Проява на реакцията на аглутинация е. Реакция на аглутинация (РА), механизъм и методи на поставяне. Съставки и как да ги получите. Използването на RA в диагностиката на инфекциозни заболявания. Възможни видове аглутинация при определяне на кръвната група
Реакцията на аглутинация се основава на специфичното взаимодействие на антитела (аглутинини) с цели микробни или други клетки. В резултат на това взаимодействие се образуват частици-агломерати, които се утаяват (аглутинират). Бактерии, протозои, гъбички, дрожди, рикетсии, еритроцити и други клетки, както живи, така и убити, могат да участват в реакцията на аглутинация. Реакцията протича в две фази: първата е специфичната комбинация от антиген и антитяло, втората е неспецифична, т.е. образуването на видим аглутинат. Утаяването на аглутинат се получава в присъствието на електролити, като натриев хлорид. Микроорганизмите в аглутината остават живи, но губят своята подвижност.
Реакцията на аглутинация се използва широко за серологична диагностика. инфекциозни заболяванияи определяне на антигенната структура на изолирани микроби. За установяване на антигенната структура на патоген, изолиран от тялото на пациент или носител, се използва специфичен имунен серум, получен чрез имунизиране на животни (заек, магаре, овен) с определени микроорганизми. Идентифицирането на микроба се извършва в реакцията на аглутинация върху стъкло с адсорбирани или монорецепторни серуми или в епруветки със специфични аглутиниращи серуми. Адсорбираните серуми съдържат антитела само към антигени, специфични за даден микроб, а монорецепторните серуми съдържат антитела само към един специфичен антиген на патогена.
Видовите серуми съдържат антитела към всички антигени на определен микроб.
Принадлежността на изолираната култура на микроорганизма към този видсе определя чрез аглутинация с известен серум до титъра на антитялото, посочен върху етикета на серумната ампула. Титърът на серумните антитела се счита за последното му разреждане, при което все още се наблюдава аглутинация на културата от микроби, използвани за имунизиране на животното. Адсорбираните и монорецепторните серуми обикновено се използват неразредени в реакцията на аглутинация върху стъкло.
При определяне на наличието на антитела в кръвния серум на пациента, той се разрежда с изотоничен разтвор на натриев хлорид, като се започне от разреждане от 1: 50 до 1: 800 или повече. Към всяко разреждане се добавя суспензия от живи или убити микроби. Препарати, съдържащи микроби, убити чрез топлина или формалин, се наричат диагностикуми. Диагностикумите, получени чрез нагряване на култури от микроорганизми, съдържат само соматични антигени. Когато се използва само формалин, флагеларните антигени също се запазват в микробите.
При наличие на антитела в кръвта на пациента диагностикумът, взет при реакцията, се слепва и се образува утайка (аглутинат) в две епруветки. В този случай резултатите от реакцията на аглутинация се считат за положителни. В контролната епруветка, където се добавят изотоничен разтвор на натриев хлорид и диагностикум, суспензията от микроби трябва да бъде хомогенна (отрицателна реакция на аглутинация).
Отчитането на резултатите от реакцията на аглутинация при някои заболявания, като лептоспироза, се извършва само микроскопски в тъмното зрително поле на микроскопа (микроаглутинация). Серологичната диагноза на заболяването се основава на диагностично заболяване. Обикновено съответства на серумно разреждане 1:100 или 1:200.
Антителата в кръвния серум на пациента с помощта на реакцията на аглутинация могат да бъдат открити в случаи на коремен тиф и паратиф (реакция на Видал), бруцелоза (реакция на Райт), туларемия и др.
Реакция на Кастелани. При някои инфекциозни заболявания или имунизация с микроорганизми, които имат в състава си групови антигени, в допълнение към специфичните антитела за този тип в кръвния серум се появяват и групови антитела. В този случай свързани бактериални видове ще бъдат аглутинирани от получените серуми.
Кастелани предложи метод за адсорбция на групови антитела от имунни серуми, основан на отстраняването им с помощта на микроорганизми от сродни видове, които имат групови антигени, но нямат специфични. Културата на такива микроорганизми, добавена към серума, адсорбира неспецифични групови антитела и след отстраняване на комплекса антиген-антитяло чрез центрофугиране в серума остават само специфични имуноглобулини. Серумите, третирани по метода на Кастелани, могат да се използват в реакцията на аглутинация като високо специфични.
имунни реакции. Използване на имунните отговори при диагностицирането на инфекциозни заболявания.
ПЛАН:
Видове имунни реакции.
Условия за провеждане на серологични реакции.
Серумни изисквания.
Концепцията за положителни и отрицателни резултати.
ГЛАВНО СЪДЪРЖАНИЕ:
Видове имунни реакции.
Имунологична реакция – това е взаимодействието на антиген с антитяло, което се определя от специфичното взаимодействие на активните центрове на антитялото (паратоп) с антигенни епитопи.
Обща класификация имунологични реакции:
серологични реакции – реакции между антигени (Ag) и антитела (Ig)
инвитро ;
клетъчни реакции с участието на имунокомпетентни клетки;
алергични тестове - откриване на свръхчувствителност.
Серологични реакции: 1) определение, 2) фази, 3) поставяне на цели, 4) обща класификация.
1) Определение
Серологични методиизследване (от лат. Serum - серум и logos - обучение), използвайки реакция антиген-антитяло.
2) Фази
2 фази на взаимодействие:
аз специфичен (видим) - идва бързо, антителата се комбинират със съответните им антигени. В тази фаза взаимодействат детерминантни групи антигени (AG) и активни центрове на антитела (AT).
Силите, участващи във формирането на комплекса AG + AT, са:
Кулон;
Ван дер Ваалс
Водородни връзки.
В тази фаза няма видими промени. Под електронна микроскопия комплексът AG + AT под формата на решетка.
