Lančana reakcija polimerazom, njezina suština i područja primjene. PCR: što je to? Dijagnostika zaraznih bolesti pomoću lančane reakcije polimerazom Lančana reakcija polimerazom PCR

Provođenje PCR analize (PCR dijagnostika) započinje prikupljanjem materijala za pregled kod ginekologa, urologa ili dermatovenerologa. Kvalitetu i pouzdanost naknadno dobivenih rezultata osiguravaju najviša kvalifikacija i veliko iskustvo liječnika medicinskog centra Euromedprestige, koji poštuju sva potrebna pravila za provođenje PCR analize: potpuna sterilnost, korištenje samo jednokratnih materijala.

Sakupljeni materijal s kista stavlja se u posudu s fiziološkom otopinom. Nakon prikupljanja uzorke je potrebno što prije dostaviti u PCR laboratorij.

PCR analiza se provodi u laboratoriju u tri faze:

  1. ekstrakcija DNK
  2. Amplifikacija fragmenata DNA
  3. Detekcija produkata amplifikacije DNA

Ekstrakcija DNK početna je faza PCR dijagnostike, čija je bit sljedeća: liječnik uzima materijal za istraživanje od pacijenta i podvrgava ga posebnoj obradi. Tijekom obrade, dvostruka spirala DNK se dijeli na pojedinačne niti. U materijal pacijenta dodaje se posebna tekućina koja otapa organske tvari koje ometaju "čistoću" reakcije. Time se uklanjaju lipidi, aminokiseline, peptidi, ugljikohidrati, proteini i polisaharidi. Kao rezultat toga nastaje DNA ili RNA.

Princip PCR metode je “konstrukcija” novih DNA ili RNA infekcija. To se ne može učiniti bez uklanjanja staničnog materijala.

Količina vremena utrošena na ekstrakciju DNA ovisi o uzročniku infekcije i vrsti materijala koji se koristi za PCR istraživanje. Na primjer, potrebno je 1,5-2 sata da se krv pripremi za sljedeću fazu.

0 Niz ( => Analize) Niz ( => 2) Niz ( =>.html) 2

amplifikacija DNA

Za provođenje sljedeće faze DNK dijagnostike - DNK amplifikacije - liječnici koriste takozvane DNK matrice - DNK molekule infekcija, na koje će se naknadno dogoditi "kloniranje" DNK. Već je spomenuto da nije potrebna prisutnost kompletne DNA infekcije, već je dovoljan mali dio molekule DNA koji je karakterističan samo za određeni mikrob (infekciju).

Osnova amplifikacije DNA i, sukladno tome, temelj cjelokupnog principa PCR reakcije je prirodni proces kompletiranja DNK za sva živa bića - replikacija DNK, koja se provodi udvostručenjem jednog lanca DNK.

Počevši od jednog fragmenta DNK, laboratorijski liječnik ga kopira i povećava broj kopija u načinu lančane reakcije: nakon prvog ciklusa već imate 2 fragmenta, nakon drugog ciklusa - 4, nakon trećeg - 8, nakon četvrti - 16, zatim 32, 64, 128, 256... Sa svakim ciklusom broj kopija se udvostručuje, a nakon dvadeset ciklusa brojka već ide u milijune, a nakon trideset - u milijarde. Ciklus traje nekoliko minuta i svodi se na određenu promjenu temperature u vrlo malom kemijskom reaktoru. Ovdje su u otopini sve potrebne komponente sinteze prisutne u dovoljnim količinama, prije svega nukleotidi A, G, T i C, a također se provode delikatne pripremne kemijske operacije tako da se odmah uzima točna kopija iz svakog gotov segment DNK, zatim iz ove kopije - opet kopija, ovo je razgranata lančana reakcija.

Pričvršćivanjem početnica na lanac DNA - umjetno sintetiziranih "komada" DNA (parova nukleotida) sličnih DNA mikroba (infekcija) - formiraju se dvije kratke spirale koje se sastoje od dva lanca DNA dijelova, koji su potrebni za sintezu budućih DNK.

Sinteza novog lanca događa se kompletiranjem svakog od dva lanca DNA. Proces amplifikacije odvija se uz pomoć specifične regije - DNA polimeraze, koja daje naziv laboratorijskoj metodi. Polimeraza djeluje kao katalizator za reakciju i prati sekvencijalno pričvršćivanje nukleotidnih baza na rastući novi lanac DNA.

Dakle, amplifikacija DNA je višestruko povećanje broja kopija DNA koje su specifične, tj. svojstvene samo određenom organizmu. Nema potrebe dovršavati cijeli lanac DNK da bi se vidio uzročnik infekcije. Potrebno je samo područje koje je karakteristično za datu bakteriju kao jedinku.

5360 rub. Cijena sveobuhvatnog programa s gastroenterologom

POPUST 25% NA DOGOVORU KOD KARDIOLOGA

- 25%primarni
Posjet liječniku
terapeut vikendom

5160 RUB umjesto 5.420 rub. Probir muškaraca na urološke infekcije

ALERGOLOGIJA 5120 RUB umjesto 5.590 rub.

Svi visoko ponavljajući koraci pojačanja odvijaju se na različitim temperaturama. Za provođenje PCR analize koristi se posebno programabilna oprema - PCR - termostat ili pojačivač, koji automatski mijenja temperature. Amplifikacija se provodi prema zadanom programu koji odgovara vrsti infekcije koja se otkriva. Ovisno o programu i vrsti infekcije koja se otkriva, automatizirani PCR proces traje od 2 do 3 sata.

Kvalifikacije laboratorijskog liječnika koji provodi analizu igraju važnu ulogu u PCR dijagnostici, o njemu ovise pravilne postavke PCR opreme i interpretacija rezultata. Liječnici medicinskog centra Euromedprestige imaju odlično iskustvo u provođenju DNA dijagnostike, što osigurava pouzdanost rezultata istraživanja i jamči pozitivan uspjeh u liječenju zarazne bolesti. U našem medicinskom centru Euromedprestige napraviti PCR testove i provesti kompletnu dijagnostiku i liječenje zaraznih bolesti.

Tijekom detekcije produkata amplifikacije odvaja se nastala smjesa produkata amplifikacije. Smjesi se dodaju posebne otopine koje fragmentima DNA daju mogućnost fluoresciranja – reflektiranog u narančasto-crvenim svjetlećim prugama. Dobiveni sjaj ukazuje na prisutnost DNA virusa, mikroba ili bakterija u materijalu uzetom od pacijenta za PCR analizu.

Nedavno je pouzdan, vrlo osjetljiv i brza metoda dijagnoza raznih ljudskih zaraznih bolesti. Ova metoda se naziva "PCR analiza". Što je to, koja je njegova suština, koje mikroorganizme može identificirati i kako ga pravilno uzeti, reći ćemo vam u našem članku.

Povijest otkrića


PCR metode također se koriste u dijagnostici raka.

Prednosti metode

PCR dijagnostika ima niz prednosti:

  1. Visoka osjetljivost. Čak i ako je prisutno samo nekoliko molekula DNA mikroorganizma, PCR analiza utvrđuje prisutnost infekcije. Metoda će pomoći kod kroničnih i latentnih bolesti. Često se u takvim slučajevima mikroorganizam inače ne može kultivirati.
  2. Bilo koji materijal je prikladan za istraživanje, na primjer slina, krv, genitalni sekret, kosa, epitelne stanice. Najčešći je PCR test krvi i urogenitalni bris.

  3. Nije potrebno dugotrajno uzgajanje usjeva. Automatizirani dijagnostički proces omogućuje dobivanje rezultata istraživanja nakon 4-5 sati.
  4. Metoda je gotovo stopostotno pouzdana. Zabilježeni su samo izolirani slučajevi lažno negativnih rezultata.
  5. Sposobnost identificiranja nekoliko vrsta patogena iz jednog uzorka materijala. To ne samo da ubrzava proces dijagnosticiranja bolesti, već i značajno smanjuje materijalne troškove. Često liječnik propisuje složeni PCR test. Trošak pregleda koji se sastoji od identifikacije šest patogena je oko 1500 rubalja.

    6. Kako bi rezultati bili pouzdani prilikom provođenja PCR studije, morate uzeti test, slijedeći preporuke za preliminarnu pripremu za dijagnozu:

    1. Prije doniranja sline, trebate se suzdržati od jela i uzimanja lijekova 4 sata prije prikupljanja materijala. Neposredno prije postupka isperite usta prokuhanom vodom.
    2. Gornja pravila treba se pridržavati i prilikom uzimanja uzorka s unutarnje površine obraza. Nakon ispiranja preporučuje se lagana masaža kože kako bi se oslobodio sekret žlijezde.
    3. Urin se obično prikuplja kod kuće. Da biste to učinili, morate temeljito očistiti genitalije. U sterilnu plastičnu posudu treba sakupiti 50-60 ml urina. Kako bi se osigurala čistoća materijala, ženama se preporuča staviti tampon u rodnicu, a muškarcima kožni nabor povući što je više moguće. Materijal ne možete donirati tijekom menstruacije.
    4. Da biste donirali spermu, morate se suzdržati od spolnog odnosa 3 dana prije prikupljanja materijala. Liječnici također savjetuju odlazak u saunu i uzimanje topla kupka, pijenje alkohola i začinjene hrane. Trebali biste se suzdržati od mokrenja 3 sata prije testa.
    5. Na primjer, ako se provodi PCR test na klamidiju, i ženama i muškarcima preporučuje se seksualni odmor 3 dana. Nemojte uzimati 2 tjedna prije testa antibakterijski lijekovi. Tjedan dana morate prestati koristiti intimne gelove, masti, vaginalne čepiće i ispiranje. 3 sata prije testa trebate se suzdržati od mokrenja. Za vrijeme menstruacije materijal se ne uzima, samo 3 dana nakon prestanka krvarenja može se uzeti urogenitalni bris.

    PCR tijekom trudnoće

    Dok čekate bebu, mnoge spolno prenosive zarazne bolesti izuzetno su opasne za normalan razvoj fetusa. Spolno prenosive bolesti mogu uzrokovati intrauterino ograničenje rasta, pobačaj ili prijevremeni porod, urođene mane djeteta. Stoga je iznimno važno podvrgnuti se PCR testiranju u ranoj fazi trudnoće. Test se mora polagati prilikom prijave - do 12 tjedana.

    Materijal se prikuplja iz cervikalnog kanala posebnom četkom. Postupak je bezbolan i ne predstavlja opasnost za bebu. Obično se tijekom trudnoće provodi analiza na klamidiju metodom PCR, kao i na ureaplazmozu, mikoplazmozu, citomegalovirus, herpes i papiloma virus. Ovaj set pretraga naziva se PCR-6.

    PCR za dijagnostiku HIV-a

    Zbog činjenice da je metoda vrlo osjetljiva na promjene u tijelu i dijagnostičke uvjete, mnogi čimbenici mogu utjecati na rezultat. Stoga PCR test za HIV infekciju nije pouzdana metoda, njegova učinkovitost je 96-98%. U preostalih 2-4% slučajeva test daje lažno pozitivne rezultate.

    Ali u nekim situacijama ne možete bez PCR dijagnostike HIV-a. Obično se provodi na osobama s lažno negativnim ELISA rezultatom. Takvi pokazatelji pokazuju da osoba još nije razvila antitijela na virus i ne mogu se otkriti bez višestrukog povećanja broja. Upravo se to može postići analizom krvi PCR metodom.

    Takva dijagnostika je također neophodna za djecu u prvoj godini života rođenu od HIV pozitivne majke. Metoda je jedini način da se pouzdano utvrdi status djeteta.

    PCR za dijagnosticiranje hepatitisa

    Metoda lančane reakcije polimeraze omogućuje otkrivanje DNK virusa hepatitisa A, B, C mnogo prije stvaranja protutijela na infekciju ili pojave simptoma bolesti. Posebno je učinkovit PCR test za hepatitis C, budući da je u 85% slučajeva ova bolest asimptomatska i bez pravodobnog liječenja postaje kronična.

    Pravovremeno otkrivanje patogena pomoći će u izbjegavanju komplikacija i dugotrajnom liječenju.

    Sveobuhvatni PCR pregled

    Sveobuhvatna PCR analiza: pretraga metodom polimezičke lančane reakcije koja uključuje istovremeno određivanje više vrsta infekcija: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, herpes tipa 1 i 2, gonoreja, papiloma virus. Cijena takve dijagnostike kreće se od 2000 do 3500 rubalja. ovisno o klinici, korištenim materijalima i opremi, kao i vrsti analize: kvalitativnoj ili kvantitativnoj. Liječnik će odlučiti koja je potrebna u vašem slučaju. U nekim slučajevima dovoljno je jednostavno odrediti prisutnost patogena, u drugima, na primjer, s HIV infekcijom, kvantitativni titar igra važnu ulogu. Kod dijagnosticiranja svih gore navedenih uzročnika, pregled se naziva "PCR-12 analiza".

    Dekodiranje rezultata analize

    Dešifriranje PCR analize nije teško. Postoje samo 2 ljestvice indikatora - "pozitivan rezultat" i "negativan rezultat". Ako se otkrije patogen, liječnici mogu potvrditi prisutnost bolesti s 99% pouzdanosti i započeti liječenje pacijenta. Kod kvantitativne metode određivanja infekcije, brojčani pokazatelj otkrivenih bakterija bit će naznačen u odgovarajućem stupcu. Samo liječnik može odrediti stupanj bolesti i propisati potrebno liječenje.

    U nekim slučajevima, na primjer, pri određivanju HIV infekcije metodom PCR, ako je rezultat negativan, postaje potrebno provesti dodatna ispitivanja kako bi se potvrdili dobiveni pokazatelji.

    Gdje se mogu testirati?

    Gdje napraviti PCR test: u javnoj klinici ili u privatnom laboratoriju? Nažalost, u općinskom medicinske ustanove oprema i metode su često zastarjele. Stoga je bolje dati prednost privatnim laboratorijima s modernom opremom i visokokvalificiranim osobljem. Osim toga, u privatnoj klinici rezultate ćete dobiti mnogo brže.

    U Moskvi mnogi privatni laboratoriji nude PCR testiranje na razne infekcije. Na primjer, u takvim klinikama kao što su "Vita", "Complex Clinic", "Happy Family", "Uro-Pro" provodi se PCR analiza. Cijena pregleda je od 200 rubalja. za identifikaciju jednog patogena.

    Može se zaključiti da je dijagnoza zaraznih bolesti metodom PCR u većini slučajeva brz i pouzdan način otkrivanja uzročnika u tijelu u ranim fazama infekcije. Ali ipak, u određenim slučajevima vrijedi odabrati druge dijagnostičke metode. Samo stručnjak može odrediti potrebu za takvom studijom. Dešifriranje PCR analize također zahtijeva profesionalni pristup. Slijedite preporuke liječnika i nemojte sami uzimati nepotrebne pretrage.


PRINCIP METODE (molekularno biološke osnove)

Među širokim spektrom hibridizacijskih metoda za analizu DNA, u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici najviše se koristi PCR metoda.

Princip metode lančana reakcija polimerazom (PCR)(polimerazna lančana reakcija (PCR)) razvio je Kary Mullis (Cetus, SAD) 1983. godine. i trenutno se široko koristi za oboje znanstveno istraživanje, te za dijagnostiku u praktičnom zdravstvu i službi Državnog sanitarno-epidemiološkog nadzora (genotipizacija, dijagnostika zaraznih bolesti).

PCR metoda temelji se na prirodnom procesu - komplementarnom kompletiranju DNA matrice, koji se provodi pomoću enzima DNA polimeraze. Ova reakcija se zove replikacija DNK.

Prirodna replikacija DNK uključuje nekoliko faza:

1) Denaturacija DNA(odmotavanje dvostruke spirale, divergencija DNA lanaca);

2) Stvaranje kratkih dvolančanih dijelova DNA(primeri potrebni za pokretanje sinteze DNA);

3) Sinteza novog DNK lanca(komplementarni završetak obje niti)

Ovaj postupak se može koristiti za dobivanje kopija kratke dijelove DNA specifične za određene mikroorganizme, oni. provoditi ciljanu pretragu takvih specifičnih područja, što je i cilj genske dijagnostike za prepoznavanje uzročnika zaraznih bolesti.

Otkriće termostabilne DNA polimeraze (Taq polimeraze) iz termofilnih bakterija Thermis aquaticus, čiji je optimum u području 70-72°C, omogućio je da se proces replikacije DNA učini cikličkim i da se koristi za rad in vitro. Stvaranje programabilnih termostata (pojačala), koji provode cikličke promjene temperature prema zadanom programu, stvorilo je preduvjete za široko uvođenje PCR metode u praksu laboratorijske kliničke dijagnostike. Višestrukim ponavljanjem ciklusa sinteze dolazi do eksponencijalnog porasta broja kopija određenog fragmenta DNA, što omogućuje da se iz male količine analiziranog materijala, koji može sadržavati pojedinačne stanice mikroorganizma, dobije dovoljan broj kopija DNA za identificirati ih elektroforezom.

Komplementarni završetak lanca ne počinje ni na jednom mjestu u slijedu DNA, već samo u određenim početnim blokovima – kratkim dvolančanim dijelovima. Pričvršćivanjem takvih blokova na određene dijelove DNA moguće je usmjeriti proces sinteze novog lanca samo u tom dijelu, a ne cijelom dužinom lanca DNA. Za stvaranje početnih blokova u danim dijelovima DNA, dva oligonukleotidna početnica (20 parova nukleotida), tzv. početnice. Primeri su komplementarni DNA sekvencama na lijevoj i desnoj granici specifičnog fragmenta i usmjereni su na takav način da se završetak novog DNA lanca događa samo između njih.

Dakle, PCR je višestruko povećanje broja kopija (amplifikacija) specifične regije DNA katalizirano enzimom DNA polimeraza.

Za provođenje amplifikacije potrebne su sljedeće komponente:

Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNA lanaca)

Enzim Taq polimeraza(termostabilna DNA polimeraza koja katalizira produljenje početnih lanaca uzastopnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizirane DNA).

Puferska otopina(reakcijski medij koji sadrži Mg2+ ione neophodne za održavanje aktivnosti enzima)
Kako bi se identificirale specifične regije genoma RNA virusa, kopija DNA se prvo dobiva iz RNA predloška pomoću reakcije obrnute transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Da bi se dobio dovoljan broj kopija željenog karakterističnog fragmenta DNA, amplifikacija uključuje nekoliko (20-40) ciklusa.



Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze koje se odvijaju u različitim temperaturnim uvjetima

Faza 1: denaturacija DNA(rasplet dvostruke spirale). Javlja se na 93-95°C 30-40 sekundi.

Faza 2: Pričvršćivanje primera (žarenje). Spajanje početnica događa se komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNA na granicama specifične regije. Svaki par primera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja -20-60 sek.

Faza 3: Završetak DNK lanaca. Komplementarna adicija DNA lanaca odvija se od 5'-kraja do 3'-kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta pričvršćivanja početnica. Materijal za sintezu novih lanaca DNA su deoksiribonukleotidni trifosfati (dNTP) dodani otopini. Proces sinteze je kataliziran enzimom termostabilne DNA polimeraze (Taq polimeraza) i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.






Novi lanci DNA nastali u prvom ciklusu umnožavanja služe kao predlošci za drugi ciklus umnožavanja, u kojem nastaje željeni specifični fragment DNA (amplikon). (vidi sliku 2). U sljedećim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao predložak za sintezu novih lanaca. Dakle, amplikoni se nakupljaju u otopini prema formuli 2n, gdje je n broj ciklusa amplifikacije. Stoga, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jednu dvolančanu molekulu DNA, tada se u 30-40 ciklusa u otopini nakupi oko 108 molekula amplikona. Ova količina je dovoljna za pouzdanu vizualnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu. Proces pojačanja se odvija u posebnom programabilnom termostatu (pojačalu), koji prema zadanom programu automatski mijenja temperaturu prema broju ciklusa pojačanja.

FAZE PCR ANALIZE


PCR metoda, kao alat za laboratorijsku dijagnostiku zaraznih bolesti, temelji se na detekciji malog fragmenta DNA uzročnika (nekoliko stotina parova baza), specifičnog samo za određeni mikroorganizam, pomoću lančane reakcije polimeraze za nakupljanje željenog fragment.
Postupak analize PCR metodom uključuje tri faze:

1. Izolacija DNA (RNA) iz kliničkog uzorka


2. Amplifikacija specifičnih fragmenata DNA
3. Detekcija produkata amplifikacije

Izolacija DNA (RNA).
U ovoj fazi analize klinički uzorak se podvrgava posebnoj obradi, uslijed čega dolazi do lize staničnog materijala, uklanjanja frakcija proteina i polisaharida i dobivanja otopine DNA ili RNA bez
inhibitori i spremni za daljnje pojačavanje.
Odabir tehnike izolacije DNA (RNA) uglavnom je određen prirodom kliničkog materijala koji se obrađuje.

Amplifikacija specifičnih fragmenata DNA
U ovoj fazi nakupljaju se kratki specifični fragmenti DNA u količini potrebnoj za njihovu daljnju detekciju. Većina metoda za određivanje specifičnih fragmenata genoma koristi tzv. “klasična verzija ciljanog PCR-a. Kako bi se povećala specifičnost i osjetljivost analize, neke metode koriste "ugniježđenu" PCR metodu, koja koristi 2 para primera ("vanjski" - za stupanj 1 i "unutarnji" - za stupanj 2).

Detekcija produkata amplifikacije
U većini metoda, u ovoj fazi, smjesa produkata amplifikacije dobivena u 2. fazi se razdvaja horizontalnom elektroforezom u agaroznom gelu. Prije elektroforetskog odvajanja u smjesu za amplificiranje dodaje se otopina etidijevog bromida, koja stvara jake intersticijske spojeve s dvolančanim fragmentima DNA. Ovi spojevi mogu fluorescirati pod UV zračenjem, što se bilježi u obliku narančasto-crvenih svjetlećih traka nakon elektroforetskog odvajanja mješavine za pojačavanje u agaroznom gelu.

Kao alternativa elektroforetskoj metodi detekcije, koja ima neke nedostatke: subjektivnost u očitavanju rezultata, ograničenja u određivanju DNA različitih mikroorganizama u jednoj reakciji, može se predložiti sheme detekcije hibridizacije. U tim shemama, fragment DNA nastao kao rezultat amplifikacije hibridizira (tvori dvolančane komplekse - "hibride") sa specifičnom oligonukleotidnom sondom. Registriranje takvih kompleksa može se provesti kolorimetrijski ili fluorimetrijski. SPF "Litekh" kreirao je komplete za detekciju temeljene na hibridizaciji s fluorimetrijskom registracijom rezultata

PREDNOSTI PCR METODE kao metode dijagnostike zaraznih bolesti:

- Izravna definicija prisutnost patogena

Mnoge tradicionalne dijagnostičke metode, kao što je enzimski imunotest, identificiraju proteine ​​markere koji su otpadni produkti infektivnih agenasa, što daje samo neizravan dokaz o prisutnosti infekcije. Identifikacija specifičnog dijela DNA patogena pomoću PCR daje izravnu indikaciju prisutnosti uzročnika infekcije.



- Visoka specifičnost
Visoka specifičnost PCR metode je zbog činjenice da se u materijalu koji se proučava otkriva jedinstveni fragment DNA, karakterističan samo za određeni patogen. Specifičnost je određena nukleotidnim slijedom početnica, koji eliminira
mogućnost dobivanja lažnih rezultata, za razliku od metode enzimski imunološki test, gdje su česte pogreške zbog antigena koji reagiraju unakrsno.

- Visoka osjetljivost
PCR metoda omogućuje otkrivanje čak i pojedinačnih stanica bakterija ili virusa. PCR dijagnostika otkriva prisutnost uzročnika zaraznih bolesti u slučajevima kada se koriste druge metode (imunološke, bakteriološke,
mikroskopski) to se ne može učiniti. Osjetljivost PCR analize je 10-1000 stanica po uzorku (osjetljivost imunoloških i mikroskopskih pretraga je 103-105 stanica).

-Sveučilište postupka za identifikaciju različitih patogena
Materijal za istraživanje pomoću PCR metode je DNA patogena. Metoda se temelji na identificiranju fragmenta DNA ili RNA koji je specifičan za određeni organizam. Sličnost kemijskog sastava svih nukleinskih kiselina omogućuje korištenje jedinstvenih metoda za provođenje laboratorijskih istraživanja. To omogućuje dijagnosticiranje nekoliko patogena iz jednog biouzorka. Kao ispitni materijal mogu se koristiti različiti biološki sekreti (sluz, urin, ispljuvak), strugotine epitelnih stanica, krv i serum.

- Velika brzina dobivanja rezultata analize
PCR analiza ne zahtijeva izolaciju i uzgoj kulture patogena, što oduzima puno vremena. Jedinstvena metoda obrade biomaterijala i detekcije produkata reakcije, te automatizacija procesa amplifikacije omogućuju provođenje kompletne analize za 4-4,5 sata.

Treba napomenuti da se PCR metodom mogu detektirati uzročnici ne samo u kliničkom materijalu dobivenom od bolesnika, već iu materijalu dobivenom iz okolišnih objekata (voda, tlo, itd.)

PRIMJENA PCR METODE U PRAKTIČNOJ ZDRAVSTVENOJ ZAŠTITI

Korištenje PCR metode za dijagnosticiranje zaraznih bolesti bakterijske i virusne prirode od ogromnog je značaja za rješavanje mnogih problema mikrobiologije i epidemiologije. Korištenje ove metode pridonosi i razvoju temeljnih istraživanja u području proučavanja kroničnih i nedovoljno poznatih zaraznih bolesti.

Najučinkovitija i ekonomski isplativa uporaba metode je u:

uroginekološke prakse- za otkrivanje klamidije, ureaplazmoze, gonoreje, herpesa, gardnereloze, infekcije mikoplazmom;

u pulmologiji- Za diferencijalna dijagnoza virusna i bakterijska upala pluća, tuberkuloza;

u gastroenterologiji- identificirati helikobakteriozu;

u klinici za zarazne bolesti- kao ekspresna metoda za dijagnosticiranje salmoneloze, difterije, virusne hepatitis B, C i G;

u hematologiji- prepoznati infekcija citomegalovirusom, onkovirusi.

Na kraju članka vidi
Lančana reakcija polimerazom (PCR) izumio 1983. Kary Mullis (američki znanstvenik). Kasnije je za ovaj izum dobio Nobelovu nagradu. Trenutno je PCR dijagnostika jedna od najtočnijih i najosjetljivijih metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti.
Lančana reakcija polimerazom (PCR)- eksperimentalna metoda molekularne biologije, metoda za značajno povećanje malih koncentracija određenih fragmenata nukleinske kiseline (DNK) u biološkom materijalu (uzorku).
Metoda PCR temelji se na ponovljenom udvostručavanju određenog dijela DNA pomoću enzima u umjetnim uvjetima (in vitro). Kao rezultat, proizvedene su količine DNK dovoljne za vizualnu detekciju. U tom slučaju kopira se samo odjeljak koji zadovoljava navedene uvjete i samo ako je prisutan u uzorku koji se proučava.
Osim jednostavnog povećanja broja kopija DNA (taj se proces naziva amplifikacija), PCR omogućuje mnoge druge manipulacije genetskim materijalom (uvođenje mutacija, spajanje fragmenata DNA), a naširoko se koristi u biološkim i medicinska praksa, primjerice, za dijagnosticiranje bolesti (nasljednih, zaraznih), za utvrđivanje očinstva, za kloniranje gena, uvođenje mutacija, izolaciju novih gena.

Specifičnost i primjena

Provođenje PCR-a

Za provođenje PCR-a u najjednostavnijem slučaju potrebne su sljedeće komponente:

  • DNK predložak koji sadrži dio DNK koji treba umnožiti;
  • dva primera komplementarna krajevima željenog fragmenta;
  • termostabilna DNA polimeraza;
  • deoksinukleotidni trifosfati (A, G, C, T);
  • ioni Mg2+ potrebni za rad polimeraze;
  • puferska otopina.

PCR se provodi u termalnom cikleru - uređaju koji omogućuje periodično hlađenje i zagrijavanje epruveta, obično s točnošću od najmanje 0,1°C. Kako biste izbjegli isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu dodajte ulje visokog vrelišta, poput vazelina. Dodavanje specifičnih enzima može povećati prinos PCR reakcije.
Napredak reakcije

Tipično, PCR provodi 20 - 35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze. Predložak dvolančane DNA zagrijava se na 94 - 96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5 - 2 minute da se razdvoje lanci DNA. Taj se stadij naziva denaturacija – uništavaju se vodikove veze između dvaju lanaca. Ponekad, prije prvog ciklusa, reakcijska smjesa se prethodno zagrijava 2 - 5 minuta da se potpuno denaturiraju matrica i primeri.
Nakon što se niti razdvoje, temperatura se snižava kako bi se primeri mogli vezati na jednolančani predložak. Ova faza se naziva žarenje. Temperatura žarenja ovisi o temeljnim premazima i obično se bira 4 - 5°C ispod njihove temperature taljenja. Vrijeme faze je 0,5 - 2 minute.

DNA polimeraza replicira lanac predloška koristeći početnicu kao početnicu. Ovo je faza elongacije. Temperatura elongacije ovisi o polimerazi. Često korištene polimeraze najaktivnije su na 72°C. Vrijeme elongacije ovisi i o vrsti DNA polimeraze i o duljini umnoženog fragmenta. Tipično, vrijeme elongacije se uzima kao jedna minuta na tisuću parova baza. Nakon što su svi ciklusi dovršeni, često se izvodi dodatni završni korak elongacije kako bi se dovršili svi jednolančani fragmenti. Ova faza traje 10 - 15 minuta.
Priprema materijala za istraživanje i transport u laboratorij

Za uspješnu analizu važno je pravilno prikupiti materijal od pacijenta i pravilno ga pripremiti. Poznato je da se u laboratorijskoj dijagnostici većina pogrešaka (do 70%) čini upravo u fazi pripreme uzorka. Za prikupljanje krvi u laboratoriju INVITRO trenutno se koriste vakuumski sustavi koji s jedne strane minimalno ozljeđuju pacijenta, as druge strane omogućuju uzimanje materijala na način da ne dolazi u kontakt s bilo osoblje ili okolina. Time se izbjegava kontaminacija (kontaminacija) materijala i osigurava objektivnost PCR analize.

DNA - deoksiribonukleinska kiselina - biološki polimer, jedna od dvije vrste nukleinskih kiselina koje osiguravaju pohranu, prijenos s koljena na koljeno i provedbu genetskog programa za razvoj i funkcioniranje živih organizama. Glavna uloga DNK u stanicama je dugoročno pohranjivanje informacija o strukturi RNK i proteina.


RNA–ribonukleinska kiselina je biološki polimer sličan po svom kemijska struktura na DNK. Molekula RNA izgrađena je od istih monomernih jedinica – nukleotida – kao i DNA. U prirodi RNK obično postoji kao jedan lanac. U nekim virusima, RNA je nositelj genetske informacije. U stanici ima važnu ulogu u prijenosu informacija od DNA do proteina. RNA se sintetizira na DNA šabloni. Taj se proces naziva transkripcija. Postoje područja u DNK koja sadrže informacije odgovorne za sintezu tri vrste RNK, koje se razlikuju po funkcijama koje obavljaju: messenger ili messenger RNA (mRNA), ribosomska RNA (rRNA) i transportna RNA (tRNA). Sve tri vrste RNA su na ovaj ili onaj način uključene u sintezu proteina. Međutim, informacije o sintezi proteina sadržane su samo u mRNA.


Nukleotidi su osnovne ponavljajuće jedinice u molekulama nukleinskih kiselina, produkt kemijske kombinacije dušične baze, šećera s pet ugljika (pentoze) i jedne ili više fosfatnih skupina. Nukleotidi prisutni u nukleinskim kiselinama sadrže jednu fosfatnu skupinu. Nazivaju se prema dušičnoj bazi koju sadrže - adenin (A), sadrži adenin, gvanin (G) - gvanin, citozin (C) - citozin, timin (T) - timin, uracil (U) - uracil. DNA sadrži 4 vrste nukleotida - A, T, G, C, RNA također sadrži 4 vrste - A, U, G, C. Šećer u svim nukleotidima DNA je deoksiriboza, RNA - riboza. Kada nastaju nukleinske kiseline, nukleotidi se vežu i tvore šećerno-fosfatnu okosnicu molekule, s jedne strane koje se nalaze baze.


Primer je kratka DNK koja se koristi za replikaciju lanca predloška. Svaki od prajmera je komplementaran jednom od nizova dvolančanog predloška, ​​uokvirujući početak i kraj amplificirane regije.


Književnost

  1. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija. Načela i primjena. Po. s engleskog - M.: Mir, 2002. - 589 str., ilustr. ISBN 5-03-003328-9
  2. Ščelkunov S.N. Genetski inženjering- Novosibirsk: Sib. sveuč. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.; bolestan ISBN 5-94087-098-8
  3. Patrushev L.I. Umjetni genetski sustavi - M.: Nauka, 2005 - U 2 sveska - ISBN 5-02-033278-X

VAŽNO!

Informacije iz ovaj odjeljak ne može se koristiti za samodijagnozu i samoliječenje. U slučaju boli ili drugog pogoršanja bolesti dijagnostičke studije smije propisati samo liječnik. Da biste postavili dijagnozu i pravilno propisali liječenje, trebate se obratiti svom liječniku.

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je metoda biokemijske tehnologije u molekularnoj biologiji, koja se provodi radi povećanja jedne ili više kopija fragmenata DNA za nekoliko stupnjeva, što omogućuje stvaranje od nekoliko tisuća do milijuna kopija određene sekvence DNA.


Razvio 1983. Cary Mullis, PCR je sada uobičajena i često nezamjenjiva tehnika koja se koristi u medicinskim i biološkim istraživačkim laboratorijima za niz različitih primjena. To uključuje kloniranje DNK za sekvenciranje, filogeniju temeljenu na DNK ili funkcionalna analiza geni; dijagnostika nasljedne bolesti; otkrivanje genetskih otisaka prstiju (koristi se u forenzičkoj znanosti i testiranju očinstva), te otkrivanje i dijagnoza zaraznih bolesti. Godine 1993. Mullis je zajedno s Michaelom Smithom dobio Nobelovu nagradu za kemiju za njihov rad na PCR-u.

Metoda se temelji na toplinskom ciklusu, koji se sastoji od ponovljenih ciklusa zagrijavanja i hlađenja reakcije denaturacije i replikacije DNK pomoću enzima. Primeri, (kratki dijelovi DNK) koji sadrže sekvence komplementarne ciljnom mjestu zajedno s DNK polimerazom (po kojoj je metoda dobila ime), ključne su komponente za pokretanje selektivne i ponovljene amplifikacije. U PCR procesu, sama sintetizirana DNK se koristi kao predložak za replikaciju, čime se pokreće lančana reakcija u kojoj se DNK predložak eksponencijalno umnožava. PCR se može značajno modificirati za izvođenje širokog spektra genetskih manipulacija.

Gotovo sve PCR aplikacije koriste termostabilnu DNA polimerazu kao što je Taq polimeraza, enzim izvorno izoliran iz bakterija Termusaquaticus. Ova DNA polimeraza enzimatski sastavlja novi lanac DNA od građevnih blokova DNA - nukleotida, koristeći jednolančanu DNA kao predložak i DNA oligonukleotide (koji se nazivaju i DNA početnice) koji su neophodni za pokretanje sinteze DNA. Velika većina PCR metoda koristi termalni ciklus, tj. naizmjenično zagrijavanje i hlađenje PCR uzorka tijekom određenog niza temperaturnih koraka. Ovi toplinski ciklusi su potrebni da bi se najprije fizički odvojile dvije niti dvostruke spirale DNK na visokoj temperaturi u procesu koji se naziva denaturacija DNK. Na nižim temperaturama, svaki lanac će se koristiti kao predložak u sintezi DNA pomoću DNA polimeraze kako bi se selektivno pojačala ciljna regija DNA. Selektivnost rezultata PCR-a upotrebom početnica koje su komplementarne ciljnoj regiji DNA za umnožavanje pod određenim uvjetima toplinskog ciklusa.

Principi PCR dijagnostike

PCR se koristi za umnožavanje specifičnog dijela DNK lanca (ciljna DNK). Većina PCR metoda obično pojačava fragmente DNA do ~10 000 parova baza (kb), iako neke metode mogu povećati fragmente do 40 kb u veličini. Reakcija proizvodi ograničenu količinu konačnog amplificiranog produkta, koja se regulira dostupnim reagensima u reakciji i povratnom inhibicijom produkata reakcije.

Osnovni PCR komplet zahtijeva nekoliko komponenti i reagensa. To uključuje:

  • DNK predložak, koji sadrži ciljnu regiju DNK koju je potrebno umnožiti.
  • Dva primera komplementarni s 3" krajevima svakog od smislenih i antisense lanaca ciljne DNA.
  • Taq polimeraza ili drugu DNA polimerazu koja radi na optimalnoj temperaturi od oko 70 °C.
  • Deoksinukleozidni trifosfati(dNTPs; trifosfatne skupine koje sadrže nukleotide), građevni blokovi iz kojih DNA polimeraza sintetizira novi lanac DNA.
  • Puferska otopina, osiguravajući odgovarajuće kemijske uvjete za optimalnu aktivnost i stabilnost DNA polimeraze.
  • Dvovalentni kationi, ioni magnezija ili mangana; Mg2+ se obično koristi, ali Mn2+ se također može koristiti za mutagenezu DNA posredovanu PCR-om, budući da veće koncentracije Mn2+ povećavaju stopu pogreške tijekom sinteze DNA.
  • Jednovalentni kationi ioni kalija.

PCR se obično provodi u reakcijskom volumenu od 10-200 µl u malim reakcijskim epruvetama (volumena 0,2-0,5 ml) u termalnom ciklerskom pojačivaču. Pojačalo zagrijava i hladi reakcijske cijevi kako bi se postigle temperature potrebne za svaki korak reakcije. Mnogi moderni termocikleri koriste Peltierov učinak, koji omogućuje zagrijavanje i hlađenje bloka PCR epruveta jednostavnom promjenom smjera električne struje. Reakcijske cijevi tankih stijenki potiču povoljnu toplinsku vodljivost kako bi se osigurala brza toplinska ravnoteža. Stariji cikleri koji nemaju grijani poklopac zahtijevaju sloj ulja na površini reakcijske smjese ili zrnca voska u epruveti.

Postupak

Tipično, PCR se sastoji od niza od 20-40 ponovljenih promjena temperature koje se nazivaju ciklusi, pri čemu se svaki ciklus obično sastoji od 2-3 diskretna temperaturna koraka, obično tri. Ciklusiranje često počinje i završava jednim temperaturnim korakom (tzv čekajući) na visokoj temperaturi (>90°C) za ekspanziju konačnog proizvoda ili kratkotrajno skladištenje. Temperature koje se koriste i vrijeme njihove primjene u svakom ciklusu ovise o mnogim parametrima. To uključuje enzim koji se koristi za sintezu DNK, koncentraciju dvovalentnih iona i dNTP u reakciji i temperaturu taljenja (Tm) početnica.

  • Faza inicijalizacije: Ovaj korak sastoji se od zagrijavanja reakcije na temperaturu od 94-96 °C (ili 98 °C ako se koriste visoko termostabilne polimeraze) tijekom 1-9 minuta. Korak je potreban samo za DNA polimeraze koje zahtijevaju aktivaciju toplinom, takozvani hot start PCR.
  • Faza denaturacije: To je prvi redoviti događaj toplinskog ciklusa i sastoji se od zagrijavanja reakcije na 94-98°C tijekom 20-30 sekundi. To uzrokuje cijepanje predloška DNA s razaranjem vodikovih veza između komplementarnih baza i stvaranjem jednolančanih molekula DNA.
  • Faza žarenja: Reakcijska temperatura se smanji na 50-65°C unutar 20-40 sekundi, što omogućuje vezivanje početnica na jednolančanu DNA šablonu. Tipično je temperatura žarenja oko 3-5 stupnjeva Celzijusa ispod Tm korištenih primera. Stabilne vodikove veze DNA-DNA nastaju samo kada sekvenca primera više odgovara šabloni sekvence. Polimeraza se veže na hibrid primer-template i započinje sintezu DNA.
  • Faza širenja/produženja: Temperatura u ovoj fazi ovisi o korištenoj DNA polimerazi; Taq polimeraza ima svoju optimalnu temperaturu aktivnosti na 75-80°C; Za ovaj enzim obično se koristi temperatura od 72°C. U ovoj fazi, DNA polimeraza sintetizira novi DNA lanac komplementaran s predloškom DNA lanca, dodajući dNTP-ove koji su komplementarni s predloškom u smjeru od 5" do 3", povezujući 5"-fosfatnu skupinu dNTP-a s 3"- hidroksilnu skupinu na kraju nastale (produžne) DNA. Vrijeme produženja ovisi i o korištenoj DNA polimerazi i o duljini fragmenta DNA koji treba umnožiti. Tipično, na svojoj optimalnoj temperaturi, DNA polimeraza polimerizira tisuću baza u minuti. Pod optimalnim uvjetima, tj. u nedostatku ograničenja zbog ograničavajućih supstrata ili reagensa, u svakom koraku ekspanzije, količina ciljne DNA se udvostručuje, što rezultira eksponencijalnim (geometrijskim) umnožavanjem fragmenta DNA.
  • Završno proširenje: Ovo je jedan korak, koji se ponekad izvodi na 70-74°C 5-15 minuta nakon posljednjeg PCR ciklusa kako bi se osiguralo da je preostala jednolančana DNK potpuno produljena.
  • Konačno očekivanje: Ovaj korak na 4-15°C na neodređeno vrijeme može se koristiti za održavanje reakcije kratko vrijeme. Kako bi se ispitalo je li PCR sintetizirao očekivani fragment DNA (koji se ponekad naziva i "amplimer" ili "amplicon"), koristi se elektroforeza u agaroznom gelu za odvajanje PCR proizvoda po veličini. Veličina PCR produkata određena je usporedbom s DNA ljestvama (marker molekularne težine), koji sadrži DNA fragmente poznate veličine, a koja se izvodi na gelu zajedno s PCR produktima.

Koraci lančane reakcije polimeraze

PCR proces se može podijeliti u tri faze:

  1. Eksponencijalno pojačanje: Tijekom svakog ciklusa, količina proizvoda se udvostručuje (pod pretpostavkom 100% učinkovitosti reakcije). Reakcija je vrlo osjetljiva: potrebna je samo mala količina DNK.
  2. Faza izravnavanja: Reakcija se usporava kako DNA polimeraza gubi aktivnost, a potrošnja reagensa kao što su dNTP i početnice uzrokuje njihovo ograničavanje .
  3. Plato: Proizvod se više ne nakuplja zbog iscrpljivanja reagensa i enzima.

PCR optimizacija

U praksi, PCR može biti neuspješan iz različitih razloga, posebice zbog njegove osjetljivosti na kontaminaciju, koja uzrokuje umnožavanje nusproizvoda DNA. U tom smislu, razvijen je niz tehnika i postupaka za optimizaciju uvjeta PCR. Kontaminacija stranom DNK rješava se laboratorijskim protokolima i postupcima koji pročišćavaju mješavine prije PCR od potencijalnih kontaminanata DNK. To obično uključuje prostorno odvajanje PCR kompleta od područja za analizu ili pročišćavanje PCR proizvoda, korištenje jednokratnog plastičnog pribora i temeljito čišćenje radne površine između koraka reakcije. Tehnike dizajna primera igraju važnu ulogu u poboljšanju oporavka PCR proizvoda i izbjegavanju stvaranja nusproizvoda, a upotreba alternativnih komponenti pufera ili enzima polimeraze može pomoći u pojačavanju dugih ili na drugi način problematičnih dionica DNK. Dodavanje reagensa kao što je formamid u međuspremnički sustavi može povećati specifičnost i oporavak PCR-a. Računalna simulacija teoretskih rezultata PCR-a (elektronički PCR) može se izvesti kao pomoć u dizajnu početnica.

Primjena PCR-a

Selektivna ekstrakcija DNA

PCR omogućuje izolaciju fragmenata DNA iz genomske DNA selektivnim umnožavanjem specifične regije DNA. Ova primjena PCR-a nadopunjuje mnoge tehnike, kao što je generiranje hibridizacijskih sondi za Southern ili Northern blotting i kloniranje DNA, koje zahtijevaju velike količine DNA koje predstavljaju određenu regiju DNA. PCR ovim metodama daje visok sadržaj čiste DNK, što omogućuje analizu DNK uzoraka čak i s malim količinama početnog materijala.

Druge primjene PCR-a uključuju sekvenciranje DNA za identifikaciju nepoznatih sekvenci pojačanih PCR-om, u kojima se jedan od početnica za pojačanje može koristiti u Sanger sekvencioniranju, ekstrakciju sekvenci DNA za ubrzavanje tehnologija rekombinantne DNA koje uključuju umetanje sekvence DNA u plazmid ili genetski materijal drugog organizma. Kolonije bakterija (E. coli) mogu se brzo pregledati PCR-om kako bi se ispravio dizajn vektorske DNK. PCR se također može koristiti za genetski otisak prsta; tehnika koja se koristi u sudskoj medicini za identifikaciju osobe ili organizma usporedbom eksperimentalne DNK korištenjem različitih PCR metoda.

Neke PCR metode uzimanja otisaka prstiju imaju veliku diskriminatornu moć i mogu se koristiti za utvrđivanje genetskih odnosa između pojedinaca, kao što su roditelj-dijete ili između braće i sestara, te se koriste za otkrivanje očinstva. Ova se tehnika također može koristiti za određivanje evolucijskih odnosa između organizama.

Amplifikacija i kvantifikacija DNA

Budući da PCR povećava broj kopija DNA regija koje su ciljane, PCR se može koristiti za analizu vrlo malih količina uzorka. To je često kritično u forenzičkim slučajevima gdje su samo tragovi DNK dostupni kao dokaz. PCR se također može koristiti za analizu drevne DNK koja je stara nekoliko desetaka tisuća godina. Ove PCR metode uspješno su korištene na životinjama kao što je četrdeset tisuća godina star mamut, kao i na ljudskoj DNK, u različitim primjenama od analize egipatskih mumija do identifikacije ruskog cara.

Kvantitativne PCR metode mogu procijeniti količinu dane sekvence prisutne u uzorku - metoda se često koristi za to kvantifikacija razina ekspresije gena. PCR u stvarnom vremenu etabliran je alat za kvantitativna analiza DNA, koji mjeri nakupljanje produkta DNA nakon svakog PCR ciklusa amplifikacije.

PCR u dijagnostici bolesti

PCR omogućuje ranu dijagnostiku zloćudnih bolesti poput leukemije i limfoma, što je trenutno jako razvijeno u istraživanju raka i već se rutinski koristi. PCR se može provesti izravno na uzorcima genomske DNA za otkrivanje malignih stanica specifičnih za translokaciju s osjetljivošću koja je najmanje 10 000 puta veća od ostalih metoda.

PCR također može otkriti nekultivirane ili spororastuće mikroorganizme kao što su mikobakterije, anaerobne bakterije i virusi iz kulture tkiva i životinjskih modela. Osnova PCR dijagnostičke primjene u području mikrobiologije je identifikacija uzročnika infekcije i razlikovanje nepatogenih sojeva od patogenih zbog specifičnih gena.

Virusna DNA također se može otkriti pomoću PCR-a. Primeri moraju biti specifični za ciljanje virusnih DNA sekvenci, a PCR se može koristiti za dijagnostičke DNK testove ili sekvenciranje virusnog genoma. Visoka osjetljivost PCR-a omogućuje otkrivanje virusa ubrzo nakon infekcije, pa čak i prije početka bolesti. Ovo rano otkrivanje virusa moglo bi liječnicima dati značajne mogućnosti liječenja. Također se može odrediti količina virusa ("virusno opterećenje") u bolesnika kvantitativna metoda Analiza DNA temeljena na PCR.

Varijacije osnovnih metoda lančane reakcije polimeraze

  • Alel-specifična PCR: Dijagnostička metoda ili metoda kloniranja koja se temelji na polimorfizmima jednog nukleotida (SNP) (razlike u jednoj bazi u DNK). Zahtijeva prethodno poznavanje DNK sekvence, uključujući razlike između alela, i koristi početnice čiji 3" krajevi obuhvaćaju SNP. PCR amplifikacija pod strogim uvjetima mnogo je manje učinkovita u prisutnosti nepodudarnosti između predloška i početnice, tako da je uspješna amplifikacija sa SNP- specifični početni signali o prisutnosti specifičnih SNP-ova u sekvenci.
  • PCR sklop ili sklop polimeraze (PCR): umjetna sinteza dugih sekvenci DNA izvođenjem PCR-a na rezervi dugih oligonukleotida s kratkim preklapajućim segmentima. Oligonukleotidi se izmjenjuju između smislenih i antisense smjerova niti, a segmenti koji se preklapaju određuju redoslijed PCR fragmenata, čime se selektivno proizvode konačni dugi DNK produkt.
  • Asimetrični PCR: Preferirano pojačava jedan lanac DNK u dvolančanoj DNK šabloni. Koristi se u ispitivanju sekvenciranja i hibridizacije gdje je potrebno pojačanje samo jednog od dva komplementarna lanca. PCR se provodi kao i obično, ali s velikim viškom početnica za lanac koji treba umnožiti. Zbog spore (aritmetičke progresije) amplifikacije na kraju reakcije nakon upotrebe ograničavajućeg primera, potrebni su dodatni PCR ciklusi. Najnovija modifikacija ovog procesa, poznata kao "LATE-PCR" (linearnost nakon eksponencijalne faze - PCR), koristi ograničavajući primer s višom temperaturom taljenja (Tm) od viška primera za održavanje učinkovitosti reakcije jer koncentracija ograničavajućeg primera smanjuje se usred reakcije.
  • Dial-out PCR: Vrlo paralelna metoda za dobivanje preciznih molekula DNA za sintezu gena. Složeni skup molekula DNK modificiran je jedinstvenim bočnim oznakama prije masivnog paralelnog sekvenciranja. Prajmeri usmjereni na oznaku zatim proizvode molekule s danom sekvencom pomoću PCR-a.
  • Pojačanje ovisno o helikazi: sličan tradicionalnom PCR-u, ali zahtijeva stalnu temperaturu nego ciklusi kroz cikluse denaturacije i žarenja/ekstenzije. DNK helikaza, enzim koji odmotava DNK, koristi se umjesto toplinske denaturacije.
  • Hot start PCR: Tehnika koja smanjuje nespecifično pojačanje tijekom početnog postavljanja PCR koraka. Može se obaviti ručno zagrijavanjem komponenti reakcije do temperature denaturacije (npr. 95 °C) prije dodavanja polimeraze. Razvijeni su specijalizirani enzimski sustavi koji inhibiraju aktivnost polimeraze na sobnoj temperaturi, bilo vezanjem protutijela ili u prisutnosti kovalentno vezanih inhibitora koji disociraju tek nakon koraka aktivacije na visokoj temperaturi. PCR "vrući početak/hladni završetak" postiže se korištenjem novih hibridnih polimeraza koje su neaktivne na sobnoj temperaturi i odmah se aktiviraju na temperaturi elongacije.
  • Intermikrosatelitni sekvencijski specifični PCR (ISSR): PCR je metoda DNK otiska prsta koja povećava broj kopija regija između jednostavnih sekvenci koje se ponavljaju kako bi se dobio jedinstveni otisak prsta iz umnožene duljine fragmenta.
  • Obrnuto PCRširoko se koristi za identifikaciju regija sekvenci oko genomskih umetanja. Uključuje niz cijepanja DNK i samovezivanja koja proizvode poznate sekvence na oba kraja nepoznate sekvence.
  • PCR posredovan ligacijom: Koristi male DNK poveznice povezane s DNK od interesa i više početnica povezanih s DNK poveznicama; koristi se za sekvenciranje DNK, hodanje genomom i DNK trag.
  • PCR specifičan za metilaciju(MSP): razvili Stephen Baylin i Jim Herman na Medicinskom fakultetu Johns Hopkins, koristi se za otkrivanje metilacije CpG otoka u genomskoj DNK. DNK se najprije tretira natrijevim bisulfitom, koji pretvara nemetilirane citozinske baze u uracil, kojeg PCR početnice prepoznaju kao timin. Zatim se provode dva PCR-a na modificiranoj DNK koristeći skupove identičnih početnica, osim na bilo kojem CpG otoku unutar sekvence početnice. U tim točkama, jedan set početnica prepoznaje DNA s citozinima kako bi povećao broj kopija metilirane DNA, a jedan set prepoznaje DNA s uracilom ili timinom kako bi pojačao nemetiliranu DNA. MSP pomoću qPCR-a također se može izvesti radi dobivanja kvantitativnih, a ne kvalitativnih informacija o metilaciji.
  • Miniprimer - PCR: koriste se termostabilne polimeraze (S-Tbr) koje se mogu razvijati iz kratkih početnica (“smalligos”), s brojem od 9 ili 10 nukleotida. Ova metoda omogućuje PCR-u da cilja regije vezane manjim početnicama i koristi se za umnožavanje konzerviranih sekvenci DNK kao što je 16S (ili eukariotski 18S) rRNA gen.
  • Amplifikacija sonde ovisna o multipleksnoj ligaciji (MLPA): omogućuje pojačanje višestrukih ciljeva sa samo jednim parom početnica, čime se izbjegavaju ograničenja razlučivosti multipleksne PCR.
  • Multiplex PCR sastoji se od višestrukih skupova početnica u jednoj PCR smjesi za proizvodnju amplikona različitih veličina koji su specifični za različite sekvence DNA. Usmjeravanjem na nekoliko gena istovremeno, moguće je dobiti Dodatne informacije prilikom izvođenja jednog testa, koji bi inače zahtijevao nekoliko puta više reagensa i više vremena za dovršenje. Temperature žarenja za svaki set primera moraju biti optimizirane kako bi ispravno radile unutar jedne reakcije i s veličinama umnožaka. To jest, njihove duljine parova baza moraju biti dovoljno različite da proizvedu različite trake kada se vizualiziraju elektroforezom u gelu.
  • Ugniježđeni PCR: Povećava specifičnost amplifikacije DNA smanjenjem pozadine zbog nespecifične amplifikacije DNA. Dva seta početnica koriste se u dva uzastopna PCR-a. U prvoj reakciji, jedan par početnica koristi se za sintetiziranje produkata DNA koji se, osim ciljane mete, još uvijek mogu sastojati od nespecifično umnoženih fragmenata DNA. Proizvodi se zatim koriste u drugom PCR-u sa skupom početnica čija su vezna mjesta potpuno ili djelomično različita od 3" krajeva svake od početnica korištenih u prvoj reakciji. Ugniježđeni PCR često je uspješniji u specifičnom pojačavanju dugih fragmenata DNA nego tradicionalni PCR, ali zahtijeva detaljnije poznavanje ciljnih sekvenci.
  • PCR s preklapajućim nastavcima ili spajanje preklapanjem nastavaka(SOE): Tehnika genetskog inženjeringa koja se koristi za spajanje dva ili više dijelova DNK koji sadrže komplementarne sekvence. Koristi se za spajanje dijelova DNK koji sadrže gene, regulatorne sekvence ili mutacije; Tehnika vam omogućuje stvaranje specifičnih i dugih struktura DNK.
  • Kvantitativni PCR (qPCR): koristi se za mjerenje količine PCR produkta (obično u stvarnom vremenu). Kvantitativno mjeri početne količine DNA, cDNA ili RNA. qPCR se naširoko koristi za određivanje prisutnosti DNA sekvence u uzorku i broja njezinih kopija u uzorku. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu ima vrlo visok stupanj točnosti. Metode QRT-PCR (ili QF-PCR) koriste fluorescentne boje kao što su Sybr Green, EvaGreen ili DNA sonde koje sadrže fluorofore kao što je TaqMan za mjerenje količine umnoženog produkta u stvarnom vremenu. Ponekad se naziva skraćenicom RT-PCR (PCR u stvarnom vremenu) ili RQ-PCR. QRT-PCR ili RTQ-PCR prikladnije su kratice, budući da se RT-PCR obično odnosi na PCR s obrnutom transkripcijom, koji se često koristi u kombinaciji s qPCR-om.
  • PCR obrnute transkripcije (RT-PCR): za povećanje broja kopija DNK iz RNK. Reverzna transkriptaza transkribira RNA u cDNA, koja se zatim umnožava pomoću PCR-a. RT-PCR se široko koristi u profiliranju ekspresije za otkrivanje ekspresije gena ili za određivanje sekvence RNA transkripta, uključujući mjesta početka i završetka transkripcije. Ako je poznata sekvenca genomske DNA gena, RT-PCR se može koristiti za mapiranje položaja egzona i introna u genu. 5" kraj gena (koji odgovara početnom mjestu transkripcije) obično se određuje pomoću RACE-PCR (brzo pojačanje cDNA krajeva).
  • Čvrsta faza PCR: pokriva nekoliko značenja, uključujući "polonijsko umnožavanje" (gdje se PCR kolonija provodi na matrici gela, na primjer), "premosni PCR" (primeri su kovalentno povezani na čvrstu potpornu površinu), tradicionalni PCR na čvrstoj fazi (gdje je "asimetrični PCR " koristi se u prisutnosti početnica koje nose krutu podlogu sa sekvencom koja odgovara jednom od vodenih početnica) i poboljšane PCR krute faze (gdje se tradicionalna PCR krute faze može poboljšati upotrebom visokih Tm i ugniježđenih krutih početnica s mogućnost primjene toplinskog "koraka" za poticanje stvaranja temeljnih premaza na čvrstoj podlozi).
  • Termalni asimetrični izmjenični PCR (TAIL-PCR): koristi se za izolaciju nepoznate sekvence nakon poznate sekvence. U poznatom nizu, TAIL-PCR koristi ugniježđeni par primera s različitim temperaturama žarenja; degenerirani primer se koristi za pojačavanje u drugom smjeru od nepoznate sekvence.
  • Touchdown PCR (korak po korak PCR): varijanta PCR-a usmjerena na smanjenje nespecifične pozadine postupnim snižavanjem temperature žarenja kako PCR ciklusi napreduju. Temperatura žarenja u početnim ciklusima obično je nekoliko stupnjeva (3-5°C) iznad Tm korištenih primera, dok je u kasnijim ciklusima temperatura nekoliko stupnjeva (3-5°C) ispod Tm primera. Više temperature osiguravaju veću specifičnost za vezanje početnica, a niže temperature omogućuju učinkovitije pojačanje iz specifičnih proizvoda nastalih tijekom početnih ciklusa.
  • PAN-AC: Koristi izotermne uvjete za pojačavanje i može se koristiti na živim stanicama.
  • Univerzalna brza šetnja kroz genom: za hodanje genomom i genetski otisak prsta korištenjem specifičnijih "dvosmjernih" PCR-ova od tradicionalnih "jednosmjernih" pristupa (upotrebom samo jednog genski specifičnog primera i jednog općeg primera - što može dovesti do umjetne "buke") zbog mehanizma , uključujući formiranje laso strukture. Pojednostavljeni derivati ​​UFW su "Lane RAGE" (lasso-ovisan ugniježđeni PCR za brzo umnožavanje krajeva genomske DNA), "5" RACE Lane" i "3" RACE Lane".
  • UsilicoPCR(digitalni PCR, virtualni PCR, e-PCR, e-PCR) odnosi se na računalne alate koji se koriste za izračunavanje rezultata teorijske lančane reakcije polimeraze pomoću zadanog skupa početnica (sondi) za umnožavanje sekvenci DNK iz sekvenciranog genoma ili transkriptoma.

Povijest PCR-a

U članku u Journal of Molecular Biology iz 1971. Kleppe i njegovi suautori prvi su opisali metodu pomoću enzimatskog testa za repliciranje kratke DNK šablone s početnicama in vitro. Međutim, ova rana manifestacija osnovnog principa PCR-a nije dobila mnogo pozornosti, a izum lančane reakcije polimeraze 1983. općenito se pripisuje Karyju Mullisu.

Kada je Mullis 1983. godine razvio PCR, radio je u Emeryvilleu u Kaliforniji za Cetus Corporation, ranu biotehnološku tvrtku. Tamo je bio odgovoran za sintezu kratkih lanaca DNK. Mullis je napisao da je ideju o PCR-u zamislio dok se jedne noći u svom automobilu vozio autocestom Pacific Coast. Gubio se u svom umu novi put analiza promjena (mutacija) u DNK kada je shvatio da je umjesto toga izumio metodu za povećanje broja kopija bilo kojeg dijela DNK kroz ponovljene cikluse duplikacije koju pokreće DNK polimeraza. U časopisu Scientific American, Mullis je sažeo proceduru: “Počevši od jedne molekule DNK genetskog materijala, PCR može generirati 100 milijardi takvih molekula u jednom danu. Ovu reakciju je lako izvesti. Ne zahtijeva više od epruvete, nekoliko jednostavnih reagensa i izvora topline." Bio je nagrađen Nobelova nagrada doktorirao kemiju 1993. za svoj izum, sedam godina nakon što su on i njegovi kolege iz Cetusa prvi put proveli njegov prijedlog u praksi. Međutim, ostale su neke kontroverze o intelektualnom i praktičnom doprinosu drugih znanstvenika Mullisovom radu, te je li on bio jedini izumitelj PCR principa.

Metoda PCR oslanja se na upotrebu odgovarajuće DNA polimeraze koja može izdržati visoke temperature >90°C (194°F) potrebne za cijepanje dvaju DNA lanaca u dvostrukoj spirali DNA nakon svakog ciklusa replikacije. DNA polimeraze koje su se izvorno koristile za in vitro pokuse, nagovještavajući PCR, nisu mogle izdržati tako visoke temperature. Stoga su rani postupci replikacije DNA bili vrlo neučinkoviti i dugotrajni, zahtijevajući velike količine DNA polimeraze i kontinuiranu obradu tijekom cijelog procesa.

Otkriće 1976. Taq polimeraze, DNA polimeraze izolirane iz termofilne bakterije, Termusaquaticus, koji prirodno živi u vrućim (50 do 80°C (122 do 176°F)) okruženjima kao što su topli izvori - otvorio je put za dramatično poboljšanje PCR metode. DNA polimeraza izolirana iz T.Aquaticus, stabilan je na visokim temperaturama i ostaje aktivan čak i nakon denaturacije DNA, čime se eliminira potreba za dodavanjem novih DNA polimeraza nakon svakog ciklusa. To je omogućilo automatizaciju procesa amplifikacije DNA na temelju termociklerskog pojačala.

Patentni ratovi

Predloženu PCR metodu patentirao je Cary Mullis i pripisao ju je Cetus Corporation, gdje je Mullis radio kada je izumio tehniku ​​1983. godine. Enzim Taq polimeraza također je zaštićen patentima. Bilo je nekoliko visokoprofilnih tužbi povezanih s ovom tehnikom, uključujući neuspješnu tužbu koju je pokrenuo DuPont. Farmaceutska tvrtka Hoffmann-La Roche stekao je prava na patente 1992. godine i trenutno drži one koji su još uvijek zaštićeni.

Slična bitka za patent oko enzima Taq polimeraze još uvijek je u tijeku u nekim jurisdikcijama diljem svijeta između Rochea i Promege. Pravni argumenti nadilaze uvjete originalnih patenata za PCR i Taq polimerazu, koji su istekli 28. ožujka 2005.

Udio: