citokine. Aktivirani limfocit oslobađa mnoge tvari koje služe kao signal drugim stanicama, kao što su drugi limfociti, istovremeno podižući uzbunu. Neki od ovih citokina pomažu citotoksičnim limfocitima u njihovoj aktivaciji. Citokini podižu uzbunu i CD8-pozitivni, odnosno citotoksični T-limfociti, efektorski limfociti, uzimaju se da ubiju ćelije. Što se tiče memorijskih ćelija, radi se o kopijama originalnih limfocita koji su trajno pohranjeni na ovom mjestu u slučaju ponavljanja prijetnje, kako bi se obezbijedio brži odgovor. Nadam se da vas nisam previše zbunio novim terminima, ali bilo je neophodno. A sada znate da antitijela ne sintetiziraju B-limfociti, ne oni, već stanice koje imaju svoje ime. To su plazma ćelije ili plazmociti.
Vrste T-limfocita
T-limfociti koji pružaju centralnu regulaciju imunološkog odgovora.
Diferencijacija u timusu
Sve T ćelije potiču od matičnih ćelija hematopoetske crvene koštane srži koje migriraju u timus i diferenciraju se u nezrele timociti. Timus stvara mikrookruženje neophodno za razvoj potpuno funkcionalnog repertoara T ćelija koji je MHC-ograničen i samotolerantan.
Diferencijacija timocita se dijeli na različite faze ovisno o ekspresiji različitih površinskih markera (antigena). U vrlo ranoj fazi, timociti ne eksprimiraju CD4 i CD8 ko-receptore i stoga su klasifikovani kao dvostruko negativni (Dvostruko negativni (DN)) (CD4-CD8-). U sledećoj fazi, timociti eksprimiraju oba koreceptora i nazivaju se dvostruko pozitivnim (eng. Double Positive (DP) ) (CD4+CD8+). Konačno, u završnoj fazi se biraju ćelije koje eksprimiraju samo jedan od ko-receptora (eng. Single Positive (SP)): ili (CD4+) ili (CD8+).
Rana faza se može podijeliti u nekoliko podfaza. Dakle, na DN1 podstadiju (engleski Double Negative 1), timociti imaju sljedeću kombinaciju markera: CD44 + CD25 -CD117 +. Ćelije sa ovom kombinacijom markera nazivaju se i rani limfoidni progenitori. Rani limfoidni progenitori (ELP)). Napredujući u svojoj diferencijaciji, ELP se aktivno dijele i konačno gube sposobnost transformacije u druge tipove stanica (na primjer, B-limfocite ili mijeloične ćelije). Prelazeći u DN2 podfazu (eng. Double Negative 2 ), timociti eksprimiraju CD44 + CD25 + CD117 + i postaju rani T-ćelijski progenitori (eng. Rani T-ćelijski progenitori (ETP)). Tokom DN3 podfaze (eng. Double Negative 3 ), ETP ćelije imaju kombinaciju CD44-CD25 + i ulaze u proces β-selekcija.
β izbor
Geni T ćelijski receptor sastoje se od segmenata koji se ponavljaju koji pripadaju trima klasama: V (eng. variable), D (eng. diversity) i J (eng. joining). Tokom somatske rekombinacije, segmenti gena, po jedan iz svake klase, su povezani zajedno (V(D)J rekombinacija). Slučajna kombinacija sekvenci V(D)J segmenta rezultira jedinstvenim sekvencama varijabilnog domena za svaki od lanaca receptora. Slučajna priroda formiranja sekvenci varijabilnih domena omogućava stvaranje T ćelija sposobnih da prepoznaju veliki broj različite antigene i, kao rezultat, pružaju efikasniju zaštitu od patogena koji se brzo razvijaju. Međutim, ovaj isti mehanizam često dovodi do stvaranja nefunkcionalnih podjedinica T-ćelijskog receptora. Geni koji kodiraju β-podjedinicu receptora su prvi koji prolaze kroz rekombinaciju u DN3 ćelijama. Da bi se isključila mogućnost stvaranja nefunkcionalnog peptida, β-podjedinica formira kompleks sa nepromjenjivom α-podjedinicom pre-T-ćelijskog receptora, formirajući tzv. receptor pre-T ćelija (pre-TCR). Stanice koje nisu u stanju da formiraju funkcionalni pre-TCR umiru apoptozom. Timociti koji su uspješno prošli β-selekciju prelaze u DN4 podstadij (CD44 -CD25 -) i prolaze kroz proces pozitivna selekcija.
pozitivna selekcija
Ćelije koje eksprimiraju pre-TCR na svojoj površini još uvijek nisu imunokompetentne, jer nisu u stanju da se vežu za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti. Prepoznavanje MHC molekula od strane T-ćelijskog receptora zahtijeva prisustvo CD4 i CD8 ko-receptora na površini timocita. Formiranje kompleksa između pre-TCR i CD3 koreceptora dovodi do inhibicije rearanžmana gena β-podjedinice i istovremeno izaziva aktivaciju ekspresije CD4 i CD8 gena. Tako timociti postaju dvostruko pozitivni (DP) (CD4+CD8+). DP timociti aktivno migriraju u korteks timus, gdje stupaju u interakciju s kortikalnim epitelnim stanicama koje eksprimiraju proteine obje MHC klase (MHC-I i MHC-II). Stanice koje nisu u stanju da stupe u interakciju sa MHC proteinima kortikalnog epitela prolaze kroz apoptozu, dok ćelije koje uspešno izvode takvu interakciju počinju da se aktivno dele.
negativnu selekciju
Timociti koji su prošli pozitivnu selekciju počinju da migriraju do kortiko-medularne granice timusa. Jednom u meduli, timociti stupaju u interakciju s vlastitim antigenima tijela, predstavljenim u kombinaciji s MHC proteinima na epitelnim stanicama medularnog timusa (mTEC). Timociti koji aktivno stupaju u interakciju s vlastitim antigenima prolaze kroz apoptozu. negativnu selekciju sprečava pojavu samoaktivirajućih T-ćelija sposobnih da izazovu klonove autoimune bolesti. Neke od ćelija u ovom klonu se pretvaraju u efektorske T ćelije, koji obavljaju funkcije specifične za ovu vrstu limfocita (na primjer, luče citokine u slučaju T-pomoćnika ili liziraju zahvaćene stanice u slučaju T-ubica). Drugi dio aktiviranih ćelija se transformiše u T-ćelije pamćenje. Memorijske ćelije ostaju u neaktivnom obliku nakon početnog kontakta s antigenom sve dok se ne dogodi ponovljena interakcija s istim antigenom. Dakle, memorijske T-ćelije pohranjuju informacije o antigenima koji su ranije djelovali i pružaju sekundarni imunološki odgovor koji se odvija u kraćem vremenu od primarnog.
Interakcija T-ćelijskog receptora i ko-receptora (CD4, CD8) sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti važna je za uspješnu aktivaciju naivnih T ćelija, ali sama po sebi nije dovoljna za diferencijaciju u efektorske ćelije. Za naknadnu proliferaciju aktiviranih ćelija, interakcija tzv. kostimulatorni molekuli. Za T pomagače, ovi molekuli su CD28 receptor na površini T ćelije i imunoglobulin B7 na površini ćelije koja predstavlja antigen.
Glavni zadatak T-limfocita je prepoznavanje stranih ili izmijenjenih vlastitih antigena kao dijela kompleksa sa MHC molekulima. Ako su strani ili izmijenjeni molekuli prisutni na površini njihovih stanica, T-limfocit počinje njihovo uništavanje.
Za razliku od B limfocita, T limfociti ne proizvode rastvorljive oblike molekula za prepoznavanje antigena. Štaviše, većina T-limfocita nije u stanju prepoznati i vezati rastvorljive antigene.
Da bi T-limfocit "skrenuo pažnju na antigen", druge ćelije moraju nekako "proći" antigen kroz sebe i izložiti ga na svojoj membrani u kombinaciji sa MHC-I ili MHC-II. Ovo je fenomen prezentacije antigena T-limfocitu. Prepoznavanje takvog kompleksa od strane T-limfocita je dvostruko prepoznavanje, ili MHC restrikcija T-limfocita.
RECEPTOR T-LIMFOCITA KOJI PREPOZNA ANTIGEN
Receptori T-ćelija koji prepoznaju antigen - TCR se sastoje od lanaca koji pripadaju superfamiliji imunoglobulina (vidi sliku 5-1). Mjesto za prepoznavanje antigena TCR-a koje strši iznad površine ćelije je heterodimer, tj. sastoji se od dva različita polipeptidna lanca. Poznate su dvije varijante TCR-a, koje se nazivaju αβTCR i γδTCR. Ove varijante se razlikuju po sastavu polipeptidnih lanaca mjesta za prepoznavanje antigena. Svaki T-limfocit izražava samo 1 varijantu receptora. αβT ćelije su otkrivene ranije i proučavane detaljnije od γδT limfocita. U tom smislu, strukturu receptora za prepoznavanje antigena T-limfocita je pogodnije opisati na primjeru αβTCR. Transmembranski lociran TCR kompleks sastoji se od 8 polipeptida
Rice. 6-1. Dijagram T-ćelijskog receptora i srodnih molekula
lanci (heterodimer α- i β-lanaca samog TCR-a, dva pomoćna ζ lanca, kao i jedan heterodimer ε/δ- i ε/γ-lanaca molekula CD3) (slika 6-1).
. Transmembranski lanciα i β TCR. Ovo su 2 polipeptidna lanca približno iste veličine -α (molekulska masa 40-60 kDa, kiseli glikoprotein) iβ (molekulska masa 40-50 kDa, neutralni ili bazični glikoprotein). Svaki od ovih lanaca sadrži 2 glikozilovana domena u ekstracelularnom dijelu receptora, hidrofobni (pozitivno nabijen zbog ostataka lizina i arginina) transmembranski dio i kratki (od 5-12 aminokiselinskih ostataka) citoplazmatski region. Ekstracelularni dijelovi oba lanca povezani su jednom disulfidnom vezom.
- V-regija. Vanjski ekstracelularni (distalni) domeni oba lanca imaju promjenjiv sastav aminokiselina. Oni su homologni V regiji molekula imunoglobulina i čine V regiju TCR-a. V-regije α- i β-lanaca se vezuju za MHC-peptidni kompleks.
-C-regija. Proksimalni domeni oba lanca su homologni konstantnim regionima imunoglobulina; ovo su C-regije TCR-a.
Kratka citoplazmatska regija (i α- i β-lanci) ne može samostalno osigurati prijenos signala u ćeliju. Za to služi 6 dodatnih polipeptidnih lanaca: γ, δ, 2ε i 2ζ.
.CD3 kompleks. lancimaγ, δ, ε formiraju heterodimere međusobno.γε i δε (koji se zajednički nazivaju CD3 kompleks). Ovaj kompleks je neophodan za izražavanjeα- i β-lanaca, njihovu stabilizaciju i prijenos signala u ćeliju. Ovaj kompleks se sastoji od ekstracelularnog, transmembranskog (negativno nabijenog i stoga elektrostatički povezanog sa transmembranskim regijamaα- i β-lancima) i citoplazmatskim dijelovima. Važno je ne brkati lance CD3 kompleksa saγ δ-lanci TCR dimera.
.ζ -Lanci međusobno povezani disulfidnim mostom. Večina ovih lanaca nalazi se u citoplazmi. ζ-lanci provode signal unutar ćelije.
.ITAM sekvence. Citoplazmatski regioni polipeptidnih lanacaγ, δ, ε i ζ sadrže 10 ITAM sekvenci (po 1 sekvencu u svakojγ-, ε- i δ-lanci i 3 - u svakom ζ-lancu), u interakciji sa Fyn - citosolnom tirozin kinazom, čija aktivacija inicira početak biohemijskih reakcija za sprovođenje signala (vidi sliku 6-1).
Vezivanje antigena uključuje jonske, vodikove, van der Waalsove i hidrofobne sile; konformacija receptora se u ovom slučaju značajno mijenja. Teoretski, svaki TCR je u stanju da veže oko 10 5 različitih antigena, ne samo povezanih po strukturi (unakrsna reakcija), već i ne homolognih po strukturi. Međutim, u stvarnosti, TCR polispecifičnost je ograničena na prepoznavanje samo nekoliko strukturno sličnih antigenskih peptida. Strukturna osnova ovog fenomena je karakteristika istovremenog TCR prepoznavanja MHC-peptidnog kompleksa.
Molekule koreceptora CD4 i CD8
Pored samog TCR-a, svaki zreli T-limfocit eksprimira jedan od takozvanih ko-receptorskih molekula, CD4 ili CD8, koji također stupaju u interakciju s MHC molekulima na APC-ovima ili ciljnim stanicama. Svaki od njih ima povezanu citoplazmatsku regiju
sa tirozin kinazom Lck, i vjerovatno doprinosi prijenosu signala u ćeliju tokom prepoznavanja antigena.
.CD4(β2-domen) molekula MHC-II (pripada superfamiliji imunoglobulina, vidi sliku 5-1, b). CD4 ima molekularnu težinu od 55 kDa i 4 domena u ekstracelularnom dijelu. Kada je T-limfocit aktiviran, jedan TCR molekul se "opslužuje" sa 2 CD4 molekula: vjerovatno dolazi do dimerizacije molekula CD4.
.CD8 povezan sa nepromenljivim delom(α3-domen) molekula MHC-I (pripada superfamiliji imunoglobulina, vidi sliku 5-1, a). CD8 - lančani heterodimerα i β, povezani disulfidnom vezom. U nekim slučajevima, pronađen je dvolančani α-lanac homodimera koji također može stupiti u interakciju sa MHC-I. U ekstracelularnom dijelu svaki od lanaca ima po jednu domenu nalik imunoglobulinu.
Geni receptora T ćelija
Geni α-, β-, γ- i δ-lanci (Slika 6-2, takođe videti Sliku 5-4) su homologni genima imunoglobulina i prolaze kroz DNK rekombinaciju tokom diferencijacije T-limfocita, što teoretski obezbeđuje stvaranje oko 10 16 -10 18 varijanti receptora za vezivanje antigena (u stvarnosti, ova raznolikost je ograničena brojem limfocita u tijelu na 109).
.Geni α-lanca imaju ~54 V-segmenta, 61 J-segment i 1 C-segment.
.Geni β-lanca sadrže ~65 V-segmenata, 2 D-segmenta, 13 J-segmenata i 2 C-segmenta.
.δ-lančani geni. Između V- i J-segmenata α-lanca nalaze se geni za D-(3), J-(4) i C-(1) segmente δ-lancaγ δTCR. V segmenti δ lanca su "isprepleteni" među V segmentima α lanca.
.Geni γ-lanca γ δTCR imaju 2 C segmenta, 3 J segmenta prije prvog C segmenta i 2 J segmenta prije drugog C segmenta, 15 V segmenta.
Preuređenje gena
.Do rekombinacije DNK dolazi kada se V-, D- i J-segmenti kombinuju i katalizira je isti kompleks rekombinaza kao i tokom diferencijacije B-limfocita.
.Nakon preuređivanja VJ u genima α-lanca i VDJ u genima β-lanca, kao i nakon dodavanja nekodiranih N- i P-nukleotida u DNK
Rice. 6-2. Geni α- i β-lanaca receptora za prepoznavanje antigena humanih T-limfocita
RNA se transkribuje. Povezivanje sa C-segmentom i uklanjanje suvišnih (neiskorištenih) J-segmenata javlja se tokom spajanja primarnog transkripta.
.Geni α-lanca mogu se više puta preuređivati kada su geni β-lanca već pravilno preuređeni i eksprimirani. Zbog toga postoji određena mogućnost da jedna ćelija može nositi više od jedne TCR varijante.
.TCR geni ne prolaze kroz somatsku hipermutagenezu.
PRENOS SIGNALA SA RECEPTORA LIMFOCITA KOJI PREPOZNAJU ANTIGEN
TCR i BCR imaju niz zajedničkih obrazaca registracije i prijenosa aktivacijskih signala u ćeliju (vidi sliku 5-11).
. Grupisanje receptora. Za aktiviranje limfocita potrebno je grupisanje receptora koji prepoznaju antigen i ko-receptora, tj. „unakrsno povezivanje” nekoliko receptora sa jednim antigenom.
. Tirozin kinaze. Procesi fosforilacije/defosforilacije proteina na ostatku tirozina pod dejstvom tirozin kinaza i tirozin fosfataza imaju značajnu ulogu u prenosu signala,
što dovodi do aktivacije ili inaktivacije ovih proteina. Ovi procesi su lako reverzibilni i "zgodni" za brze i fleksibilne reakcije ćelija na vanjske signale.
. Src kinaze. ITAM sekvence bogate tirozinom citoplazmatskih regiona imunoreceptora fosforiliraju se pod dejstvom nereceptorskih (citoplazmatskih) tirozin kinaza Src familije (Fyn, Blk, Lyn u B-limfocitima, Lck i Fyn u T-limfocitima).
. ZAP-70 kinaze(u T-limfocitima) ili Syk(u B-limfocitima), vezujući se za fosforilirane ITAM sekvence, aktiviraju se i počinju fosforilirati adapterske proteine: LAT (linker za aktivaciju T ćelija)(ZAP-70 kinaza), SLP-76 (ZAP-70 kinaza) ili SLP-65 (Syk kinaza).
. Adapterski proteini se regrutuju fosfoinozitid-3-kinaza(PI3K). Ova kinaza zauzvrat aktivira serin/treonin protein kinazu Akt, uzrokujući povećanje biosinteze proteina, što potiče ubrzani rast stanica.
. Fosfolipaza Cγ (vidi sliku 4-8). Kinaze iz porodice Tec (Btk - u B-limfocitima, Itk - u T-limfocitima) vezuju adapterske proteine i aktiviraju fosfolipazu Cγ (PLCγ ).
PLCγ cijepa fosfatidilinozitol difosfat (PIP 2) stanične membrane na inozitol-1,4,5-trifosfat (IP 3) i diacilglicerol
(DAG).
DAG ostaje u membrani i aktivira protein kinazu C (PKC), serin/treonin kinazu koja aktivira evolucijski "drevni" faktor transkripcije NFκB.
IP 3 se vezuje za svoj receptor u endoplazmatskom retikulumu i oslobađa jone kalcijuma iz depoa u citosol.
Slobodni kalcij aktivira proteine koji vežu kalcij - kalmodulin koji reguliše aktivnost niza drugih proteina i kalcineurin koji defosforilira i time aktivira nuklearni faktor aktiviranih T-limfocita NFAT (Nuklearni faktor aktiviranih T ćelija).
. Ras i drugi mali G proteini u neaktivnom stanju, oni su povezani sa GDP, ali adapterski proteini zamenjuju potonje sa GTP, koji prevodi Ras u aktivno stanje.
Ras ima sopstvenu GTPazu aktivnost i brzo odvaja treći fosfat, vraćajući se na taj način u neaktivno stanje (samo-inaktivirajući).
U stanju kratkotrajne aktivacije, Ras ima vremena da aktivira sljedeću kaskadu kinaza zvanu MAPK (Protein kinaza aktivirana mitogenom), koji na kraju aktiviraju transkripcijski faktor AP-1 u ćelijskom jezgru. Na sl. 6-3 šematski predstavljaju glavne signalne puteve sa TCR-om. Aktivacijski signal se uključuje kada se TCR veže za ligand (kompleks MHC-peptida) uz učešće ko-receptora (CD4 ili CD8) i kostimulatorne molekule CD28. Ovo dovodi do aktivacije Fyn i Lck kinaza. ITAM regioni u citoplazmatskim delovima CD3 polipeptidnih lanaca označeni su crvenom bojom. Prikazana je uloga Src-kinaza povezanih sa receptorom u fosforilaciji proteina, receptorskih i signalnih. Skreće se pažnja na izuzetno širok spektar efekata Lck kinaze povezanih sa koreceptorima; uloga Fyn kinaze je utvrđena s manje sigurnosti (oslikava se u diskontinuiranom karakteru linija).
Rice. 6-3. Izvori i smjer pokretanja aktivacijskih signala tokom stimulacije T-limfocita. Oznake: ZAP-70 (ζ -povezana protein kinaza, oni kazu masa 70 kDa) - p70 protein kinaza povezana sa ζ lancem; PLCγ (fosfolipaza Cγ ) - fosfolipaza C, izoforma γ; PI3K (fosfatidil inozitol 3-kinaza)- fosfatidilinozitol 3-kinaza; Lck, Fyn -tirozin kinaze; LAT, Grb, SLP, GADD, Vav - adapterski proteini
Tirozin kinaza ZAP-70 igra ključnu ulogu u posredovanju između receptorskih kinaza i adapterskih molekula i enzima. Aktivira (putem fosforilacije) adapterske molekule SLP-76 i LAT, a potonji prenosi aktivacijski signal drugim adapterskim proteinima GADD, GRB i aktivira γ-izoformu fosfolipaze C (PLCy). Do ove faze, prijenos signala uključuje samo faktore koji se odnose na stanične membrane. Važan doprinos aktivaciji signalnih puteva daje kostimulatorni molekul CD28, koji svoje djelovanje ostvaruje preko povezane lipid kinaze PI3K. (fosfatidil inozitol 3-kinaza). Glavni cilj PI3K kinaze je Vav faktor povezan sa citoskeletom.
Kao rezultat formiranja signala i njegovog prijenosa od T-ćelijskog receptora do jedra, formiraju se 3 transkripcijska faktora - NFAT, AP-1 i NF-kB, koji indukuju ekspresiju gena koji kontroliraju proces aktivacije T-limfocita. (Sl. 6-4). Formiranje NFAT dovodi do signalnog puta koji je neovisan o kostimulaciji, koji se uključuje aktivacijom fosfolipaze C i ostvaruje se uz učešće jona.
Rice. 6-4.Šema signalnih puteva tokom aktivacije T-ćelija. NFAT (nuklearni faktor aktiviranih T ćelija), AP-1 (aktivacijski protein-1), NF-κB (Nuklearni faktor odTo -gen B ćelija)- faktori transkripcije
Ca 2+ . Ovaj put uzrokuje aktivaciju kalcineurina, koji, uz aktivnost fosfataze, defosforilira citosolni faktor NFAT-P. Zbog toga, NFAT-P stiče sposobnost da migrira u jezgro i veže se za promotore aktivacijskih gena. Faktor AP-1 nastaje kao heterodimer c-Fos i c-Jun proteina, čije se stvaranje indukuje aktivacijom odgovarajućih gena pod uticajem faktora koji su rezultat implementacije tri komponente MAP kaskade. . Ovi putevi se uključuju kratkim GTP-vezujućim proteinima Ras i Rac. Značajan doprinos implementaciji MAP kaskade daju signali koji zavise od kostimulacije kroz molekul CD28. Poznato je da je treći transkripcijski faktor, NF-kB, glavni transkripcijski faktor u ćelijama. urođeni imunitet. Aktivira se cijepanjem blokirajuće podjedinice IkB pomoću IKK kinaze, koja se aktivira u T ćelijama tokom transdukcije signala zavisne od izoforme kinaze C (PKC9). Glavni doprinos aktivaciji ovog signalnog puta daju kostimulatorni signali sa CD28. Formirani faktori transkripcije, koji kontaktiraju promotorske regije gena, indukuju njihovu ekspresiju. Za početnim fazama Odgovori T-ćelija na stimulaciju, ekspresija gena je posebno važna IL2 I IL2R, koji uzrokuje proizvodnju faktora rasta T-ćelija IL-2 i ekspresiju njegovog receptora visokog afiniteta na T-limfocitima. Kao rezultat, IL-2 djeluje kao autokrini faktor rasta, koji određuje proliferativnu ekspanziju klonova T-ćelija uključenih u reakciju na antigen.
DIFERENCIJACIJA T-LIMFOCITA
Identifikacija faza u razvoju T-limfocita zasniva se na stanju receptorskih V-gena i ekspresije TCR, kao i ko-receptora i drugih membranskih molekula. Šema diferencijacije T-limfocita (slika 6-5) je slična gornjoj šemi za razvoj B-limfocita (vidi sliku 5-13). Prikazane su ključne karakteristike fenotipa i faktora rasta T ćelija u razvoju. Prihvaćene oznake faza razvoja T-ćelija određene su ekspresijom koreceptora: DN (od dvostruko negativan, CD4CD8) - dvostruki negativ, DP (od dvostruko pozitivan, CD4 + CD8 +) - dvostruko pozitivno, SP (od jednostruko pozitivno, CD4 + CD8 - i CD4CD8 +) - pojedinačni pozitivni. Podjela DNtimocita na stadijume DN1, DN2, DN3 i DN4 zasniva se na prirodi
Rice. 6-5. Razvoj T-limfocita
ekspresija CD44 i CD25 molekula. Ostali simboli: SCF (od Faktor matičnih ćelija- faktor matičnih ćelija, lo (nizak; indeksna oznaka) - nizak nivo ekspresije. Faze preuređivanja: D-J - preliminarni stadijum, povezivanje segmenata D i J (samo u genima TCR β- i δ-lanaca, vidi sl. 6-2), V-DJ - završni stadijum, veza V-gena zametne linije sa kombinovanim DJ segmentom.
.Timociti se razlikuju od zajedničke progenitorske ćelije koja, izvan timusa, eksprimira membranske markere kao što su CD7, CD2, CD34 i citoplazmatski oblik CD3.
.Progenitorske ćelije posvećene diferencijaciji u T-limfocite migriraju iz koštane srži u subkapsularnu zonu korteksa timusa, gdje polako proliferiraju otprilike jednu sedmicu. Novi membranski molekuli CD44 i CD25 pojavljuju se na timocitima.
.Zatim se ćelije kreću duboko u korteks timusa, molekuli CD44 i CD25 nestaju sa njihove membrane. U ovoj fazi dolazi do preuređivanja gena β-, γ- i δ-lanci TCR. Ako su geniγ- a δ-lanci su produktivni, tj. bez pomaka okvira, preurediti ranije od gena β-lanca, tada se limfocit dalje diferencira kaoγ δT. Inače, β-lanac je izražen na membrani u kompleksu sa pTα (invarijantni surogat lanac koji u ovoj fazi zamjenjuje pravi α-lanac) i CD3. Služi
signal za zaustavljanje preuređivanja gena γ- i δ-lanaca. Ćelije počinju da se razmnožavaju i izražavaju i CD4 i CD8 - dvostruko pozitivno timociti. Istovremeno se nakuplja masa ćelija sa već pripremljenim β-lancem, ali sa još nerearanžiranim genima α-lanca, što doprinosi raznolikosti αβ-heterodimera.
.U sljedećoj fazi, stanice prestaju da se dijele i počinju da preuređuju Vα gene nekoliko puta u roku od 3-4 dana. Preuređenje gena α-lanca dovodi do ireverzibilnog brisanja δ-lokusa koji se nalazi između segmenata gena α-lanca.
.TCR se izražava sa svakom novom verzijom α-lanca i selekcijom (selekcija) timocita prema jačini vezivanja za MHC-peptidni kompleks na membranama epitelnih ćelija timusa.
Pozitivna selekcija: timociti koji ne vežu nijedan od dostupnih MHC-peptidnih kompleksa umiru. Kao rezultat pozitivne selekcije, oko 90% timocita umire u timusu.
Negativna selekcija eliminira klonove timocita koji vežu komplekse MHC-peptida sa previsokim afinitetom. Negativna selekcija eliminira 10 do 70% pozitivno odabranih ćelija.
Timociti koji su vezali bilo koji od MHC-peptidnih kompleksa sa ispravnim, tj. srednje jačine, afiniteta, primaju signal za preživljavanje i nastavljaju diferencijaciju.
.Za kratko vrijeme oba molekula koreceptora nestaju sa membrane timocita, a zatim dolazi do ekspresije jednog od njih: timociti koji prepoznaju peptid u kompleksu sa MHC-I eksprimiraju CD8 koreceptor, a sa MHC-II, CD4 koreceptor. Shodno tome, na periferiju ulaze dvije vrste T-limfocita (u omjeru oko 2:1): CD8+ i CD4+, čije su funkcije u predstojećim imunološkim odgovorima različite.
-CD8+ T ćelije igraju ulogu citotoksičnih T-limfocita (CTL) – prepoznaju i direktno ubijaju ćelije modifikovane virusom, tumor i druge „promenjene“ ćelije (sl. 6-6).
-CD4 + T ćelije. Funkcionalna specijalizacija CD4 + T-limfocita je raznovrsnija. Značajan dio CD4 + T-limfocita tokom razvoja imunološkog odgovora postaje T-pomagači (pomagači) u interakciji sa B-limfocitima, T-limfocitima i drugim ćelijama tokom
Rice. 6-6. Mehanizam djelovanja citotoksičnih T-limfocita na ciljnu ćeliju. U T-killeru, kao odgovor na povećanje koncentracije Ca 2+, granule s perforinom (ljubičasti ovali) i granzimi (žuti krugovi) spajaju se sa ćelijskom membranom. Oslobođeni perforin se ugrađuje u ciljnu ćelijsku membranu, nakon čega dolazi do formiranja pora propusnih za granzime, vodu i ione. Kao rezultat, ciljna ćelija se lizira
direktnim kontaktom ili putem rastvorljivih faktora (citokina). U određenim slučajevima mogu razviti CD4 + CTL: posebno se takvi T-limfociti nalaze u značajnim količinama na koži pacijenata s Lyellovim sindromom.
Subpopulacije T-pomagača
Od kraja 80-ih godina XX veka uobičajeno je da se izoluju 2 subpopulacije T-pomagača (u zavisnosti od toga koji skup citokina proizvode) - Th1 i Th2. IN poslednjih godina spektar subpopulacija CD4+ T ćelija nastavlja da se širi. Pronađene su subpopulacije kao što su Th17, T-regulatori, Tr1, Th3, Tfh, itd.
Glavne subpopulacije CD4+ T ćelija:
. Th0- CD4 + T-limfociti uključeni ranim fazama razvoj imunološkog odgovora, proizvode samo IL-2 (mitogen za sve limfocite).
.Th1- diferencirana subpopulacija CD4 + T-limfocita, specijalizovana za proizvodnju IFN-aγ, TNF β i IL-2. Ova subpopulacija reguliše mnoge ćelijske imune odgovore, uključujući hipersenzitivnost odgođenog tipa (DTH) i aktivaciju CTL. Pored toga, Th1 stimuliše proizvodnju opsonizirajućih IgG antitijela od strane B-limfocita, koji pokreću kaskadu aktivacije komplementa. Razvoj prekomjerne upale s naknadnim oštećenjem tkiva direktno je povezan s aktivnošću Th1 subpopulacije.
.Th2- diferencirana subpopulacija CD4 + T-limfocita, specijalizirana za proizvodnju IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i IL-13. Ova subpopulacija je uključena u aktivaciju B-limfocita i doprinosi njihovom izlučivanju velikih količina antitijela. različite klase posebno IgE. Osim toga, Th2 subpopulacija je uključena u aktivaciju eozinofila i razvoj alergijskih reakcija.
.Th17- subpopulacija CD4 + T-limfocita, specijalizirana za stvaranje IL-17. Ove ćelije provode antifungalnu i antimikrobnu zaštitu epitelnih i mukoznih barijera, a imaju i ključnu ulogu u patologiji autoimunih bolesti.
.T-regulatori- CD4 + T-limfociti koji potiskuju aktivnost drugih ćelija imunog sistema kroz lučenje imunosupresivnih citokina - IL-10 (inhibitor aktivnosti makrofaga i Th1 ćelija) i TGFβ - inhibitor proliferacije limfocita. Inhibicijski efekat se može postići i direktnom međućelijskom interakcijom, budući da membrana nekih T-regulatora eksprimira induktore apoptoze aktiviranih i „iscrpljenih“ limfocita – FasL (Fas-ligand). Postoji nekoliko populacija CD4 + regulatornih T-limfocita: prirodne (Treg), sazrijevaju u timusu (CD4 + CD25 +, eksprimiraju transkripcijski faktor Foxp3) i inducirane - lokalizirane uglavnom u sluznicama probavnog trakta i prebačene na formiranje TGFβ (Th3) ili IL-10 (Tr1). Normalno funkcionisanje T-regulatora neophodno je za održavanje homeostaze imunog sistema i sprečavanje razvoja autoimunih bolesti.
.Dodatne populacije pomagača. Nedavno je postojao opis sve novih populacija CD4 + T-limfocita, klase
klasificirane prema vrsti citokina koje pretežno proizvode. Dakle, kako se ispostavilo, jedna od najvažnijih populacija su Tfh (od engleskog. folikularni pomoćnik- folikularni pomoćnik). Ova populacija CD4+ T limfocita se pretežno nalazi u limfoidni folikuli i obavlja pomoćnu funkciju za B-limfocite kroz proizvodnju IL-21, uzrokujući njihovo sazrijevanje i terminalnu diferencijaciju u plazma ćelije. Osim IL-21, Tfh također može proizvesti IL-6 i IL-10, koji su neophodni za diferencijaciju B-limfocita. Povreda funkcija ove populacije dovodi do razvoja autoimunih bolesti ili imunodeficijencije. Još jedna "nova" populacija su Th9 - proizvođači IL-9. Očigledno se radi o Th2 koji je prešao na lučenje IL-9, koji je sposoban da izazove proliferaciju T-pomoćnih ćelija u odsustvu antigenske stimulacije, kao i da pojača lučenje IgM, IgG i IgE od strane B. -limfociti.
Glavne subpopulacije T-pomagača prikazane su na sl. 6-7. Brojka je sažeta moderne ideje o adaptivnim subpopulacijama CD4+ T ćelija, tj. formiranje subpopulacija-
Rice. 6-7. Adaptivne subpopulacije CD4+ T ćelija (citokini, faktori diferencijacije, hemokinski receptori)
tokom imunološkog odgovora, a ne tokom prirodnog razvoja ćelija. Za sve vrste T-pomagača, naznačeni su citokini induktora (na strelicama koje vode do krugova koji simboliziraju ćelije), transkripcijski faktori (unutar krugova), receptori hemokina koji usmjeravaju migraciju (blizu linija koje se protežu od "površine ćelije"), i proizvodi citokine (u pravokutnicima na koje pokazuju strelice koje se protežu iz krugova).
Proširenje familije adaptivnih subpopulacija CD4 + T ćelija zahtevalo je rešenje za pitanje prirode ćelija sa kojima te subpopulacije u interakciji (kome pružaju „pomoć“ u skladu sa svojom funkcijom pomagača). Ovi prikazi su prikazani na sl. 6-8. Takođe daje precizan pogled na funkcije ovih subpopulacija (učešće u odbrani od određenih grupa patogena), kao i na patološke posledice neuravnoteženog povećanja aktivnosti ovih ćelija.
Rice. 6-8. Adaptivne subpopulacije T ćelija (partnerske ćelije, fiziološki i patološki efekti)
γ δT-limfociti
Velika većina (99%) T-limfocita koji prolaze kroz limfopoezu u timusu su αβT ćelije; manje od 1% - γδT ćelija. Potonji se uglavnom diferenciraju izvan timusa, prvenstveno u sluznicama probavnog trakta. U koži, plućima, probavnom i reproduktivnom traktu, oni su dominantna subpopulacija intraepitelnih limfocita. Među svim T-limfocitima u tijelu, γδT ćelije čine od 10 do 50%. U embriogenezi, γδT ćelije se pojavljuju prije αβT ćelija.
.γδ T ćelije ne eksprimiraju CD4. Molekul CD8 je izražen na dijelu γδT ćelija, ali ne kao ap heterodimer, kao na CD8 + apT ćelijama, već kao homodimer dva a lanca.
.Svojstva prepoznavanja antigena:γδTCR su sličniji imunoglobulinima nego αβTCR; su u stanju da vežu nativne antigene nezavisno od klasičnih MHC molekula - za γδT ćelije to nije neophodno ili uopšte ne zahteva prethodnu obradu APC antigena.
.Raznolikostγδ TCR manje od αβTCR ili imunoglobulina, iako su općenito γδT ćelije sposobne prepoznati širok spektar antigena (uglavnom fosfolipidne antigene mikobakterija, ugljikohidrate, proteine toplotnog šoka).
.Funkcijeγδ T ćelije još nisu u potpunosti shvaćeni, iako preovlađuje mišljenje da oni služe kao jedna od komponenti povezivanja između urođenog i stečenog imuniteta. γδT ćelije su jedna od prvih barijera za patogene. Osim toga, ove stanice, lučenjem citokina, igraju važnu ulogu u imunoregulaciji i sposobne su da se diferenciraju u CTL.
NKT limfociti
T-ćelije prirodne ubice (NKT-ćelije) predstavljaju posebnu subpopulaciju limfocita, koji zauzimaju međupoziciju između ćelija urođenog i adaptivnog imuniteta. Ove ćelije imaju karakteristike i NK i T limfocita. NKT ćelije eksprimiraju αβTCR i NK1.1 receptor karakterističan za NK ćelije, koji pripada superfamiliji lektinskih glikoproteina C-tipa. Međutim, TCR receptor NKT ćelija se značajno razlikuje od TCR receptora normalnih ćelija. Kod miševa, većina NKT ćelija izražava nepromjenjiv α-lanac V domena koji se sastoji od
segmenti Vα14-Jα18, koji se ponekad nazivaju Jα281. Kod ljudi, α lanac V domena se sastoji od Vα24-JαQ segmenata. Kod miševa, α-lanac invarijantnog TCR-a je pretežno kompleksiran sa Vβ8.2, kod ljudi sa Vβ11. Zbog strukturnih karakteristika TCR lanaca, NKT ćelije se nazivaju invarijantne - iTCR. Razvoj NKT ćelija zavisi od molekule CD1d, koja je slična MHC-I molekulima. Za razliku od klasičnih MHC-I molekula koji predstavljaju peptide T ćelijama, CD1d predstavlja samo glikolipide T ćelijama. Iako se smatra da je jetra mjesto razvoja NKT stanica, postoje jaki dokazi za ulogu timusa u njihovom razvoju. NKT ćelije igraju važnu ulogu u regulaciji imuniteta. Kod miševa i ljudi s različitim autoimunim procesima, funkcionalna aktivnost NKT stanica je ozbiljno narušena. Ne postoji potpuna slika o značaju ovakvih poremećaja u patogenezi autoimunih procesa. U nekim autoimunim procesima, NKT ćelije mogu igrati ulogu supresora.
Osim kontrole autoimunih i alergijskih reakcija, NKT ćelije su uključene u imunološki nadzor, uzrokujući odbacivanje tumora uz povećanje funkcionalne aktivnosti. Njihova uloga u antimikrobnoj zaštiti je velika, posebno u ranim fazama razvoja infektivnog procesa. NKT ćelije su uključene u razne upalne procese infektivnih procesa posebno kod virusnih oboljenja jetre. Općenito, NKT ćelije su multifunkcionalna populacija limfocita koja još uvijek krije mnoge naučne misterije.
Na sl. 6-9 sumiraju podatke o diferencijaciji T-limfocita u funkcionalne subpopulacije. Predstavljeno je nekoliko nivoa bifurkacije: γ δT/ αβT, zatim za αβT ćelije - NKT/ ostali T-limfociti, za potonje - CD4 + /CD8 + , za CD4 + T-ćelije - Th/Treg, za CD8 + T- limfociti - CD8αβ/CD8αα. Prikazani su i faktori transkripcije diferencijacije odgovorni za sve linije razvoja.
Rice. 6-9. Prirodne subpopulacije T-limfocita i njihovi faktori diferencijacije