II. Неспецифични - протича бавно, образуваният комплекс антиген-антитяло реагира с допълнителен неспецифичен фактор от средата, в която протича реакцията и това се вижда с окото - слепване, разтваряне, утаяване на люспи и др. електролит, зарядът намалява, разтворимостта намалява, видимите конгломерати се образуват утаени (аглутинират).
3) Поставяне на цели :
а) за идентифициране на антигена (серум с известно антитяло):
серологична идентификация (видова идентификация);
серотипиране (определяне на серовар) - определяне на щам;
в патологичен материал (експресна диагностика);
в чиста култура:
б) за откриване на антитела (Ig) (известен антиген-diagnosticum):
присъствие (качествени реакции);
количество (увеличаване на титъра - методът на "сдвоените серуми").
4) Обща класификация серологични реакции :
а) прост (2-компонентен: Ag + Ig):
РА реакции на аглутинация (с корпускуларен антиген);
RP реакции на утаяване (с разтворим антиген);
б) комплекс (3-компонентен: Ag + Ig + C);
в) с помощта на етикет.
Варианти на реакцията на аглутинация и утаяване
Реакция на аглутинация :
Реакцията на аглутинация (RA) е имунна реакция на взаимодействието на суспензия от AG (еритроцити, бактерии) с AT във физиологичен разтвор.
По време на аглутинацията AT частиците се слепват заедно с образуването на флокулентна утайка.
Реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA) е вид реакция на аглутинация, при която се използва антитяло или антигенен еритроцитен диагностикум (еритроцити с адсорбирана на повърхността им АТ или АГ).
Еритроцитите в тази реакция действат като пасивни носители.
Оценката на резултатите от RPGA се извършва, както следва:
- при положителна реакция пасивно залепени еритроцити покриват дъното на U- или V-образния отвор с равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“);
- при обратна реакция (липса на аглутинация), еритроцитите се натрупват в централната вдлъбнатина на дупката, образувайки компактен "копче" с рязко очертани ръбове.
Тестът за инхибиране на хемаглутинацията (HITA) се използва при диагностицирането на вирусни инфекции. Някои вируси съдържат протеина хемаглутинин на повърхността си, който слепва червените кръвни клетки. Добавянето на специфични антивирусни антитела блокира вирусния хемаглутинин – няма хемаглутинация.
Реакцията на непряка хемаглутинация (RIHA) или реакцията на Coombs се използва за определяне на непълни антитела. Добавянето на антиглобулинов серум (AT срещу човешки Ig) подобрява резултатите от реакцията. RNGA се използва за определяне на Rh фактора.
За да се създаде реакция на аглутинация (RA), са необходими три компонента:
1) антиген (аглутиноген) AG;
2) антитяло(аглутинин) AT;
3)
електролит
(изотоничен разтвор на натриев хлорид).
Ag + AT + електролит = аглутинат
Аглутинация (от лат. agglutinatio - слепване) - слепване на телца (бактерии, еритроцити и др.) с антитела в присъствието на електролити - натриев хлорид.
RA се проявява под формата на люспи или утайка, състояща се от корпускули (например бактерии, еритроцити), "залепени" от антитела.
RA се използва за:
Реакция на директна аглутинация на микроби (RA).
При тази реакция антителата (аглутинини) директно аглутинират корпускулните антигени (аглутиногени).
Обикновено те са представени от суспензия от инактивирани микроорганизми (реакция на микробна аглутинация).
използва се за определяне на вида на микроорганизмастандартна диагностична аглутинация серум (известен А.Т ).
Най-често срещаните са ламеларен (показателен) и разгърнат РА.
Ламелният РА се поставя върху стъкло. Използва се като ускорен метод за откриване на антитела или идентифициране на микроорганизми.
Компоненти:
1. стандартни диагностични аглутиниращи серуми (АТ);
2. изследване на чиста култура от пациента;
3. физиологичен разтвор.
В изследваната чиста култура антигените (АГ) са под формата на частици (микробни клетки, еритроцити и други корпускулни антигени), които се слепват от антитела и се утаяват.
Пример:
постановка показателен реакции на аглутинация (RA ) на стъкло за да се идентифицират бактериите от чревната група.
Капки се нанасят върху предметно стъкло:
1
дизентерия
;
2
-та капка: - аглутиниращ серум към патогениКоремен тиф
;
(1-2 диагностични серума)
3
-изпускам:- физиологичен разтвор(контрол).
Към всяка капка се добавя изследваната чиста бактериална култура. Разбъркайте.
Резултат
:
положителен
- наличие на аглутинирани люспи,
отрицателен
- без аглутинирани люспи
Заключение:Изследваните бактерии са причинители на коремен тиф (определени са антигени).
За определяне на антитела в серума на пациента (серологична диагноза), стандартен микробендиагностикум съдържащи суспензияизвестен микроби или техни антигениАГ .
Определяне на кръвни групи по системата ABO (реакция на хемаглутинация (RHA)) - аглутинират еритроцитите.
Компоненти на реакцията:
1. AG (червени кръвни клетки) кръвен тест
2. AT (еритротести - цоликлони)
Золиклон комплект:
Реагент Цоликлон анти-А (розов)
Реагент Tsoliklon anti-B (син)
Zoliclone anti-AB реагент (безцветен)
3. електролит (физиологичен разтвор)
Техника на дефиниране:
1
.
В ямките на таблетката се накапва по една капка (0,1 ml) анти-А, анти-В и анти-АВ цоликлон (за контрол).
2.
До всяка капка от реактива се поставя малка (0,05-0,01 ml) капка от тестовата кръв.
След това капка цоликлон се смесва с капка кръв с индивидуална чиста стъклена пръчка.
3.
Реакцията на аглутинация се развива през първите 3-5 секунди, когато плаката се разклати леко.
Резултатите от реакцията се отчитат 2,5 - 3 минути след смесване на капките. Отляво надясно в анти-А, анти-В, анти-АВ ямките.
Положителен резултат е появата на гранулирана утайка (аглутинат).
положителен RA (+)
Отрицателен - без утайка.
отрицателен RA(-)
4.
Анализ на резултатите.
О(аз) α β – няма аглутинация
А(II) β – аглутинация с анти-А
б(III) α – аглутинация с анти-В
AB(IV)О - аглутинация с анти-А, с анти-В
Схематично представяне на аглутинацията.
АХ антигени върху еритроцитите (открити) + антитялоAT(цоликлон) диагностичен серум
Отчитане на аглутинацията в плочи
Реакция на утаяване:
Реакцията на утаяване е имунна реакция на взаимодействието на AG в разтворимо състояние с AT във физиологичен разтвор.
По време на утаяването се образува макромолекулен имунен комплекс, който се проявява чрез прехода на прозрачен колоиден разтвор в непрозрачна суспензия или утайка.
Количеството на двата реагента трябва да бъде в строго определени съотношения, тъй като излишъкът на един от тях намалява резултата.
Съществуват различни начининастройка на реакцията на утаяване.
1. Реакцията на пръстеновидно утаяване се поставя в утаителни епруветки с малък диаметър. Към епруветката се добавя имунен серум и разтворимият антиген внимателно се наслоява. AG и AT се смесват поради термичното движение на молекулите и те взаимодействат. При положителен резултат на границата на двата разтвора се образува пръстен от непрозрачна утайка.
2. Реакцията на двойна имунодифузия на Ouchterlony се провежда в агар гел, в ямките на който се добавя или AG разтвор, или AT разтвор съгласно схемата. AG и AT дифундират в гела един към друг и, ако реакцията е положителна, образуват имунни комплекси, видими като преципитационни линии.
Реакция на утаяване -тази формацияи утаяване на комплекса от разтворим молекулен антиген с антитела под формата на мътност, наречена утайка. Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества.
RA компоненти:
преципитиращ серум (известен като АТ-преципитин);
тестов серум (неизвестен AG-преципитоген);
физически Решение.
Реакцията на утаяване се поставя или в специални тесни епруветки (реакция на утаяване с пръстен), или в панички на Петри в гелове, хранителни средии т.н.
Реакция на пръстеновидно утаяване
Отчитане и отчитане на резултатите от реакциятапръстеновидни валежиза откриване на патоген антракс(реакция на Асколи).
постановка .
1. Тестовият материал (кожа, вълна, филц, четина, плат, месо, пръст, животински изпражнения и др.) се вари във физиологичен разтвор за 5-45 минути. за получаване на изотоничен екстракт (екстракт). Филтър.
2. Изсипете утаения серум против антракс в епруветката.
3. Внимателно наслоете тестовия материал (екстракт) върху него.
Счетоводство .
В рамките на следващите 10 мин. на границата между серума и екстракта, в положителни случаи се появява пръстен на мътност (пръстенообразна преципитация). Реакцията на Асколи е много чувствителна и специфична
С негова помощ е възможно бързо да се идентифицират заразени с антракс материали.
Реакция на утаяване в агар
Отчитане и отчитане на резултатитереакции на утаяване на агарза определяне на токсигенността на коринебактериите (причинители на дифтерия)
постановка
Поставя се върху фосфатно-пептонен агар в петриево блюдо.
1. Лента от стерилна филтърна хартия, навлажнена сантитоксичен серум.
2. След изсушаване на разстояние 1 cm от ръба на лентата се засяват плаки с диаметър 10 mmизолирани култури.
В една чаша можете да засеете от 3 до 10 култури, една от които,контрол, трябва да се знаетоксигенен.
Културите се поставят в термостат.
Счетоводство
Анализът се извършва след 24-48-72 часа.
Положителен резултат - (културатоксигенен) - на известно разстояние от лентата хартия възникватпреципитатни линии, « пипала стрели”, които са ясно видими на пропускаща светлина.
Фигурата показва реакцията на утаяване в агар за определяне на токсигенността на дифтерийните бацили. Средните култури не са образували "стрели-антени", това не са токсикогенни патогени.
Щамовете на причинителя на дифтерия могат да бъдат токсигенни (произвеждащи екзотоксин) и нетоксигенни. Образуването на екзотоксин зависи от наличието в бактериите на профаг, носещ гена tox, кодиращ образуването на екзотоксин.
В случай на заболяване всички дифтерийни патогени се изследват за токсигенност - производството на дифтериен екзотоксин чрез реакция на утаяване в агар
Комплексни серологични реакции ( 3-компонентен: Ag + Ig + C):
Реакция на свързване на комплемента (RSC).
Реакцията се провежда на два етапа.
На първия етап антителата взаимодействат с AG и комплемента, на втория етап се добавя индикатор - хемолитичната система (смес от еритроцити и антиеритроцитен серум).
При положителен резултат на първия етап AT образува имунен комплекс с AG, който свързва комплемента на реакционната смес.
В този случай добавените на втория етап еритроцити на хемолитичната система не се разрушават.
В противен случай несвързаният комплемент причинява лизис на индикаторните червени кръвни клетки.
Необходими са пет съставки: АГ, АТ и комплемент (първа система), еритроцити от коч и хемолитичен серум (втора система) (фиг. 1).
Реакцията протича в две фази (фиг. 3).
Първа фаза - взаимодействието на антиген и антитела със задължителното участие на комплемента.
Второ - идентифициране на резултатите от реакцията с помощта на индикаторна хемолитична система (овчи еритроцити и хемолитичен серум). Разрушаването на еритроцитите от хемолитичен серум се случва само в случай на прикрепване на комплемента към хемолитичната система. Ако комплементът е бил адсорбиран по-рано върху комплекса антиген-антитяло, тогава не настъпва хемолиза на еритроцитите (фиг.).
Резултатът от опита
оценете (фиг. 2), като отбележите наличието или отсъствието на хемолиза във всички тръби. Реакцията се счита за положителна при пълно забавяне на хемолизата, когато течността в епруветката е безцветна и еритроцитите се утаяват на дъното, отрицателна - при пълен лизис на еритроцитите, когато течността е интензивно оцветена ("лакова" кръв) .
Степента на забавяне на хемолизата се оценява в зависимост от интензитета на цвета на течността и количеството еритроцитна утайка на дъното (++++, +++, ++, +).
Ориз. 4. Становище и резултат от RSC.
Заключение:В изследвания серум са открити антитела.
RSK ви позволява да откриете антитела към всеки щам от същия вирусен серотип.
Диагностичната стойност е:
четирикратно увеличение на титъра на антителата в сдвоени серуми (по време на грипна епидемия);
двукратно увеличение на кръвния серум при пациенти с характерна клинична картина.
Етикетни реакции :
Тези методи са много чувствителни. Багрила, радиоактивни изотопи, ензими и др. се използват като етикети за антигени или антитела.
RIF - реакция на имунофлуоресценция
Имунофлуоресцентната реакция се основава на светлинната индикация на комплекса антиген-антитяло
Свързан имуносорбентен анализ.
Съвременен лабораторни изследвания, при което се търсят специфични антитела в кръвта или антигени за конкретни заболявания, за да се установи не само етиологията, но и стадият на заболяването.
Резултатите от ELISA могат да бъдат издадени качествено и количествено.
В момента ELISA се използва в следните ситуации:
1) търсене на специфични антитела към всяко инфекциозно заболяване;
2) търсене на антигени на всякакви заболявания (инфекциозни, венерически болести);
3) изследване на хормоналния статус на пациента;
4) изследване за туморни маркери;
5) изследване за наличие на автоимунни заболявания.
На фигурата, твърдофазен ELISA - познатите антигени (вляво) са адсорбирани върху ямките на плаката, (вдясно) върху ямките на плаката са известни антитела
Предимства на метода ELISA:
1) Висока специфичност и чувствителност на метода ELISA (повече от 90%).
2) Възможността за определяне на заболяването и проследяване на динамиката на процеса, т.е. сравняване на количеството антитела в различни интервали от време.
3) Наличие на ELISA диагностика във всяка медицинска институция.
Относителен дефицит: Откриване на имунен отговор (антитела), но не и самия патоген, конюгиран с ензимен етикет.
Настройка на ELISA (общ механизъм):
база ензимен имуноанализпредставлява имунна реакция на антиген и антитяло с образуването на имунен комплекс: антиген-антитяло, което води до промяна в ензимната активност на специфични етикети на повърхността на антителата.
Компоненти на реакцията:
1. AG(AT) известен - върху кладенеца на табличката.
2. AT (AG) е разследван.
3. AT с ензим, специфичен за комплекса AT(AG)-AG(AT).
4. хромогенен субстрат, взаимодействащ с ензима
5. стоп разтвор
Основните етапи на ELISA
1. На повърхността на ямките на таблетката има пречистен антиген на специфичен патоген. Към тях се добавя биологичният материал на пациента, възниква специфична реакция между този антиген и желаното антитяло (имуноглобулин). Образува се комплекс.
2. Добавя се конюгат - АТ с ензим. Конюгантът е специфичен за AT-AG комплекса от първия етап. Ензимът се активира.
3. Добавя се субстрат и активен ензимвзаимодейства с него, променяйки безцветния цвят на разтвора.
4. Добавя се стоп разтвор, за да се спре взаимодействието ензим-субстрат.
Счетоводство.
Положителен резултат - промянацветове, показани в жълто.
Имунохроматографски анализ
Методът на имунохроматографския анализ (ICA, бързи тестове) е предварителен метод за качествен скрининг, който ви позволява бързо, в рамките на няколко минути, да анализирате при всякакви условия, вкл. "поле".
Ползите от ICA включват:
Бързина и лекота на използване;
Малки обеми на пробите, без подготовка на пробите;
Евтиност за производителя и потребителя;
Възможност за производство на тестове в големи обеми;
Лесно разчитане и тълкуване на резултата;
Висока чувствителност и възпроизводимост;
Възможност количествено определяне;
Възможност за използване на преносими четци, съвместими с компютър;
Възможност за мултианализ.
Компоненти (приложени към тест лентата):
1. Конюгат, маркиран с колоидно злато - специфичен за определения АГ.
2. AT на тестовата линия - специфичен за комплекса AT-AG
3. Абс на контролната линия са специфични за конюгата.
IHA настройка:
1. Нанасяне на пробата върху определената начална зона на лентата.
2. Получаване на резултат под формата на появата на цветни ленти на мястото на тестовите и контролните линии.
Счетоводство
Положително - при оцветяване на тестовата линия.
Отрицателен - при липса на оцветяване на тестовата линия.
Невалиден - при липса на оцветяване на контролната линия.
Общ механизъм на IHA:
1. Пробата се поставя върху изходното поле (подложка за проби) и се свързва с конюгата (специфично тяло с цветна маркировка), разположено върху подложката за конюгат. В резултат на това се образува оцветен комплекс.
2. Полученият цветен имунен комплекс се движи под действието на капилярни сили по нитроцелулозната мембранаи взаимодействас AT тестова линия.Резултатът е едноцветна розово-червена ивица.
3. Коремните мускули не са свързани с тестовата лента (конюгат)се придвижва и достига контролната линия, свързва се с АТ на контролната линия.В резултат на това се появява втора цветна лента.Ако анализът е извършен правилно, контролната линия трябва винаги да се появява, независимо от наличието на изследвания антиген (антитела) в пробата от биологична течност.
2. Условия за провеждане на серологични реакции.
1. Наличие на хомоложни - съответстващи един на друг антиген и антитяло.
2. Чисти, сухи съдове.
3. Определено съотношение на лекарствата (най-често равно).
4. Задължително наличие на електролит (изотоничен разтвор на NaCl).
5. pH неутрално или близко до леко алкално.
6. Температура + 37 ° С или стайна температура (задължително положителна).
7. Провежда се антигенен контрол и серум (антитела).
3 Серумни изисквания
Серумът трябва да е напълно бистър, без никакви примеси на клетки.
Обикновено се получава на 2-ра седмица от заболяването, когато вече има антитела.
Кръвта се взема в количество от 3-5 ml на празен стомах или 6 часа след хранене.
За да се получи серум, кръвта се оставя за 1 час при стайна температура или се центрофугира. Серумът се изсмуква много внимателно, за да не се уловят образуваните елементи.
Имунните серуми се получават от кръвта на хора или животни (най-често зайци и коне), имунизирани по определена схема със съответния антиген (ваксина). Суроватката обикновено се приготвя в производството.
4. Концепцията за положителни и отрицателни резултати.
RA.
При положителна реакция пасивно залепените еритроцити покриват дъното на ямката с равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“); при липса на аглутинация, еритроцитите се натрупват в централната вдлъбнатина на ямката, образувайки компактен „копче“ с рязко очертани ръбове (виж фигурите по-горе).
RP.
При положителен резултат на границата на двата разтвора се образува млечен пръстен (виж фигурите по-горе).
ELISA.
При положителна реакция настъпва промяна в цвета на разтвора.
RSK.
Забавяне на хемолизата - реакцията е положителна; ако комплементът е свободен се наблюдава хемолиза – реакцията е отрицателна(вижте снимките по-горе).
Резултати от реакцията на Васерман:
а - пълно забавяне на хемолизата (+ + ++);
b - изразено забавяне на хемолизата (+ ++);
c - частично забавяне на хемолизата (++);
d - слабо забавяне на хемолизата (+);
д - пълна хемолиза (-).
Реакцията е положителна с частично, изразено и пълно забавяне на хемолизата, което се определя от степента на оцветяване на съдържанието на епруветките от светло розово до ярко червено, нехемолизираните еритроцити впоследствие образуват червена утайка.
1. Проучете материала
Направете 3 бележки към видеото
13.1. Реакции антиген-антитяло и тяхното приложение
Когато се инжектира антиген, в тялото се образуват антитела. Антителата са комплементарни на антигена, причинил техния синтез, и могат да се свързват с него. Свързването на антигени с антитела се състои от две фази. Първата фаза е специфична, при която има бързо свързване на антигенната детерминанта към активния център на Fab фрагмента на антителата. Трябва да се отбележи, че свързването се дължи на ван дер Ваалсови сили, водородни и хидрофобни взаимодействия. Силата на връзката се определя от степента на пространствено съответствие активен центърантитяло и антигенен епитоп. След специфичната фаза започва по-бавна - неспецифична, която се проявява с видим физичен феномен (например образуване на люспи при аглутинация и др.).
Имунните реакции са взаимодействия между антитела и антигени и тези реакции са специфични и силно чувствителни. Те се използват широко в медицинска практика. С помощта на имунните реакции могат да се решат следните задачи:
Определяне на неизвестни антитела чрез известни антигени (антигенен диагностикум). Такава задача е, когато е необходимо да се определят антитела срещу патогена в кръвния серум на пациента (серодиагностика). Намирането на антитела ви позволява да потвърдите диагнозата;
Определяне на неизвестни антигени чрез известни антитела (диагностичен серум). Това изследване се провежда при идентифициране на културата на патогена, изолиран от материала на пациента (серотипиране), както и при откриване
антигени на микроби и техните токсини в кръвта и други биологични течности. Има много видове имунни реакции, които се различават по техниката на настройка и регистрирания ефект. Това са реакции на аглутинация (RA), утаяване (RP), реакции с участието на комплемент (RCC), реакции с използване на белязани компоненти (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Реакция на аглутинация
Реакцията на аглутинация (RA) е имунна реакция на взаимодействие на антиген с антитела в присъствието на електролити, като антигенът е в корпускуларно състояние (еритроцити, бактерии, латексни частици с адсорбирани антигени). По време на аглутинацията корпускулните антигени се залепват заедно с антитела, което се проявява чрез образуване на флокулентна утайка. Образуването на люспи се дължи на факта, че антителата имат два активни центъра, а антигените са поливалентни, т.е. имат множество антигенни детерминанти. RA се използва за идентифициране на патогена, изолиран от материала на пациента, както и за откриване на антитела срещу патогена в кръвния серум на пациента (например реакциите на Райт и Хъдълсън при бруцелоза, реакцията на Видал при Коремен тифи паратиф).
Най-лесният начин за настройка на RA е реакция върху стъкло, това е приблизителна RA, която се използва за определяне на патогена, изолиран от пациента. При определяне на реакцията върху предметно стъкло се прилага диагностичен аглутиниращ серум (в разреждане 1:10 или 1:20), след което се въвежда култура от пациента. Реакцията е положителна, ако в капката се появи флокулентна утайка. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Ако диагностичният аглутиниращ серум е неадсорбиран 1, тогава той се разрежда (до титъра - разреждането, до което трябва да настъпи аглутинация), т.е. поставете разширения RA в епруветки с увеличаване
1 Неадсорбираният аглутиниращ серум може да аглутинира свързани бактерии, които имат общи (кръстосано реагиращи) антигени. Затова се наслаждавайтеадсорбирани аглутиниращи серуми, от които кръстосано реактивните антитела са били отстранени чрез адсорбция от техните сродни бактерии. В такива серуми остават антитела, специфични само за тази бактерия.
разреждания на аглутиниращ серум, към който се добавят 2-3 капки суспензия на изолирания от пациента патоген. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността в епруветките. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. Реакцията се придружава от контроли: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.
За да се определят антителата срещу патогена в кръвния серум на пациента, се използва разширен RA. Когато се постави в епруветки, кръвният серум на пациента се разрежда и към епруветките се добавя равно количество суспензия на диагностикум (суспензия от убити микроби). След инкубацията се определя най-високото серумно разреждане, при което е настъпила аглутинация, т.е. образува се утайка (серумен титър). В този случай реакцията на аглутинация с O-diagnosticum (бактерии, убити чрез нагряване, запазващи термостабилен O-антиген) се проявява под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.
Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация(RNGA или RPGA) е вид RA. Този метод е много чувствителен. С помощта на RNGA могат да се решат две задачи: да се определят антителата в кръвния серум на пациента, към който се добавя антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити, върху които са адсорбирани известни антигени; определяне на наличието на антигени в тестовия материал. В този случай реакцията понякога се нарича обратна реакция. индиректна хемаглутинация(РОНГА). При стадиране към изследвания материал се добавя антитяло еритроцитен диагностикум (еритроцити с адсорбирани на повърхността им антитела). Еритроцитите в тази реакция действат като носители и участват пасивно в образуването на имунни агрегати. При положителна реакция пасивно залепените еритроцити покриват дъното на ямката с равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“); при липса на аглутинация, еритроцитите се натрупват в централната вдлъбнатина на отвора, образувайки компактен "бутон" с рязко дефинирани ръбове.
Реакция на коаглутинацияизползвани за откриване на патогенни клетки (антигени), като се използват антитела, адсорбирани върху Стафилококус ауреус,съдържащ протеин А. Протеин А има афинитет към Fc фрагмента на имуноглобулините. Поради това антителата се свързват със стафилококи индиректно чрез Fc фрагмента, а Fab фрагментите са ориентирани навън и могат да взаимодействат със съответните микроби, изолирани от пациенти. В този случай се образуват люспи.
Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HITA)използвани при диагностицирането на вирусни инфекции и само инфекции, причинени от хемаглутиниращи вируси. Тези вируси съдържат на повърхността си протеин - хемаглутинин, който е отговорен за реакцията на хемаглутинация (RHA) при добавяне към еритроцитни вируси. RTGA се състои в блокиране на вирусни антигени с антитела, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки.
Реакция на Кумбс - RA за откриване на непълни антитела. При някои инфекциозни заболявания, например бруцелоза, кръвният серум на пациента циркулира непълни антителакъм възбудителя. Непълните антитела се наричат блокиращи, защото имат едно антиген-свързващо място, а не две, както пълните антитела. Следователно, когато се добави антигенен диагностикум, непълните антитела се свързват с антигените, но не ги слепват. За проява на реакцията се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което ще доведе до аглутинация на имунни комплекси (антигенен диагностикум + непълни антитела), образувани в първия етап на реакцията.
Индиректната реакция на Coombs се използва при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват непълни моновалентни антирезус антитела. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Следователно към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум, което предизвиква аглутинация на еритроцитите. Реакцията на Кумбс се използва за диагностициране патологични състояниясвързани с интраваскуларен лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новороденото поради резус конфликт.
РА за определяне на кръвни груписе основава на аглутинация на еритроцити от антитела на имунния серум към антигени на кръвни групи A (II), B (III). Контролата е серум, който не съдържа антитела, т.е. серум AB (IV) кръвни групи и антигени на еритроцити от групи A (P) и B (III). Еритроцитите от група 0(I) се използват като отрицателна контрола, тъй като те нямат антигени.
За определяне на Rh фактора се използват анти-Rh серуми (поне две различни серии). При наличие на Rh антиген върху мембраната на изследваните еритроцити настъпва аглутинация на тези клетки.
13.3. реакция на утаяване
RP е имунна реакция на взаимодействие на антитела с антигени в присъствието на електролити, а антигенът е в разтворимо състояние. По време на утаяването разтворимите антигени се утаяват от антитела, което се проявява чрез мътност под формата на преципитационни ленти. Образуването на видима утайка се наблюдава, когато двата реагента се смесват в еквивалентни съотношения. Излишъкът на един от тях намалява количеството на утаените имунни комплекси. Има различни начини за създаване на реакция на утаяване.
Реакция на пръстеновидно утаяванепоставени в утаителни тръби с малък диаметър. Имунният серум се добавя към епруветката и разтворимият антиген се наслоява внимателно. При положителен резултат на границата на двата разтвора се образува млечен пръстен. Реакцията на пръстеновидно утаяване, която определя наличието на антигени в органи и тъкани, екстрактите от които се варят и филтрират, се нарича реакция на термопреципитация (реакция на Асколи за определяне на термостабилен антраксен антиген).
Реакция на двойна имунодифузия на Ouchterlony.Тази реакция се провежда върху агар гел. Ямките се изрязват в слой гел с еднаква дебелина на определено разстояние един от друг и се пълнят съответно с антиген и имунен серум. След това антигените и антителата дифундират в гела, срещат се и образуват имунни комплекси, които се утаяват в гела и стават видими като линии на утаяване.
хранене. Тази реакция може да се използва за откриване на неизвестни антигени или антитела, както и за проверка на сходството между различни антигени: ако антигените са идентични, линиите на утаяване се сливат; ако антигените не са идентични, линиите на утаяване се пресичат; ако антигените са частично идентични, образува се шпора.
Реакция на радиална имунодифузия.Антителата се добавят към разтопения агар гел и гелът се нанася на равномерен слой върху предметното стъкло. В гела се изрязват ямки и в тях се въвежда стандартен обем антигенни разтвори с различни концентрации. По време на инкубацията антигените дифундират радиално от ямката и при среща с антитела образуват преципитационен пръстен. Докато има излишък от антиген в ямката, има постепенно увеличаване на диаметъра на утаителния пръстен. Този метод се използва за определяне на антигени или антитела в тестовия разтвор (например за определяне на концентрацията на имуноглобулини различни класовев серум).
Имуноелектрофореза.Сместа от антигени се разделя предварително чрез електрофореза, след което се въвежда утаен антисерум в жлеба, минаващ по посока на движението на протеина. Антигените и антителата дифундират в гела един към друг; взаимодействайки, те образуват дъгообразни линии на валежите.
реакция на флокулация(според Ramon) - вид реакция на утаяване, която се използва за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид. Реакцията се провежда в епруветки. В епруветка, където токсоидът и антитоксинът са в еквивалентно съотношение, се наблюдава мътност.
13.4. Реакция на фиксиране на комплемента
Антителата, взаимодействайки със съответния антиген, свързват добавения комплемент (1-ва система). Индикаторът за фиксиране на комплемента са еритроцитите, сенсибилизирани от хемолитичен серум, т.е. антитела към еритроцитите (2-ра система). Ако допълнението не е фиксирано в 1-ва система, т.е. реакцията антиген-антитяло не настъпва, тогава сенсибилизираните червени кръвни клетки са напълно лизирани (отрицателна реакция). Когато комплементът се свързва с имунни комплекси на 1-ва система, след добавяне на сенсибилизирани еритроцити, хемолиза
отсъства (положителна реакция). Реакцията на свързване на комплемента се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания (гонорея, сифилис, грип и др.).
13.5. Реакция на неутрализация
Микробите и техните токсини имат увреждащ ефект върху органите и тъканите на човешкото тяло. Антителата са способни да се свързват с тези увреждащи агенти и да ги блокират, т.е. неутрализирам. Тази функция на антителата се основава диагностична реакциянеутрализиране. Извършва се чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). Например, за откриване на токсини в материала на пациента, животните от 1-ва група се инжектират с материала на пациента. Животните от 2-ра група се инжектират с подобен материал, предварително обработен със съответния антисерум. Животните от 1-ва група умират при наличие на токсин в материала. Втората група животни оцеляват, увреждащият ефект на токсина не се проявява, тъй като се неутрализира.
13.6. Реакции с използване на маркирани антитела или антигени
13.6.1. Имунофлуоресцентна реакция (RIF, метод на Кунс)
Този метод се използва за експресна диагностика. Той може да открие както микробни антигени, така и антитела.
Директен RIF метод- имунна реакция на взаимодействие на антитела с антигени, като антителата са белязани с флуорохром - вещество, способно да излъчва светлинни кванти с определена дължина на вълната, когато бъде ударено от светлина с определена дължина на вълната. Особеността на настройката на този метод е необходимостта от отстраняване на нереагиралите компоненти, за да се изключи откриването на неспецифична луминесценция. За да направите това, извършете измиване на нереагирали антитела. Резултатите се оценяват с помощта на флуоресцентен микроскоп. Бактериите в цитонамазка, обработена с такъв луминисцентен серум, светят на тъмен фон по периферията на клетката.
Индиректен RIF методизползван повече от предишния. Тази реакция се провежда в два етапа. На първия етап антигените взаимно
взаимодействат със съответните антитела, образувайки имунни комплекси. Всички компоненти, които не са реагирали (т.е. не са част от имунните комплекси), трябва да бъдат отстранени чрез измиване. На втория етап образуваният комплекс антиген-антитяло се открива с помощта на флуорохромен антиглобулинов серум. В резултат на това се образува сложен микроб + антимикробни заешки антитела + антитела към заешки имуноглобулини, маркирани с флуорохром. Резултатите се оценяват с помощта на флуоресцентен микроскоп.
13.6.2. Имуноанализ или анализ
ELISA е най-често срещаният модерен методизползвани за диагностициране на вирусни, бактериални, протозойни инфекции, по-специално за диагностика на ХИВ инфекция, вирусен хепатити т.н.
Има много модификации на ELISA. Твърдофазовият неконкурентен ELISA е широко използван. Провежда се в 96-ямкови полистиренови плаки (твърда фаза). По време на реакцията е необходимо да се измият нереагиралите компоненти на всеки етап. При определяне на антитела, ямките, върху които са адсорбирани антигените, се пълнят с изследвания кръвен серум, след това с антиглобулинов серум, маркиран с ензима. Покажете реакцията, като добавите субстрат за ензима. В присъствието на ензима субстратът се променя и ензим-субстратният комплекс се избира по такъв начин, че продуктът, образуван в реакцията, да бъде оцветен. Така при положителна реакция се наблюдава промяна в цвета на разтвора. За да се определят антигените, твърдофазовият носител се сенсибилизира с антитела, след което последователно се въвеждат тестовият материал (антигени) и ензимно-белязан антигенен серум. За проявата на реакцията се въвежда субстрат за ензима. При положителна реакция настъпва промяна в цвета на разтвора.
13.6.3. Имуноблотинг
Този метод се основава на комбинация от електрофореза и ELISA. При провеждане на имуноблотинг (блотинг от англ. петно- петно) сложна смес от антигени първо се подлага на електрофореза в полиакриламиден гел. Полученият фракциониран анти-
генните пептиди се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана. След това петната се третират с ензимно белязани антитела към специфичния антиген, т.е. провеждане на ELISA блот. Имуноблотингът се използва при диагностицирането на инфекции като HIV.
13.6.4. Имунна електронна микроскопия
Методът се състои в микроскопиране в електронен микроскоп на вируси (по-рядко други микроби), предварително третирани с подходящ имунен серум, белязан с електронно-оптично плътни препарати, например феритин, желязосъдържащ протеин.
13.7. поточна цитометрия
Кръвните клетки се диференцират въз основа на лазерна цитофлуорометрия. За да направите това, желаните клетки се оцветяват с флуоресцентни моноклонални антитела срещу CD антигени. Кръвна проба след третиране с белязани антитела се прекарва през тънка тръбичка и през нея преминава лазерен лъч, който възбужда луминесценцията на флуорохрома. Интензитетът на флуоресценция корелира с плътността на антигените на клетъчната повърхност и може да бъде количествено определен с помощта на фотоумножител. Получените резултати се преобразуват в хистограма.
За определяне се използва поточна цитометрия имунен статус(съдържанието на основните популации от лимфоцити, съдържанието на вътреклетъчни и извънклетъчни цитокини, функционална дейност NK клетки, фагоцитозна активност и др.).
No 29 Реакция на аглутинация. Компоненти, механизъм, начини на настройка. Приложение.
Реакция на аглутинация- проста реакция, при която антителата се свързват с корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: разширена, приблизителна, непряка и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка (клетки, "залепени" от антитела, които имат два или повече антиген-свързващи центъра - фиг. 13.1) . RA се използва за:
1) откриване на антителав кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакции на Райт, Хеделсън), коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;
2) дефиниции на патогениизолиран от пациента;
3) определяне на кръвни групиизползване на моноклонални антитела срещу еритроцитни алоантигени.
За определяне на антителата на пациента поставете подробна реакция на аглутинация:диагностикум (суспензия от убити микроби) се добавя към разрежданията на кръвния серум на пациента и след няколко часа инкубация при 37 ° C се отбелязва най-високото разреждане на серума (серумен титър), при което е настъпила аглутинация, т.е. образува се утайка.
Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това са характеристиките на взаимодействието на диагностикуми (О- и Н-антигени) със специфични антитела. Реакцията на аглутинация с O-diagnosticum (бактерии, убити чрез нагряване, запазващи термостабилен O-антиген) протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо. Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете ориентировъчна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Приблизителна реакция се провежда върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум в разреждане 1:10 или 1:20 се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка със серум и микроби, се извършва подробна реакция на аглутинация в епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращ серум, към който се добавят 2-3 капки от суспензията на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.
Различни сродни бактерии могат да бъдат аглутинирани от същия диагностичен аглутиниращ серум, който
затруднява идентифицирането им. Затова се използват адсорбирани аглутиниращи серуми, от които
кръстосано реагиращи антитела чрез адсорбция към сродни им бактерии. Тези серуми съдържат антитела
специфични за тази бактерия.
Реакция на аглутинация
Аглутинация (лат. аглутинация- слепване) - слепване (свързване) на антиген-носещи корпускулярни частици (цели клетки, латексни частици и др.) с молекули на специфични антитела в присъствието на електролити, което завършва с образуването на люспи или утайка (аглутинат), видими за просто око. Естеството на утайката зависи от естеството на антигена: флагеларните бактерии дават утайка с големи люспи, флагеларни и безкапсулни - финозърнести, капсулни - нишковидни. Разграничете директната аглутинация, при която взаимодействието със специфични антитела директно включва собствени антигени на бактериална или друга клетка, като еритроцити; и индиректни или пасивни, при които бактериални клетки или еритроцити, или частици от латекс са носители не на собствените си, а на чужди антигени (или антитела), адсорбирани върху тях, за да открият антитела (или антигени), специфични за тях. Реакцията на аглутинация включва главно антитела, принадлежащи към класовете IgG и IgM. Протича в две фази: първо, има специфично взаимодействие на активния център на антителата с антигенната детерминанта, този етап може да възникне при липса на електролити и не е придружен от видими промениреагираща система. Вторият етап, образуването на аглутинат, изисква наличието на електролити, които намаляват електрическия заряд на комплексите антиген + антитяло и ускоряват процеса на тяхното слепване. Тази фаза завършва с образуването на аглутинат.
Реакциите за аглутинация се поставят върху стъклени или гладки картонени плочи или в стерилни епруветки за аглутинация. Аглутинационните тестове (директни и пасивни) обикновено се използват като ускорен метод за откриване на специфични антитела в серума на пациента (например при бруцелоза) или за серологична идентификацияпатоген. В последния случай обикновено се използват добре пречистени (адсорбирани) диагностични серуми, съдържащи само монорецепторни антитела или техния набор от различни антигени. Безспорното предимство на реакцията на аглутинация върху стъкло е простотата на нейната формулировка и факта, че отнема няколко минути или дори секунди, тъй като и двата компонента се използват в нея в концентрирана форма. Той обаче има само качествена стойност и е по-малко чувствителен от епруветката. Разширеният тест за аглутинация в епруветки дава по-точни резултати, тъй като ви позволява да определите количественото съдържание на антитела в серума (задайте неговия титър) и, ако е необходимо, да регистрирате факта на повишаване на титъра на антителата, което е диагностично стойност. За да се установи реакцията, серумът, разреден с 0,85% разтвор на NaCl по определен начин, и равен обем (обикновено 0,5 ml) суспензия от стандартен диагностикум (или тестова култура), съдържаща 1 милиард бактерии в 1 ml, се въвеждат в аглутинацията. тръби. Отчитането на резултатите от реакцията на аглутинация се извършва предварително след 2 часа инкубация на епруветките при температура 37 ° C и накрая след 20-24 часа според два признака: наличието и размера на утайката и степента на прозрачност на супернатанта. Оценяването се извършва по четирикратната система. Реакцията задължително се придружава от контрол на серум и антиген. В случаите, когато се използва подробен тест за аглутинация в епруветка за серологична идентификация на патогена, той има диагностична стойност, ако реакцията се оцени като положителна, когато диагностичният серум е разреден с най-малко половината от неговия титър.
Трябва да се има предвид, че при смесване на разтвори на хомоложни антигени и антитела не винаги се наблюдават видими прояви на реакцията на аглутинация. Валеж се образува само на някои оптимални съотношениядвата компонента на реакцията. Извън тези граници, при значителен излишък на антиген или антитела, не се наблюдава реакция. Това явление се нарича "прозонов феномен". Наблюдава се както при реакцията на аглутинация, така и при реакцията на утаяване. Появата на прозоната в имунни реакциипоради факта, че участващите в тях антигени по правило са полидетерминантни, а молекулите IgG антителаимат два активни центъра. При излишък от антитела повърхността на всяка антигенна частица е покрита с молекули на антитела, така че не остават свободни детерминантни групи, така че вторият, несвързан активен център на антителата не може да взаимодейства с друга антигенна частица и да ги свърже един с друг. Образуването на видим аглутинат или преципитат също се потиска с излишък на антиген, когато няма нито едно свободно активно място на антитела и следователно комплексите антиген + антитяло + антиген вече не могат да бъдат увеличени.