имунодиагностични реакции. Реакции антиген-антитяло и реакции с белязани компоненти. Използва се за идентифициране на микроорганизми и диагностични цели инфекциозни заболявания.

Имунните реакции се използват при диагностични и имунологични изследвания при пациенти и здрави хора. За целта нанесете серологични методи (от лат. серум - серум и лога - доктрина), т.е. методи за изследване на антитела и антигени, като се използват реакции антиген-антитяло, определени в кръвен серум и други течности, както и телесни тъкани.

Откриването на антитела срещу антигените на патогена в кръвния серум на пациента прави възможно диагностицирането на заболяването. Серологичните изследвания се използват и за идентифициране на микробни антигени, различни биологично активни вещества, кръвни групи, тъканни и туморни антигени, имунни комплекси, клетъчни рецептори и др.

Когато се изолира микроб от пациент, патогенът се идентифицира чрез изследването му. антигенни свойствакато се използват имунни диагностични серуми, т.е. кръвни серуми на хиперимунизирани животни, съдържащи специфични антитела. Този т.нар серологична идентификациямикроорганизми.

В микробиологията и имунологията широко се използват реакции на аглутинация, преципитация, неутрализация, реакции с участието на комплемент, с използване на белязани антитела и антигени (радиоимунологични, ензимни имуноанализа, имунофлуоресцентни методи). Изброените реакции се различават по регистрирания ефект и техниката на настройка, но всички те са основни. ванове върху реакцията на взаимодействие на антиген с антитяло и се използват за откриване както на антитела, така и на антигени. Реакциите на имунитета се характеризират с висока чувствителност и специфичност.

Следват принципите и схемите на основните имунологични диагностични реакции. Подробна техниканастройка на реакциите е дадена в. практически насоки за имунодиагностика.

Реакция на аглутинация - РА(от лат. аглути- нация- свързване) - проста реакция, при която антителата свързват корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: разширена, приблизителна, индиректна и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка

RA се използва за:

определяне на антитела в кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакции на Райт, Хеделсън), Коремен тифи паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;

определяне на патогена, изолиран от пациента;

определяне на кръвни групи с помощта на моноклонални антитела срещу еритроцитни алогени.

За определяне на антителата на пациента слагамудължена реакция на аглутинация:добавете към разрежданията на кръвния серум на пациента диагностикум(суспензия от убити микроби) и след няколко часа инкубация при 37 ° C се отбелязва най-високото серумно разреждане (серумен титър), при което настъпва аглутинация, т.е. образува се утайка.

Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това е взаимодействието на диагностикуми (О- и R-антигени) със специфични антитела. Реакция на аглутинация с О-диагностикум(бактерии, убити от топлина, запазвайки термостабилен О антиген)протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.

Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете ориентировъчна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Приблизителна реакция се провежда върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум в разреждане 1:10 или 1:20 се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка със серум и микроби, те поставят обширна реакция на аглутинацияв епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращ серум, към които се добавят 2-3 капки от суспензията на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.

Различни свързани бактерии могат да бъдат аглутинирани от един и същ диагностичен аглутиниращ серум, което затруднява идентифицирането им. Затова се наслаждавайте адсорбирани аглутиниращи серуми,от които кръстосано реактивните антитела са били отстранени чрез адсорбция от техните сродни бактерии. В такива серуми остават антитела, специфични само за тази бактерия. Приготвянето на монорецепторни диагностични аглутиниращи серуми по този начин е предложено от A. Castellani (1902).

Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация (RNHA, RPHA) се основава на използването на еритроцити с антигени или антитела, адсорбирани на повърхността, взаимодействието на които със съответните антитела или антигени на кръвния серум на топката кара еритроцитите да се слепват и да падат на дъното на топката. епруветката или клетката впод формата на назъбена утайка (фиг. 13.2). При отрицателна реакция еритроцитите се утаяват под формата на "копче". Обикновено антителата се откриват в RNHA с помощта на антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити с адсорбирана Натехни антигени. Понякога използваме антитяло еритроцитна диагностика, върху която се адсорбират антитела. Например, ботулиновият токсин може да бъде открит чрез добавяне на еритроцитно антитяло botulinum diagnosticum към него (тази реакция се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация- РОНГА). RNHA се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания, определяне на гонадотропен хормон вурина при установяване на бременност, за откриване свръхчувствителностда се лекарства, хормони и в някои други случаи.

Реакция на коаглутинация . Патогенните клетки се определят с помощта на стафилококи, предварително обработени с имунен диагностичен серум. Протеин, съдържащ стафилококи И,имащи афинитет къмФК -фрагмент от имуноглобулини, неспецифично адсорбира антимикробни антитела, които след това взаимодействат с активни центрове със съответните микроби, изолирани от пациенти. В резултат на коаглутинацията се образуват люспи, състоящи се от стафилококи, диагностични серумни антитела и определяния микроб.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) се основава на блокада, потискане на антигени на вируси от антитела на имунен серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки (фиг. 13.3). RTHA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, кърлежов енцефалит и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.

Реакция на аглутинация за определяне на кръвни групи използва се за установяване на системата ABO (вижте раздел 10.1.4.1), като се използва аглутинация на еритроцити с антитела от имунен серум срещу антигени на кръвни групи A (II), B (III). Контролите са: серум без антитела, т.е AB (GU)кръвни групи; антигени, съдържащи се в еритроцитите от групи A (II), B (III). Отрицателната контрола не съдържа антигени, т.е. използвани са еритроцити от група 0 (I).

AT реакции на аглутинация за определяне на Rh фактора(вижте раздел 10.1.4.1) използвайте анти-Rh серуми (поне две различни серии). При наличие на Rh антиген върху мембраната на изследваните еритроцити настъпва аглутинация на тези клетки. Като контроли служат стандартните Rh-положителни и Rh-отрицателни еритроцити от всички кръвни групи.

Реакция на аглутинация за определяне на анти-резус антитела ( индиректна реакцияКумбс)използвани при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват антирезус антитела, които са непълни, едновалентни. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Наличието на такива непълни антитела се определя в индиректната реакция на Coombs. За да направите това, към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което предизвиква аглутинация на еритроцитите (фиг. 13.4). С помощта на реакцията на Кумбс се диагностицират патологични състояния, свързани с вътресъдов лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новороденото: еритроцитите на Rh-положителен плод се комбинират с непълни антитела срещу Rh фактора, циркулиращ в кръвта, който преминава плацентата от Rh-отрицателна майка.

Реакции на утаяване

реакция на утаяване - RP (отлат. praeci-pito- преципитат,) е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулен антиген с антитела под формата на мътност, т.нар. утайка.Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунния комплекс.

Реакции на утаяване, поставени в епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване),в гелове, хранителни среди и др. Разновидностите на реакцията на утаяване в полутечен гел от агар или агароза са широко използвани: двойна имунодифузия по Ouchterlony. радиална имунодифузия, имуноелектрофорезаи т.н.

Реакция на пръстеновидно утаяване . Реакцията се провежда в тесни утаителни епруветки с имунен серум, върху който е наслоен разтворим антиген. При оптимално съотношение на антиген и антитела на границата на тези два разтвора се образува непрозрачен преципитатен пръстен (фиг. 13.5). Излишъкът от антиген не влияе върху резултата от реакцията на утаяване на пръстена поради постепенната дифузия на реагентите към границата на течността. Ако сварени и филтрирани водни екстракти от органи или тъкани се използват като антигени в реакцията на пръстеновидно утаяване, тогава такава реакция се нарича реакция на термоутаяване-iii (реакция на Асколи,с антракс /

Реакция на двойна имунодифузия на Oukhteruni . За да се настрои реакцията, разтопеният агар гел се излива на тънък слой върху стъклена плоча и след като се втвърди, в него се изрязват отвори с размери 2-3 mm. Антигените и имунните серуми се поставят отделно в тези ямки, които дифундират една към друга. В точката на среща в еквивалентни пропорции те образуват утайка под формата на бяла лента. В многокомпонентни системи се появяват няколко линии от утайка между ямките с различни антигени и серумни антитела; за идентични антигени линиите на утайката се сливат; за нееднакви се пресичат (фиг. 13.6).

Реакция на радиална имунодифузия . Имунният серум с разтопен агар гел се излива равномерно върху стъклото. След втвърдяване в гела се правят ямки, в които се поставя антигенът различни разреждания. Антигенът, дифундирайки в гела, образува пръстеновидни зони на утаяване около ямките с антителата (фиг. 13.7). Диаметърът на преципитационния пръстен е пропорционален на концентрацията на антигена. