imunodijagnostičke reakcije. Reakcije antigen-protutijelo i reakcije s obilježenim komponentama. Koristi se za identifikaciju mikroorganizama i dijagnostičke svrhe zarazne bolesti.

Imunološke reakcije koriste se u dijagnostičkim i imunološkim studijama kod bolesnika i zdravi ljudi. U tu svrhu primijenite serološke metode (od lat. serum - serum i logotipi - doktrina), tj. metode proučavanja antitijela i antigena pomoću reakcija antigen-antitijelo utvrđenih u krvnom serumu i drugim tekućinama, kao i tjelesnim tkivima.

Otkrivanje antitijela protiv antigena uzročnika u krvnom serumu pacijenta omogućuje dijagnosticiranje bolesti. Serološkim istraživanjima također se identificiraju mikrobni antigeni, različite biološki aktivne tvari, krvne grupe, tkivni i tumorski antigeni, imunološki kompleksi, stanični receptori itd.

Kada se mikrob izolira iz pacijenta, uzročnik se identificira njegovim proučavanjem. antigenska svojstva korištenjem imunoloških dijagnostičkih seruma, tj. krvnih seruma hiperimuniziranih životinja koji sadrže specifična protutijela. Ovaj tzv serološka identifikacija mikroorganizama.

U mikrobiologiji i imunologiji naširoko se koriste reakcije aglutinacije, precipitacije, reakcije neutralizacije, reakcije koje uključuju komplement, uz korištenje obilježenih protutijela i antigena (radioimunološki, enzimski imunotestovi, metode imunofluorescencije). Navedene reakcije razlikuju se po registriranom učinku i tehnici postavljanja, no sve su bazične. vans na reakciju interakcije antigena s protutijelom i koriste se za otkrivanje i protutijela i antigena. Reakcije imuniteta karakteriziraju visoka osjetljivost i specifičnost.

Slijede principi i sheme glavnih imunoloških dijagnostičke reakcije. Tehnika detalja postavljanje reakcija je dano u. praktične smjernice za imunodijagnostiku.

Reakcija aglutinacije – RA(od lat. agluti- nacija- bonding) - jednostavna reakcija u kojoj protutijela vežu korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge stanice, netopljive čestice na kojima su adsorbirani antigeni, kao i makromolekularne nakupine). Javlja se u prisutnosti elektrolita, na primjer, kada se doda izotonična otopina natrijeva klorida.

Koriste se razne varijante reakcije aglutinacije: proširena, aproksimativna, neizravna itd. Reakcija aglutinacije se očituje stvaranjem ljuskica ili taloga.

RA se koristi za:

određivanje protutijela u krvnom serumu bolesnika, na primjer, s brucelozom (Wrightova, Heddelsonova reakcija), trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija) i druge zarazne bolesti;

određivanje uzročnika izoliranog od pacijenta;

određivanje krvnih grupa monoklonskim antitijelima na alogene eritrocita.

Za određivanje antitijela pacijenta stavitiprodužena reakcija aglutinacije: dodati u razrjeđenja krvnog seruma bolesnika dijagnostikum(suspenzija ubijenih mikroba) i nakon višesatne inkubacije na 37°C bilježi se najveće razrjeđenje seruma (titar seruma) pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. do stvaranja taloga.

Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i protutijela. Primjer je interakcija dijagnostikuma (O- i R-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije sa O-dijagnostikum(bakterije ubijaju toplinom, zadržavajući termostabilan O antigen) javlja se u obliku sitnozrnaste aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formalinom, zadržavajući toplinski labilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.

Ako je potrebno odrediti uzročnika izoliranog od pacijenta, staviti orijentacijska reakcija aglutinacije, pomoću dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), tj. provodi se serotipizacija uzročnika. Približna reakcija provodi se na predmetnom staklu. Kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20 dodati čistu kulturu uzročnika izoliranog od bolesnika. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Kad se u kapi sa serumom i mikrobima pojavi flokulantni talog, stavljaju opsežna reakcija aglutinacije u epruvetama s rastućim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stupnjem bistrenja tekućine. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Istodobno se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini mora biti jednoliko mutna, bez sedimenta.

Različite srodne bakterije mogu se aglutinirati istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, što otežava njihovu identifikaciju. Stoga, uživajte adsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su unakrsno reaktivna protutijela uklonjena adsorpcijom njima srodnih bakterija. U takvim serumima ostaju protutijela specifična samo za ovu bakteriju. Pripravu monoreceptorskih dijagnostičkih aglutinirajućih seruma na ovaj način predložio je A. Castellani (1902.).

Reakcija neizravne (pasivne) hemaglutinacije (RNHA, RPHA) temelji se na korištenju eritrocita s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma kuglice uzrokuje da se eritrociti slijepe i padnu na dno epruvetu ili ćeliju u oblik nazubljenog sedimenta (sl. 13.2). Uz negativnu reakciju, eritrociti se talože u obliku "gumba". Obično se protutijela u RNHA otkrivaju pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, koji se sastoji od eritrocita s adsorbiranim na njih antigene. Ponekad koristimo dijagnostiku antitijela eritrocita, na kojima se antitijela adsorbiraju. Na primjer, botulinum toksin se može otkriti dodavanjem eritrocitnog antitijela botulinum diagnosticum (ova reakcija se zove reverzna reakcija neizravne hemaglutinacije- RONGA). RNHA se koristi za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, određivanje gonadotropnog hormona u urina kada se utvrdi trudnoća, za otkrivanje preosjetljivost do lijekovi, hormoni iu nekim drugim slučajevima.

Reakcija koaglutinacije . Stanice patogena određuju se pomoću stafilokoka, prethodno tretiranih imunološkim dijagnostičkim serumom. Protein koji sadrži stafilokoke I, imati afiniteta prema Fc -fragment imunoglobulina, nespecifično adsorbira antimikrobna protutijela, koja zatim stupaju u interakciju s aktivnim centrima s odgovarajućim mikrobima izoliranima od pacijenata. Kao rezultat koaglutinacije nastaju pahuljice koje se sastoje od stafilokoka, dijagnostičkih serumskih antitijela i mikroba koji se određuje.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) temelji se na blokadi, supresiji antigena virusa antitijelima imunološkog seruma, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica (slika 13.3). RTHA se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, čiji uzročnici (gripa, ospice, rubeola, krpeljni encefalitis itd.) mogu aglutinirati eritrocite različitih životinja.

Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa koristi se za uspostavljanje ABO sustava (vidi odjeljak 10.1.4.1) pomoću aglutinacije eritrocita s protutijelima imunološkog seruma protiv antigena krvnih grupa A (II), B (III). Kontrole su: serum bez antitijela, tj. serum AB (GU) krvne grupe; antigeni sadržani u eritrocitima skupina A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, tj. koriste se eritrociti skupine 0 (I).

NA reakcije aglutinacije za određivanje Rh faktora(vidi odjeljak 10.1.4.1) koristite anti-Rh serume (barem dvije različite serije). U prisutnosti Rh antigena na membrani proučavanih eritrocita dolazi do aglutinacije ovih stanica. Kao kontrola služe standardni Rh pozitivni i Rh negativni eritrociti svih krvnih grupa.

Reakcija aglutinacije za određivanje anti-rezus antitijela ( neizravna reakcija Coombs)koristi se u bolesnika s intravaskularnom hemolizom. U nekih od ovih bolesnika nađu se anti-rezus antitijela, koja su nepotpuna, monovalentna. Oni specifično djeluju na Rh-pozitivne eritrocite, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Prisutnost takvih nepotpunih protutijela utvrđuje se neizravnom Coombsovom reakcijom. Da bi se to postiglo, sustavu anti-Rh protutijela + Rh-pozitivni eritrociti dodaje se antiglobulinski serum (antitijela protiv humanih imunoglobulina), što uzrokuje aglutinaciju eritrocita (slika 13.4). Pomoću Coombsove reakcije dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunološkog podrijetla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčadi: eritrociti Rh-pozitivnog fetusa kombiniraju se s nepotpunim antitijelima na Rh faktor koji cirkulira u krvi, koji su prešli posteljica od Rh-negativne majke.

Reakcije taloženja

reakcija taloženja - RP (odlat. praeci-pito- precipitat,) je stvaranje i taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku zamućenja tzv. talog. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama; višak jednog od njih smanjuje razinu formiranja imunološkog kompleksa.

Reakcije taloženja staviti u epruvete (reakcija taloženja prstena), u gelovima, hranjivim medijima itd. Različite reakcije taloženja u polutekućem gelu agara ili agaroze naširoko se koriste: dvostruka imunodifuzija po Ouchterlonyju. radijalna imunodifuzija, imunoelektroforeza i tako dalje.

Prstenasta reakcija taloženja . Reakcija se provodi u uskim epruvetama za taloženje s imunološkim serumom, na koji je naslojen topljivi antigen. Uz optimalan omjer antigena i protutijela, na granici ovih dviju otopina nastaje neproziran precipitatni prsten (slika 13.5). Višak antigena ne utječe na rezultat reakcije taloženja prstena zbog postupne difuzije reagensa do granice tekućine. Ako se kao antigeni u reakciji prstenaste precipitacije koriste prokuhani i filtrirani vodeni ekstrakti organa ili tkiva, tada se takva reakcija naziva reakcija termoprecipitacije-iii (Ascolijeva reakcija, s antraksom /

Oukhterunijeva reakcija dvostruke imunodifuzije . Za postavljanje reakcije otopljeni agar gel se izlije u tankom sloju na staklenu ploču, a nakon što se stvrdne u njemu se izrežu rupice veličine 2-3 mm. Antigeni i imunološki serumi stavljaju se odvojeno u te jažice, koje difundiraju jedna prema drugoj. Na mjestu susreta u jednakim omjerima stvaraju talog u obliku bijele trake. U višekomponentnim sustavima pojavljuje se nekoliko linija precipitata između jažica s različitim antigenima i serumskim protutijelima; za identične antigene, linije precipitata se spajaju; za neidentične se sijeku (sl. 13.6).

Reakcija radijalne imunodifuzije . Imuni serum s rastopljenim agar gelom ravnomjerno se izlije na staklo. Nakon skrućivanja u gelu prave se jažice u koje se stavlja antigen razna razrjeđenja. Antigen, difundirajući u gel, formira prstenaste precipitacijske zone oko jažica s protutijelima (slika 13.7). Promjer precipitacijskog prstena proporcionalan je koncentraciji antigena. Reakcija se koristi za određivanje razine imunoglobulina različitih klasa u krvi, komponenti sustava komplementa itd.

Imunoelektroforeza- kombinacija metode elektroforeze i imunoprecipitacije: smjesa antigena se unosi u jažice gela i elektroforezom razdvaja u gelu. Zatim se, paralelno sa zonama elektroforeze, u utor unosi imunološki serum, čija se antitijela, difuzijom u gel, formiraju na mjestu susreta s antigenom linije taloženja.

reakcija flokulacije(prema Ramonu) (od lat. flokus- wool flakes) - pojava opalescencije ili flokulentne mase (imunoprecipitacija) u epruveti tijekom reakcije toksin-antitoksin ili anatoksin-antitoksin. Koristi se za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida.

Imunološka elektronska mikroskopija- elektronska mikroskopija mikroba, češće virusa, tretiranih odgovarajućim antitijelima. Virusi tretirani imunološkim serumom stvaraju imunološke nakupine (mikroprecipitate). Oko viriona formira se "vijenac" protutijela, u kontrastu s fosfovolframovom kiselinom ili drugim elektronoptički gustim pripravcima.

Reakcije koje uključuju komplement

Reakcije koje uključuju komplementna temelju aktivacije komplementa kompleksom antigen-antitijelo (reakcija fiksacije komplementa, radijalna hemoliza itd.).

Reakcija fiksacije komplementa (RSK) leži u činjenici da, kada odgovaraju jedni drugima, antigeni i antitijela tvore imunološki kompleks, na koji, kroz Fc -fragment antitijela pridružuje se komplementu (C), tj. do vezivanja komplementa dolazi s kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, tada komplement ostaje slobodan (slika 13.8). RSK se provodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sustava koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži protutijela na njih. U 1. fazi reakcije, tijekom stvaranja kompleksa antigen-antitijelo, dolazi do vezanja komplementa, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih protutijelima; reakcija je pozitivna. Ako antigen i antitijelo ne odgovaraju jedno drugom (nema antigena ili antitijela u ispitivanom uzorku), komplement ostaje slobodan iu 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit-antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; reakcija je negativna.

RSK se koristi za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti, posebice sifilisa (Wassermanova reakcija).

Reakcija radijalne hemolize (RRH ) stavljen u jažice agar gela koji sadrži ovnove eritrocite i komplement. Nakon dodavanja hemolitičkog seruma (protutijela na eritrocite ovna) u jažice gela, oko njih se formira zona hemolize (kao rezultat radijalne difuzije antitijela). Tako je moguće odrediti aktivnost komplementa i hemolitičkog seruma, kao i antitijela u krvnom serumu bolesnika s gripom, rubeolom, krpeljnim encefalitisom. Da bi se to postiglo, odgovarajući antigeni virusa adsorbiraju se na eritrocite, a pacijentov krvni serum se dodaje u jažice gela koji sadrži te eritrocite. Antivirusna protutijela stupaju u interakciju s virusnim antigenima adsorbiranim na eritrocitima nakon

Komponente komplementa vežu se za ovaj kompleks, uzrokujući hemolizu.

Reakcija imunološke adhezije (RIP ) temelji se na aktivaciji sustava komplementa korpuskularnim antigenima (bakterije, virusi) tretiranim imunološkim serumom. Kao rezultat toga nastaje aktivirana treća komponenta komplementa (C3b) koja se veže za korpuskularni antigen kao dio imunološkog kompleksa. Na eritrocitima, trombocitima, makrofagima postoje receptori za C3b, zbog čega se te stanice, kada se pomiješaju s imunološkim kompleksima koji nose C3b, spajaju i aglutiniraju.

Reakcija neutralizacije

Antitijela u imunološkom serumu sposobna su neutralizirati štetni učinak mikroba ili njihovih toksina na osjetljive stanice i tkiva, što je povezano s blokadom mikrobnih antigena protutijelima, tj. neutralizacija. Reakcija neutralizacije(RN) provodi se unošenjem mješavine antigen-protutijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (kultura stanica, embriji). U nedostatku štetnog učinka mikroorganizama ili njihovih antigena, toksina u životinja i testnih objekata, govore o neutralizirajućem učinku imunološkog seruma i, prema tome, specifičnosti interakcije kompleksa antigen-antitijelo (slika 13.9).

Reakcija imunofluorescencije - RIF (Koonsova metoda)

Postoje tri glavne vrste metode: izravna, neizravna (slika 13.10), s komplementom. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za otkrivanje mikrobnih antigena ili otkrivanje protutijela.

Izravna RIF metoda temelji se na činjenici da tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunološkim serumima s antitijelima obilježenim fluorokromima mogu svijetliti u UV zrakama fluorescentnog mikroskopa.

Bakterije u razmazu, tretiranom takvim luminiscentnim serumom, svijetle duž periferije stanice u obliku zelene granice.

Indirektna RIF metoda je identificirati kompleks antigen-antitijelo korištenjem antiglobulinskog (antitijela) seruma obilježenog fluorokromom. Da biste to učinili, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima antimikrobnog dijagnostičkog seruma kunića. Zatim se isperu antitijela koja nisu vezana mikrobnim antigenima, a antitijela koja su ostala na mikrobima detektiraju se tretiranjem razmaza antiglobulinskim (antizečjim) serumom obilježenim fluorokromima. Kao rezultat toga nastaje kompleks mikrob + antimikrobna zečja protutijela + anti-zečja protutijela obilježena fluorokromom. Ovaj kompleks promatra se fluorescentnim mikroskopom, kao i kod izravne metode.

ELISA metoda, odnosno analiza (ELISA)

ELISA -otkrivanje antigena pomoću njihovih odgovarajućih antitijela konjugiranih s enzimom za označavanje (peroksidaza hrena, beta-galaktozidaza ili alkalna fosfataza). Nakon što se antigen pomiješa s enzimom obilježenim imunološkim serumima, u smjesu se dodaje supstrat/kromogen. Supstrat se cijepa enzimom, a boja produkta reakcije se mijenja - intenzitet boje je izravno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela.

Čvrsta faza ELISA - najčešća varijanta imunološkog testa, kada se jedna od komponenti imunološkog odgovora (antigen ili antitijela) adsorbira na čvrstom nosaču, na primjer, u jažicama polistirenskih ploča

Pri određivanju protutijela u jažice pločica s adsorbiranim antigenom redom se dodaju krvni serum bolesnika, enzimom obilježeni antiglobulinski serum i supstrat (kromogen) za enzim.

Svaki put nakon dodavanja sljedeće komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljitim pranjem. Uz pozitivan rezultat, boja otopine kromogena se mijenja. Nosilac čvrste faze može se senzibilizirati ne samo antigenom, već i antitijelima. Zatim se u jažice s adsorbiranim antitijelima unosi željeni antigen, dodaje se imunološki serum protiv antigena obilježenog enzimom, a zatim se dodaje supstrat za enzim.

Kompetitivni ELISA . ciljni antigen i enzimom obilježeni antigen međusobno se natječu za vezanje ograničene količine protutijela imunološkog seruma. Drugi test su antitijela koja tražite

a obilježena protutijela međusobno se natječu za antigene.

Radioimunološka metoda ili analiza (RIA)

Vrlo osjetljiva metoda koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo pomoću antigena ili antitijela obilježenih radionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se određuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje):

intenzitet zračenja izravno je proporcionalan broju vezanih molekula antigena i protutijela.

Na verzija RIA-e u čvrstoj fazi jedna od reakcijskih komponenti (antigen ili antitijela) adsorbira se na čvrsti nosač, na primjer, u jažicama polistirenskih mikronizova. Druga verzija metode je konkurentni RIA. ciljni antigen i radionuklidom obilježeni antigen međusobno se natječu za vezanje ograničene količine protutijela imunološkog seruma. Ova se opcija koristi za određivanje količine antigena u ispitivanom materijalu.

RIA se koristi za otkrivanje mikrobnih antigena, određivanje hormona, enzima, ljekovite tvari i imunoglobulini, kao i druge tvari sadržane u ispitivanom materijalu u manjim koncentracijama - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metoda predstavlja određenu opasnost za okoliš.

Imunobloting

Imunobloting (IB)- visoko osjetljiva metoda koja se temelji na kombinaciji elektroforeze i ELISA ili RIA.

Antigen se izolira elektroforezom u poliakrilamidnom gelu, zatim se prenosi (blotiranje - od engl. mrlja, spot) iz gela na aktivirani papir ili nitroceluloznu membranu i razvijen pomoću ELISA. Tvrtke proizvode takve trake s "mrljama"

antigeni. Na ove trakice nanosi se serum pacijenta. Zatim se nakon inkubacije bolesnik ispere od nevezanih protutijela bolesnika i aplicira serum protiv humanih imunoglobulina, obilježen enzimom. Kompleks antigen + antitijelo pacijenta + antitijelo protiv humanog Ig koji se formira na traci detektira se dodavanjem supstrata / kromogena koji mijenja boju pod djelovanjem enzima (slika 13.12).

IB se koristi kao dijagnostička metoda za HIV infekciju itd.

Reakcija aglutinacije Reakcija aglutinacije

(RA) - metoda za detekciju i kvantifikaciju Ag i Ab, koja se temelji na njihovoj sposobnosti stvaranja aglomerata vidljivih golim okom. U klinici za infekcije. bolesti ili u druge svrhe, koristi se za identifikaciju nepoznatih mikroba i stanica, za određivanje prisutnosti i količine protutijela u krvi i drugim tekućinama. Načelo determinacije temelji se na specifičnosti međudjelovanja između Ag i Am i sastoji se u pronalaženju poznatog od nepoznatog. Postoje mnoge varijante RA: kvantitativne i kvalitativne, in vitro i na staklu, volumetrijske i drip, konvencionalne, ubrzane i ekspresne metode. Za postavljanje RA potrebno vam je: 1) s-ka krvi. U varijanti s definicijom vrste (var) bakterija koriste se industrijski aglutinirajući s-ki, proizvedeni imunizacijom kunića. U varijanti s definicijom tipa Ab uzimaju uzorak krvi dobiven istraživanjem. ljudi ili životinje. S-ka treba biti sterilna i ne sadržavati suspendirane čestice. Pripremite glavno razrjeđenje u fiziološkoj otopini. Trebao bi biti 2-4 puta niži od dijagnostičkog titra za ovu bolest; 2) Ag . U varijanti reakcije s određivanjem vrste Ab koristi se proizvodna dijagnostika; u varijanti s određivanjem Ag, dijagnostikumi se sami pripremaju u obliku 1-3 milijardite suspenzije u slanoj otopini 18-20-satnog agara (rjeđe juhe) za istraživanje. mikrob inaktiviran zagrijavanjem u vodenoj kupelji na 70°C tijekom 1 sata ili 24-satnom inkubacijom na 37°C s formalinom (0,2% konačna koncentracija); 3) slani elektrolit. Tehnika postavljanja bulk serijska cijev RA za određivanje titra Ab u s-ke: iz glavnog razrjeđenja s-ki priprema se nekoliko redova radnih razrjeđenja. Broj redova ovisi o broju dijagnostikuma uzetih u pokusu, broj i faktori razrjeđenja određuju se dijagnostičkim titrom suspektne bolesti. Red mora sadržavati najmanje razrjeđenje koje odgovara dijagnostičkom titru Ab, dva razrjeđenja ispod i dva razrjeđenja iznad njega. npr. ako je dijagnostički titar 1:100, tada kod volumetrijske metode postavljanja RA treba pripremiti sljedeća razrjeđenja s-ki: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1 "400; s metodom kapanja, prvo razrjeđenje (1:25) nije potrebno, ali je potrebno drugo veće razrjeđenje - 1:800. znanstveno istraživanje sa-ku titrirati do negativne reakcije. Razrjeđuje se na sljedeći način: u sve pokusne epruvete, osim u 1., ulije se 0,25 ml fiziološke otopine kod postavljanja reakcije u volumenu od 0,5 ml i 0,5 ml kod postavljanja reakcije u volumenu od 1 ml. U 1. i 2. epruvetu uliti 0,25 (0,5) ml glavnog razrjeđenja s-ki, iz 2. epruvete u izrezani volumen i uzgoj sa i povećano za 2 puta, 0,25 (0,5) ml se prenosi u 3., iz 3. u 4. itd. do zadnjeg, od rezanja u sve se ulije 0,25 (0,5) ml da se uravnoteže volumeni. Svako razrjeđivanje s-ki provodi se zasebnom pipetom. Ako se u pokus uzme nekoliko dijagnostikuma, tada se za svaki od njih na isti način priprema serija razrjeđenja. Svakom razrjeđenju s-ki dodaje se Diagnosticum u volumenu jednakom volumenu s-ki, čime se razrjeđenje u svakoj epruveti povećava 2 puta. Iskustvo odgovara kontroli s-ki (0,25 -0,5 ml glavnog razrjeđenja s-ki i ista količina fiziološke otopine) i kontroli AG (0,25 - 0,5 ml dijagnostikuma i ista količina fiziološke otopine). Ako se u pokus uzme više dijagnostikuma, onda svaki od njih ima svoju kontrolu Ag. Stalak s epruvetama se dobro protrese i stavi u termostat na 37°C 4 sata, a zatim ostavi na sobnoj temperaturi do sljedeći dan, nakon čega se obračunava RA na temelju količine sedimenta i stupnja bistrenja tekućine. Određivanje ovih pokazatelja, ovisno o prirodi aglutinata, provodi se golim okom na tamnoj pozadini, u aglutinoskopu ili preko konkavne površine zrcala mikroskopa. Obračun počinje kontrolama: kontrola treba biti prozirna, Ag mora biti jednoliko zamućen (nakon protresanja epruvete). Ako su kontrole dobre, utvrđuje se prisutnost i stupanj aglutinacije u svim pokusnim epruvetama, što se označava plusevima: veliki talog i potpuno bistrenje tekućine - 4 plusa; veliki sediment i nepotpuno prosvjetljenje tekućine -3 plusa; primjetan sediment i primjetno prosvjetljenje tekućine - 2 plusa. Nakon toga se određuje titar: najveće razrjeđenje s intenzitetom aglutinacije od najmanje 2 plusa. Titar ispita s-ki se uspoređuje s dijagnostičkim titrom za ovu bolest. Ako titar studije s-ki je 2 puta niži od dijagnostičkog, reakcija se procjenjuje kao sumnjiva; ako je titar jednak dijagnostičkom - kao slabo pozitivan; ako je 2-4 puta veća od nje - kao pozitivna, ako je 8 ili više puta veća - kao oštro pozitivna. Uz široku raspodjelu Ab u zdravih ljudi, povećanje titra Ab koristi se za procjenu RA. Da bi se odredio tip Ag u serijskom RA, broj redaka mora odgovarati broju uzetom za identifikaciju dijagnostički s-to. Iz glavnog razrjeđenja dijagnostičke s-ki priprema se niz uzastopnih dvostrukih razrjeđenja na isti način kao u RA za određivanje titra At. Faktori razrjeđenja ovise o titru aglutinirajućeg s. U pokusu je prisutnost razrjeđenja jednakog titru s. razrjeđenja 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Isti volumen istraživanja Ag je dodano razrjeđenjima s-ki, kao rezultat toga, razrjeđenje s-to se povećava za 2 puta. uključeno je nekoliko s-to, tada svaki od njih treba svoju kontrolu. Po završetku reakcije, stativ se snažno protrese i stavi u termostat na 37 °C. Rezultati se uzimaju u obzir kako je gore opisano. Ag uzet u pokusu s-ke, titar reakcije mora odgovarati barem polovici titra standardnog dijagnostičkog testa Titri od 1 4 i niži smatraju se grupnom reakcijom kapati m d RA postavka se razlikuje od volumetrijske po tome što se s-ku razrjeđuje u volumenu od 1 ml, Ag se koristi u višoj koncentraciji (10 milijardi / ml) i dodaje se 1 - 2 kapi u epruveti Razrjeđenje s-ki nakon dodavanja Ag smatra se nepromijenjenim.Inače je način postavljanja, snimanja i ocjenjivanja sličan volumetrijskoj metodi.

(Izvor: Rječnik mikrobioloških pojmova)

Reakcija aglutinacije (od lat. aglutinacija- bonding) - vezivanje tjelešaca (bakterija, eritrocita i dr.) s protutijelima u prisutnosti elektrolita.

Reakcija aglutinacije manifestira se u obliku pahuljica ili sedimenta, koji se sastoje od tjelešaca (na primjer, bakterija), "zalijepljenih" protutijelima (Sl. 7.37). Reakcija aglutinacije služi za: određivanje uzročnika izoliranog od bolesnika; određivanje protutijela u krvnom serumu bolesnika; određivanje krvnih grupa.

Riža. 7.37 a, b. Reakcija aglutinacije saIgM-protutijela (a) iIgG-antitijela (b)

1. Određivanje uzročnika izoliranog iz bolesnika. Približna reakcija aglutinacije na staklu (Sl. 7.38). U kap aglutinirajućeg seruma dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od bolesnika (razrjeđenje 1:20). Nastaje ljuskasti talog.

Riža. 7.38.

Proširena reakcija aglutinacije s patogenom izoliranim iz pacijenta (Slika 7.39). Razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od bolesnika.

Riža. 52

2. Određivanje protutijela u krvnom serumu bolesnika
Proširena reakcija aglutinacije s bolesnikovim krvnim serumom (slika 7.39). Dijagnostikum se dodaje razrjeđenjima seruma bolesnika.
- Aglutinacija s O-diagnosticumom (bakterije ubijene zagrijavanjem, zadržavajući 0-antigen) javlja se u obliku sitnozrnate aglutinacije.
- Aglutinacija s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formalinom, zadržavajući flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.
3. Aglutinacijski test za određivanje krvnih grupa Reakcijom aglutinacije za određivanje krvnih grupa uspostavlja se ABO sustav (tablica b) aglutinacijom eritrocita s protutijelima imunološkog seruma protiv antigena krvnih grupa A (I), B (III). Kontrole su: serum koji ne sadrži antitijela, tj. serumske AB (IV) krvne grupe; antigeni sadržani u eritrocitima skupina A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, tj. koriste se eritrociti skupine O (I).

Tablica 7.6. Određivanje ABO krvnih grupa

1.1. REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Zbog svoje specifičnosti, jednostavnosti postavljanja i demonstrativnosti, reakcija aglutinacije postala je raširena u mikrobiološkoj praksi za dijagnostiku mnogih zaraznih bolesti.

Reakcija aglutinacije temelji se na specifičnosti međudjelovanja protutijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama (aglutinogeni). Kao rezultat te interakcije nastaju čestice – nakupine koje se talože (aglutiniraju) u obliku ljuskica.

U reakciji aglutinacije mogu sudjelovati i žive i mrtve bakterije, spirohete, gljivice, protozoe, rikecije, kao i eritrociti i druge stanice. Reakcija se odvija u dvije faze: prva (nevidljiva) specifična, veza antigena i antitijela, druga (vidljiva) nespecifična, vezivanje antigena, tj. stvaranje aglutinata.

Aglutinat nastaje kada jedan aktivno središte dvovalentno protutijelo s determinantnom skupinom antigena. Reakcija aglutinacije, kao i svaka serološka reakcija, odvija se u prisutnosti elektrolita.

Izvana, manifestacija pozitivne reakcije aglutinacije je dvojaka. Kod mikroba bez biča, koji imaju samo somatski O antigen, same mikrobne stanice se izravno lijepe zajedno. Takva se aglutinacija naziva sitnozrnatom. Održava se unutar 18 22 sata. v

Flagelirani mikrobi imaju dva antigena somatski O antigen i flagelarni H antigen. Ako se stanice slijepe bičevima, nastaju velike rahle ljuskice i takva reakcija aglutinacije naziva se grubo zrnata. Dolazi u roku od 2 4 sata.

Reakcija aglutinacije može se postaviti kako u svrhu kvalitativnog i kvantitativnog određivanja specifičnih protutijela u krvnom serumu bolesnika, tako i u svrhu određivanja vrste izoliranog uzročnika. v

Reakcija aglutinacije može se postaviti kako u detaljnoj verziji, koja omogućuje rad sa serumom razrijeđenim na dijagnostički titar, tako iu varijanti postavljanja indikativne reakcije, koja omogućuje, u načelu, otkrivanje specifičnih protutijela ili određivanje vrste uzročnik bolesti.

Pri postavljanju detaljne reakcije aglutinacije, radi otkrivanja specifičnih protutijela u krvnom serumu ispitanika, ispitni serum uzima se u razrjeđenju 1:50 ili 1:100. To je zbog činjenice da u cijelom ili malo razrijeđenom serumu normalna antitijela mogu biti prisutna u vrlo visokim koncentracijama, a tada rezultati reakcije mogu biti netočni. Materijal za ispitivanje u ovoj varijanti reakcije je krv pacijenta.

Krv se uzima na prazan želudac ili ne prije 6 sati nakon obroka (inače, u krvnom serumu mogu biti kapljice masti, što ga čini mutnim i neprikladnim za istraživanje). Krvni serum pacijenta obično se dobiva u drugom tjednu bolesti, prikupljanjem sterilne iz kubitalne vene 3 4 ml krvi (do ovog trenutka koncentrirana je maksimalna količina specifičnih antitijela). Kao poznati antigen koristi se dijagnostikum pripremljen od ubijenih ali neuništenih mikrobnih stanica određene vrste sa specifičnom antigenskom strukturom.

Kod postavljanja detaljne reakcije aglutinacije radi određivanja vrste, vrste uzročnika, antigen je živi uzročnik izoliran iz ispitivanog materijala. Poznata su antitijela sadržana u imunološkom dijagnostičkom serumu. v

Imunološki dijagnostički serum dobiva se iz krvi cijepljenog kunića. Nakon određivanja titra (maksimalnog razrjeđenja u kojem se otkrivaju protutijela), dijagnostički serum se ulijeva u ampule uz dodatak konzervansa. Ovaj serum koristi se za identifikaciju prema antigenskoj strukturi izoliranog uzročnika.

OPCIJE REAKCIJE AGLUTINACIJE

U tim reakcijama sudjeluju antigeni u obliku čestica (stanice mikroba, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni) koji se lijepe s protutijelima i talože.

Za postavljanje reakcije aglutinacije (RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen); 2) antitijelo (aglutinin) i 3) elektrolit (izotonična otopina natrijeva klorida).

POKAZNA (PLOČA) REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Aproksimativni ili lamelarni RA stavlja se na predmetno staklo na sobnoj temperaturi. Za to se na staklo Pasteur-ovom pipetom odvojeno nanese kap seruma u razrjeđenju 1:10 1:20 i kontrolna kap izotonične otopine natrijevog klorida. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unesu se u obje bakteriološke petlje i dobro promiješaju. Reakcije se uzimaju u obzir za nekoliko minuta vizualno, ponekad i povećalom (x5). S pozitivnim RA u kapi sa serumom, bilježi se pojava velikih i malih ljuskica, s negativnim, serum ostaje ravnomjerno mutan.

REAKCIJA NEIZRAVNE (PASIVNE) HEMAGLUTINACIJE (RNHA, RPHA)

Reakcija se postavlja: 1) za otkrivanje polisaharida, proteina, ekstrakata bakterija i drugih visoko dispergiranih tvari, rikecija i virusa, čiji se kompleksi s aglutininima ne mogu vidjeti u običnom RA, ili 2) za otkrivanje protutijela u serumima bolesnika na te visoko dispergirane tvari i najsitniji mikroorganizmi.

Pod neizravnom ili pasivnom aglutinacijom podrazumijeva se reakcija u kojoj protutijela stupaju u interakciju s antigenima prethodno adsorbiranim na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. ili eritrociti ovna, I (0) ljudske krvne grupe).

U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA) kao nosač se koriste eritrociti. Eritrociti opterećeni antigenom lijepe se zajedno u prisutnosti specifičnih protutijela na ovaj antigen i talože se. Antigenom senzibilizirani eritrociti koriste se u RPHA kao eritrocitni dijagnostikum za dokazivanje protutijela (serodijagnostika). Ako su eritrociti opterećeni protutijelima (erythrocyte antibody diagnosticum), tada se njime mogu detektirati antigeni.

Inscenacija. U jažicama polistirenskih tableta pripremite niz serijskih razrjeđenja seruma. U pretposljednju jažicu dodaje se 0,5 ml poznatog pozitivnog seruma, au posljednju jažicu 0,5 ml fiziološke otopine (kontrole). Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razrijeđenog eritrocitnog dijagnostikuma, protrese i stavi u termostat na 2 sata.

Računovodstvo. U pozitivnom slučaju eritrociti se talože na dnu rupice u obliku ravnomjernog sloja stanica s presavijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom slučaju talože se u obliku gumba ili prstena. .

1.2. REAKCIJA NEUTRALIZACIJE. LIZA,
OPSONOFAGOCITNA REAKCIJA, REAKCIJA PREOSJETLJIVOSTI

REAKCIJA NEUTRALIZACIJE EGZOTOKSINA S ANTITOKSINOM (RN)

Reakcija se temelji na sposobnosti antitoksičnog seruma da neutralizira djelovanje egzotoksina. Koristi se za titraciju antitoksičnih seruma i određivanje egzotoksina.

Kada se serum titrira, određena doza odgovarajućeg toksina dodaje se različitim razrjeđenjima antitoksičnog seruma. Uz potpunu neutralizaciju antigena i odsutnost neiskorištenih protutijela dolazi do početne flokulacije. Reakcija flokulacije može se koristiti ne samo za titraciju seruma (na primjer, difterije), već i za titraciju toksina i toksoida. Reakcija neutralizacije toksina antitoksinom ima veliki praktična vrijednost kao metoda za određivanje aktivnosti antitoksičnih terapijskih seruma. Antigen u ovoj reakciji je pravi egzotoksin.

Jačina antitoksičnog seruma određena je konvencionalnim jedinicama AE.

1 AU botulinum seruma njegova količina neutralizira 1000 DLM botulinum toksina. Reakcija neutralizacije za određivanje vrste ili vrste egzotoksina (u dijagnozi tetanusa, botulizma, difterije itd.) Može se provesti in vitro (prema Ramonu), a pri određivanju toksigenosti mikrobnih stanica - u gelu ( prema Ouchterlonyju).

reakcija lize (RL)

Jedno od zaštitnih svojstava imunološkog seruma je njegova sposobnost da otapa mikrobe ili stanične elemente koji ulaze u tijelo.

Specifična protutijela koja uzrokuju otapanje (lizu) stanica nazivaju se lizini. Ovisno o prirodi antigena, mogu biti bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini itd.

Lizini pokazuju svoj učinak samo u prisutnosti dodatnog faktora - komplementa. Komplement kao nespecifični faktor humoralni imunitet nalazi se u gotovo svim tjelesnim tekućinama osim cerebrospinalna tekućina i tekućina prednje komore. U ljudskom krvnom serumu primjećuje se prilično visok i konstantan sadržaj komplementa i to dosta u krvnom serumu. zamorac. Kod ostalih sisavaca sadržaj komplementa u krvnom serumu je drugačiji.

Komplement je složen sustav proteini sirutke. Nestabilan je i kolabira na 55 stupnjeva 30 minuta. Na sobnoj temperaturi, komplement se uništava unutar dva sata. Vrlo je osjetljiv na dugotrajno mućkanje, na djelovanje kiselina i ultraljubičastih zraka. Međutim, komplement se dugo čuva (do šest mjeseci) u osušenom stanju na niskoj temperaturi. Komplement potiče razgradnju mikrobnih stanica i eritrocita.

Razlikovati reakciju bakteriolize i hemolize.

Bit reakcije bakteriolize je da kada se specifični imunološki serum kombinira s njegovim odgovarajućim homolognim živim mikrobnim stanicama u prisutnosti komplementa, mikrobi se liziraju.

Reakcija hemolize sastoji se u činjenici da kada se eritrociti izlože specifičnom, imunom na njih serumu (hemolitiku) u prisutnosti komplementa, eritrociti se otapaju, tj. hemoliza.

Reakcija hemolize u laboratorijskoj praksi koristi se za određivanje tyr komplementa, kao i za uzimanje u obzir rezultata dijagnostičkih testova vezanja komplementa. Titar komplementa je najmanja količina koja uzrokuje lizu crvenih krvnih stanica unutar 30 minuta u hemolitičkom sustavu u volumenu od 2,5 ml. Reakcija lize, kao i sve serološke reakcije, događa se u prisutnosti elektrolita.

REAKCIJE PREOSJETLJIVOSTI (ALERGIJE).

Određeni oblici antigena mogu pri ponovljenom kontaktu s tijelom izazvati reakciju koja je u osnovi specifična, ali uključuje nespecifične stanične i molekularne čimbenike akutnog upalnog odgovora. Poznata su dva oblika hiperreaktivnosti: preosjetljivost neposredni tip(GHT) i preosjetljivost odgođenog tipa (DTH). Prva vrsta reakcije manifestira se uz sudjelovanje protutijela, dok se reakcija razvija najkasnije 2 sata nakon ponovljenog kontakta s alergenom. Drugi tip se provodi uz pomoć upalnih T stanica (Tr3) kao glavnih efektora reakcije, koje osiguravaju nakupljanje makrofaga u zoni upale, reakcija se manifestira nakon 6-8 sati i kasnije.

Razvoju reakcije preosjetljivosti prethodi susret s antigenom i pojava senzibilizacije, tj. pojava antitijela, aktivno senzibiliziranih limfocita i pasivno senzibiliziranih citofilnim antitijelima drugih leukocita (makrofagi, granulociti).

Reakcije preosjetljivosti imaju tri faze razvoja: imunološku; patokemijski; patofiziološki.

U prvoj, specifičnoj fazi, alergen stupa u interakciju s protutijelima i (ili) senzibiliziranim stanicama. U drugoj fazi dolazi do oslobađanja bioloških djelatne tvari iz aktiviranih stanica. Oslobođeni medijatori (histamin, serotonin, leukotrieni, bradikinin itd.) uzrokuju različite periferne učinke karakteristične za odgovarajući tip reakcije - treća faza.

Reakcije preosjetljivosti četvrtog tipa

Reakcije ovog tipa uzrokovane su patogenim međustaničnim interakcijama senzibiliziranih Thelpera, citotoksičnih Tlimfocita (Tkillera) i aktiviranih stanica mononuklearnog fagocitnog sustava uzrokovanih dugotrajnom stimulacijom imunološkog sustava bakterijskim antigenima, u kojima postoji relativna insuficijencija imunološkog sustava organizma. sustav eliminirati iz unutarnjeg okruženja bakterijski patogeni zarazne bolesti. Ove reakcije preosjetljivosti uzrokuju tuberkulozne plućne šupljine, njihovu kazeoznu nekrozu i opću intoksikaciju u tuberkuloznih bolesnika. Granulomatoza kože kod tuberkuloze i lepre u morfopatogenetskom smislu velikim je dijelom sastavljena od reakcija preosjetljivosti četvrtog tipa.

Najpoznatiji primjer reakcije preosjetljivosti tipa 4 je Mantouxova reakcija, koja se razvija na mjestu intradermalne primjene tuberkulina kod bolesnika čije su tijelo i sustav senzibilizirani na mikobakterijske antigene. Kao rezultat reakcije nastaje gusta hiperemična papula s nekrozom u središtu, koja se pojavljuje tek nekoliko sati kasnije (polako) nakon intradermalne primjene tuberkulina. Stvaranje papule počinje s izlaskom iz vaskularni krevet u međustanične prostore mononuklearnih fagocita cirkulirajuće krvi. Istodobno počinje emigracija polimorfonuklearnih stanica iz vaskularnog sloja. Zatim neutrofilna infiltracija jenjava, a infiltrat se počinje sastojati pretežno od limfocita i mononuklearnih fagocita. To je razlika između Mantouxove reakcije i Arthusove reakcije, u kojoj se pretežno polimorfonuklearni leukociti nakupljaju na mjestu lezije.

U reakcijama preosjetljivosti četvrtog tipa, produljena stimulacija senzibiliziranih limfocita antigenima dovodi do patološke promjene tkiva do patološki intenzivnog i produljenog oslobađanja citokina Thelpers. Intenzivno oslobađanje citokina u mjestima oštećenja tkiva uzrokuje hiperaktivaciju stanica sustava mononuklearnih fagocita koji se tamo nalaze, od kojih mnoge tvore niti epiteloidnih stanica u hiperaktiviranom stanju, a neke se međusobno spajaju u divovske stanice. Makrofagi, na čijoj su površini izloženi bakterijski i virusni antigeni, mogu se uništiti djelovanjem Tkillera (prirodnih ubojica).

Reakcija preosjetljivosti četvrtog tipa izazvana je prepoznavanjem stranog bakterijskog antigena od strane T-helpera senzibiliziranih prema njemu. Nužan uvjet za prepoznavanje je interakcija induktora s antigenima izloženim na površini stanica koje prezentiraju antigen nakon endocitoze i obrade stranih imunogena mononuklearnim fagocitima. Još nužan uvjet izloženost antigenima u kombinaciji s molekulama klase I iz glavnog kompleksa tkivne kompatibilnosti. Nakon prepoznavanja antigena, senzibilizirani pomagači otpuštaju citokine, a posebno interleukin2, koji aktivira prirodne ubojice i mononuklearne fagocite. Aktivirani mononuklearni fagociti otpuštaju proteolitičke enzime i slobodne kisikove radikale koji oštećuju tkiva.

Kožnoalergijski testovi testovi za utvrđivanje osjetljivosti tijela na alergene, određivanje njegove infekcije, na primjer, tuberkuloza, bruceloza, razina imunitet stada kao što je tularemija. Prema mjestu unošenja alergena razlikuju se: 1) kožni testovi; 2) scarification; 3) intradermalni; 4) potkožni. Klinička reakcija na alergen u kožno-alergijskom testu dijeli se na lokalnu, opću i žarišnu, trenutnu i odgođenu.

Lokalne reakcije medijatorskog tipa HIT-a javljaju se nakon 5-20 minuta, izražavaju se kao eritem i mjehurić, nestaju nakon nekoliko sati, procjenjuju se plus metodom količinom eritema, mjereno u mm. Lokalne reakcije HNL-a javljaju se nakon 24-48 sati, traju dugo, pojavljuju se kao infiltrat, ponekad s nekrozom u središtu, a procjenjuju se veličinom infiltrata u mm, također plus sustavom. Kod citotoksičnih i imunokompleksnih tipova GNT, hiperemija i infiltracija se uočavaju nakon 3-4 sata, postižu maksimum nakon 6-8 sati i nestaju nakon otprilike jednog dana. Ponekad se promatraju kombinirane reakcije.

1.3. REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (CFR)

Ova reakcija se koristi za laboratorijska istraživanja za otkrivanje antitijela u krvnom serumu kod raznih infekcija, kao i za identifikaciju uzročnika antigenskom strukturom.

Test vezanja komplementa složen je serološki test i karakterizira ga visoka osjetljivost i specifičnost.

Značajka ove reakcije je da se promjena antigena tijekom njegove interakcije sa specifičnim antitijelima događa samo u prisutnosti komplementa. Komplement se adsorbira samo na kompleksu antitijelo-antigen. Kompleks antitijelo-antigen nastaje samo ako postoji afinitet između antigena i antitijela prisutnog u serumu.

Adsorpcija komplementa na kompleksu "antigensko protutijelo" može utjecati na sudbinu antigena na različite načine, ovisno o njegovim karakteristikama.

Neki od antigena su pod tim uvjetima izloženi oštrom morfološke promjene, do otapanja (hemoliza, fenomen Isaeva Pfeifera, citolitički učinak). Drugi mijenjaju brzinu kretanja (imobilizacija treponema). Drugi pak umiru bez oštrice destruktivne promjene(baktericidno ili citotoksično djelovanje). Konačno, adsorpcija komplementa ne mora biti popraćena promjenama u antigenu koje su lako vidljive.

Prema mehanizmu, RSC se odvija u dvije faze:

1. Prva faza je stvaranje kompleksa "antigen protutijela" i adsorpcija na ovom kompleksu komplementa. Rezultat faze nije vizualno vidljiv (interakcija antigena i protutijela uz obvezno sudjelovanje komplementa).
2. Druga faza je promjena antigena pod utjecajem specifičnih protutijela u prisutnosti komplementa. Rezultat faze može biti vizualno vidljiv ili nevidljiv (detekcija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sustava (ovčji eritrociti i hemolitički serum).

Uništavanje eritrocita hemolitičkim serumom događa se samo u slučaju vezanja komplementa na hemolitički sustav. Ako je komplement ranije adsorbiran na kompleks antigen-antitijelo, tada ne dolazi do hemolize eritrocita.

Rezultat pokusa procjenjuje se bilježenjem prisutnosti ili odsutnosti hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom s potpunim odgodom hemolize, kada je tekućina u epruveti bezbojna, a eritrociti se talože na dno, negativnom s potpunom lizom eritrocita, kada je tekućina intenzivno obojena ("lak" krv). Stupanj kašnjenja hemolize procjenjuje se ovisno o intenzitetu boje tekućine i količini sedimenta eritrocita na dnu (++++, +++, ++, +).

U slučaju kada promjene u antigenu ostaju nedostupne za vizualno promatranje, potrebno je koristiti drugi sustav koji djeluje kao indikator koji vam omogućuje da procijenite stanje komplementa i donesete zaključak o rezultatu reakcije.

Ovaj indikatorski sustav predstavljaju komponente reakcije hemolize, koja uključuje ovčje eritrocite i hemolitički serum koji sadrži specifična protutijela na eritrocite (hemolizine), ali ne sadrži komplement. Ovaj sustav indikatora dodaje se u epruvete jedan sat nakon postavljanja glavnog CSC-a. Ako je reakcija fiksacije komplementa pozitivna, tada nastaje kompleks antitijelo-antigen koji adsorbira komplement na sebe. Budući da se komplement koristi u količini potrebnoj za samo jednu reakciju, a liza eritrocita može se dogoditi samo u prisutnosti komplementa, tada kada se on adsorbira na kompleksu "antigen protutijela", neće doći do lize eritrocita u hemolitičkom (indikatorskom) sustavu. . Ako je reakcija fiksacije komplementa negativna, kompleks “antigen protutijelo” ne nastaje, komplement ostaje slobodan, a pri dodavanju hemolitičkog sustava dolazi do lize eritrocita.

1.4. DNAPROBE. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR),
ENZIMSKA IMUNOLOŠKA METODA (ELISA), FLUORESCENTNA ANTITIJELA METODA (MFA)

METODE ISPITIVANJA GENA

Temelj je bio intenzivan razvoj molekularne biologije i stvaranje savršene metodološke osnove za genetička istraživanja genetski inženjering. U području dijagnostike nastao je i ubrzano se razvija smjer određivanja specifičnih nukleotidnih sekvenci DNA i RNA, tzv. gensko ispitivanje. Takve se metode temelje na sposobnosti nukleinskih kiselina da hibridiziraju i tvore dvolančane strukture zbog interakcije komplementarnih nukleotida (AT, GC).

Za određivanje željenog slijeda DNA (ili RNA) posebno se izrađuje tzv. polinukleotidna sonda sa specifičnim baznim slijedom. U njegov sastav uvodi se posebna oznaka koja omogućuje prepoznavanje formiranja kompleksa.

Iako se ispitivanje gena ne može pripisati metodama imunokemijske analize, njegovo glavno načelo (interakcija komplementarnih struktura) metodički se provodi na isti način kao i indikatorske metode imunodijagnostike. Osim toga, metode ispitivanja gena omogućuju popunjavanje podataka o uzročniku infekcije u nedostatku njegove fenotipske ekspresije (virusi ugrađeni u genom, "tihi" geni).

Za analizu DNA, uzorak se podvrgava denaturaciji kako bi se dobile jednolančane strukture s kojima reagiraju molekule DNA ili RNAprobe. Sonde se pripremaju pomoću bilo kojeg razne sekcije DNA (ili RNA) izolirana iz prirodnog izvora (na primjer, jedan ili drugi mikroorganizam), obično predstavljena kao genetske sekvence kao dio vektorskih plazmida ili kemijski sintetiziranih oligonukleotida. U nekim se slučajevima kao sonda koriste pripravci genomske DNA hidrolizirane u fragmente, ponekad pripravci RNA, osobito često ribosomske RNA. Kao oznaka koriste se isti pokazatelji kao u različite vrste imunokemijska analiza: radioaktivni izotopi, fluoresceini, biotop (s daljnjom manifestacijom avidinenzimskim kompleksom) itd.

Redoslijed analize određen je svojstvima dostupne sonde

Trenutno se sve više koriste komercijalni setovi koji sadrže sve potrebne sastojke.

U većini slučajeva postupak analize može se podijeliti u sljedeće faze: priprema uzorka (uključujući ekstrakciju DNA i denaturaciju), fiksacija uzorka na nosač (najčešće polimerni membranski filter), prehibridizacija, sama hibridizacija, pranje nevezanih proizvoda, otkrivanje. Bez standardni lijek DNA ili RNA sonda se preliminarno dobiva i označava.

Za pripremu uzorka može biti potrebno "uzgojiti" ispitni materijal kako bi se identificirale pojedinačne bakterijske kolonije ili povećala koncentracija virusa u kultura stanica. Izravna analiza uzoraka krvnog seruma, urina, oblikovani elementi krvi ili Sva krv za prisutnost infektivnog agensa. Za oslobađanje nukleinskih kiselina iz sastava staničnih struktura, stanice se liziraju, au nekim slučajevima DNA preparat se pročišćava fenolom.

Denaturacija DNA, tj. njezin prijelaz u jednolančani oblik, događa se tijekom obrade alkalijama. Uzorak nukleinske kiseline zatim se fiksira na nosaču od nitroceluloze ili najlonske membrane, obično inkubacijom od 10 minuta do 4 sata na 80°C pod vakuumom. Nadalje, u procesu predhibridizacije postiže se inaktivacija slobodnih veznih mjesta kako bi se smanjila nespecifična interakcija sonde s membranom. Proces hibridizacije traje od 2 do 20 sati, ovisno o koncentraciji DNA u uzorku, koncentraciji korištene sonde i njezinoj veličini.

Nakon što je hibridizacija završena i nevezani produkti isprani, nastali kompleks se otkriva. Ako sonda sadrži radioaktivnu oznaku, tada se membrana izlaže fotografskom filmu kako bi se očitovala reakcija (autoradiografija). Za ostale oznake koristite odgovarajuće postupke.

Najviše obećava proizvodnja neradioaktivnih (tzv. hladnih) sondi. Na istoj osnovi razvija se tehnika hibridizacije koja omogućuje utvrđivanje prisutnosti patogena u preparatima rezova, punkcijama tkiva, što je posebno važno u patomorfološkoj analizi (hibridizacija in situ).

Bitan korak u razvoju metoda ispitivanja gena bila je uporaba reakcije pojačanja polimerazom (PCR). Ovaj pristup omogućuje povećanje koncentracije specifične (prethodno poznate) sekvence DNA u uzorku sintetiziranjem višestrukih kopija in vitro. Za izvođenje reakcije dodaje se pripravak enzima DNA polimeraze, višak deoksinukleotida za sintezu i takozvani primeri, dvije vrste oligonukleotida od 20-25 baza koji odgovaraju terminalnim dijelovima sekvence DNA od interesa, dodaju se u Uzorak DNK koji se proučava. Jedan od početnica mora biti kopija početka područja čitanja kodirajućeg lanca DNK u smjeru čitanja 53, a drugi mora biti kopija suprotnog kraja nekodirajućeg lanca. Zatim se sa svakim ciklusom reakcije polimeraze broj kopija DNK udvostručuje.

Za vezanje početnica potrebna je denaturacija (taljenje) DNA na 94°C, nakon čega slijedi dovođenje smjese na 4055°C.

Za izvođenje reakcije dizajnirani su programabilni inkubatori za mikrouzorke koji lako mijenjaju temperaturne promjene koje su optimalne za svaki stupanj reakcije.

Reakcija amplifikacije može značajno povećati osjetljivost analize tijekom sondiranja gena, što je posebno važno pri niskim koncentracijama uzročnika infekcije.

Jedna od značajnih prednosti sondiranja gena s amplificiranjem je mogućnost proučavanja submikroskopske količine patološkog materijala.

Druga značajka metode, važnija za analizu infektivnog materijala, jest mogućnost detekcije skrivenih (tihih) gena. Metode vezane uz primjenu genskog sondiranja sigurno će se sve više uvoditi u praksu dijagnosticiranja zaraznih bolesti kako budu postajale jednostavnije i jeftinije.

ELISA i RIF metode su uglavnom kvalitativne ili polukvantitativne. Na vrlo niske koncentracije komponente, formiranje kompleksa antigen-protutijelo ne može se registrirati ni vizualno ni jednostavnim instrumentima. Indikacija kompleksa antigena protutijela u takvim slučajevima može se provesti ako jedna od početnih komponenti antigena ili protutijela uvodi oznaku koja se može lako otkriti u koncentracijama usporedivim s koncentracijom analita koji se određuje.

Radioaktivni izotopi (na primjer, 125I), fluorescentne tvari i enzimi mogu se koristiti kao oznaka.

Ovisno o korištenoj oznaci, postoje radioimune (RIA), fluorescentne imune (FIA), enzimske imunotestove (ELISA) metode analize itd. posljednjih godinaširok praktičnu upotrebu primili ELISA test, što je povezano s mogućnošću kvantitativna određivanja, visoka osjetljivost, specifičnost i automatizacija računovodstva.

ELISA metode analize skupina metoda koje omogućuju otkrivanje kompleksa antigena protutijela pomoću supstrata koji je cijepan enzimom uz pojavu boje.

Bit metode leži u kombinaciji komponenti reakcije antigena protutijela s izmjerenom enzimskom oznakom. Antigen ili protutijelo koje reagira obilježeno je enzimom. Po transformaciji supstrata pod djelovanjem enzima može se suditi o količini komponente reakcije antigen-antitijelo koja je ušla u interakciju. Enzim u ovom slučaju služi kao marker imunološkog odgovora i omogućuje vam da ga promatrate vizualno ili instrumentalno.

Enzimi su vrlo prikladne oznake jer im njihova katalitička svojstva omogućuju da djeluju kao pojačivači, budući da jedna molekula enzima može proizvesti više od 1 x 105 molekula katalitičkog proizvoda u minuti. Potrebno je odabrati enzim koji dugo zadržava svoju katalitičku aktivnost, ne gubi je vezanjem na antigen ili protutijelo i ima visoku specifičnost u odnosu na supstrat.

Glavne metode dobivanja antitijela ili antigena obilježenih enzimom, konjugatima: kemijski, imunološki i genetski inženjering. Za ELISA se najčešće koriste enzimi: peroksidaza hrena, alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.

Za otkrivanje aktivnosti enzima u kompleksu antigen-antitijelo u svrhu vizualnog i instrumentalnog praćenja reakcije koriste se kromogeni supstrati čije otopine, u početku bezbojne, u procesu enzimska reakcija dobivaju boju čiji je intenzitet proporcionalan količini enzima. Tako se za otkrivanje aktivnosti peroksidaze hrena u čvrstoj fazi ELISA kao supstrat koristi 5-aminosalicilna kiselina koja daje intenzivnu smeđu boju, ortofenilendiamin koji stvara narančastožutu boju. Za otkrivanje aktivnosti alkalne fosfataze i α-galatozidaze koriste se nitrofenilfosfati odnosno nitrofenilgalaktozidi.

Rezultat reakcije u nastanku obojenog produkta određuje se vizualno ili pomoću spektrofotometra koji mjeri apsorpciju svjetlosti određene valne duljine.

Postoje mnoge mogućnosti za postavljanje ELISA testa. Postoje homogene i heterogene varijante.

Prema načinu postavljanja razlikuju se kompetitivne i nekompetitivne ELISA metode. Ako su u prvoj fazi u sustavu prisutni samo analizirani spoj i njegovi odgovarajući centri za vezanje (antigen i specifična protutijela), tada je metoda nekompetitivna. Ako su analizirani spoj (antigen) i njegov analog (enzimom obilježeni antigen) prisutni u prvoj fazi, natječući se međusobno za vezanje na specifične vezne centre (antitijela) prisutna u nedostatku, tada je metoda kompetitivna. U ovom slučaju, što više ispitivani antigen sadrži otopinu, to manja količina vezanje označenih antigena.

METODA FLUORESCENTNIH ANTITIJELA (MFA) ili IMUNOFLUORESCENTNE REAKCIJE (RIF)

Imunofluorescentna metoda je metoda izbora za brzu detekciju i identifikaciju nepoznatog mikroorganizma u ispitivanom materijalu.

Ag + AT + elektrolit = UV svjetleći kompleks

Mikrobni serum obilježen fluorokromom

Boja fluorescein izotiocijanat se često koristi FITC

U ovoj studiji koristi se fluorescentni mikroskop.

RIF inscenacija

Na bris se nanese 30 µl otopine antitijela obilježenih FITC-om.

Stavite čašu u vlažnu komoru i inkubirajte na sobnoj temperaturi 20-25 minuta ili u termostatu na 37°C 15 minuta.

Isperite staklo u tekućoj vodi iz slavine 2 minute, isperite destiliranom vodom i osušite na zraku.

Kap tekućine za postavljanje nanese se na osušeni razmaz, razmaz se pokrije pokrovnim stakalcem i mikroskopira pomoću fluorescentnog mikroskopa ili fluorescentnog nastavka na konvencionalni optički mikroskop.

u mikrobiologiji

"Reakcija aglutinacije i njezine vrste (RA)"

Plan:

1. Uvod………………………………………………………………………………………..3

2. RA na staklu……………………………………………………………………………………….4

3. PA iz epruvete………………………………………………………………………………….5

4. Korištena literatura………………………………………………………………………..7

1. Uvod.

Interakcija mikrobnog antigena i antitijela je strogo specifična i usmjerena je u životinjskom tijelu na neutralizaciju patogena i njegovih toksina. Interakcija antigena i protutijela in vitro pod određenim uvjetima popraćena je vidljivim fenomenima (aglutinacija, precipitacija, imunološka liza), što omogućuje korištenje AG-AT reakcija, nazvanih seroloških (od latinskog serum-serum), u praktične svrhe. Biotvornice proizvode antigene i imunološke serume (protutijela) poznatog specifičnog smjera (dijagnostički). Uz pomoć takvih seruma u serološkim reakcijama moguće je identificirati nepoznati mikroorganizam ili pomoću poznatog antigena detektirati antitijela u organizmu koja se sintetiziraju kao odgovor na unošenje uzročnika i na taj način postaviti dijagnozu (serološka dijagnoza) . Osim toga, serološkim reakcijama može se procijeniti intenzitet imunološkog odgovora nakon cijepljenja ili zarazne bolesti.

Reakcije aglutinacije, kao što su neizravna aglutinacija i Coombs, temelje se na in vitro interakciji korpuskularnih antigena s protutijelima i sposobnosti nastalih kompleksa da se talože. Kao korpuskularni antigeni koriste se bakterijske stanice ili topljivi antigeni ekstrahirani iz mikroorganizama i adsorbirani na tjelešcima nositelja: eritrocita, čestica lateksa itd.

Antigene determinante korpuskularnih antigena specifično komuniciraju s homolognim protutijelima (specifična, nevidljiva faza reakcije), a zatim kompleksi antigen-antitijelo stvaraju velike, golim okom vidljive konglomerate koji se talože - aglutiniraju (nespecifična, vidljiva faza reakcije) . U neflageliranim oblicima mikroba (Brucella) stvaraju se zrnasti aglutinanti, u bičevima (Escherichia, Salmonella) - veliki pamuk, koji se taloži na dno epruvete u obliku obrnutog kišobrana i lako se lomi pri mućkanju. . Antigeni i protutijela međusobno djeluju samo u prisutnosti elektrolita (u 0,8% otopini natrijeva klorida). Na tijek reakcije utječu koncentracija soli u elektrolitu, broj mikrobnih stanica u suspenziji, koncentracija u serumu, pH, temperatura i drugi čimbenici.

Reakcija aglutinacije (ra).

Razlikovati specifičnu aglutinaciju, roj se temelji na interakciji antigena S homologno antitijelo , sadržan u tijelu životinje, Krom je uveden ovaj antigen (imunoaglutinacija); nespecifični (kemijski), koji proizlaze iz promjena u pH okoliša, koncentracije elektrolita; spontani, to-ruyu opaža se kada se bakterije (koje su u R-formi) suspendiraju u slanoj otopini i kada se zagrijavaju, što je povezano s promjenom koloidnog stanja bakterijske stanice. Antigen , koji je uključen u RA naziva se aglutinogen, protutijelo se naziva aglutinin, nastali talog naziva se aglutinat. U stvaranju aglutinata bitan je kvantitativni omjer antigena i antitijela (optimalni fenomen). S viškom ili nedostatkom antitijela, A.

Reakcija aglutinacije (RA) jedna je od prvih imunoloških reakcija koja se koristi u mikrobiološkoj praksi. Prvi put (1895.) F. Vidal koristi RA za dijagnozu trbušnog tifusa. Kasnije (1897.) A. Wright upotrijebio je istu reakciju za dijagnosticiranje bruceloze kod ljudi. RA je također našao primjenu u dijagnostici puloroze kokoši, leptospiroze, infektivnog pobačaja kobila, kao i za tipizaciju nepoznatih kultura mikroba prema poznatom aglutinirajućem serumu. RA je vrlo osjetljiv; može otkriti 0,01 µg dušika proteina protutijela u 1 ml.

Razvijeno je nekoliko varijanti reakcije aglutinacije, koje se razlikuju u metodološkoj provedbi i svrsi istraživanja.

2. Ra na staklu.

U ovoj varijanti RA mogu se testirati i serum i antigen, ali se ova varijanta najčešće koristi za identifikaciju mikroorganizama.

1. Za identifikaciju mikroorganizma (m/o), kap poznatog aglutinirajućeg seruma, kao što je salmonelioza, i kap fiziološke otopine (kontrola) nanose se odvojeno na odmašćeno staklo. Zatim se bakteriološkom petljom uzima bakterijska masa proučavane kulture iz kolonije u Petrijevoj zdjelici ili s površine nagnute MPA u epruveti i odvojeno suspendira u imunološkom serumu i fiziološkoj otopini dok se ne dobije homogena suspenzija. . Rezultat se uzima u obzir nakon 2 ... 4 minute.

Obračunavanje rezultata: ne bi trebalo biti promjena u kontrolnom uzorku. Uz specifičnu podudarnost bakterijske kulture s imunološkim serumom, pojavljuju se ljuskice aglutinata (pozitivan rezultat), u nedostatku fenomena aglutinacije, zaključuje se da proučavana bakterijska kultura ne odgovara imunološkom serumu.

2. Otkrivanje protutijela u ispitivanom krvnom serumu razmotrit ćemo na primjeru rose-bengal testa koji se koristi u serodijagnostici bruceloze. 0,3 ml ispitivanog krvnog seruma životinja i 0,03 ml antigena brucele (stanice brucele obojene ružičastom bengalkom) nanese se na predmetno staklo. Komponente se temeljito miješaju mućkanjem čaše i rezultat se uzima u obzir nakon 4 minute.

Računovodstveni rezultati: s pozitivnom reakcijom pojavljuju se ružičaste pahuljice aglutinata. Serološka reakcija ove vrste klasificira se kao kvalitativna, jer se pomoću nje mogu otkriti antitijela na patogen u krvnom serumu životinje, ali je nemoguće procijeniti njihov kvantitativni sadržaj.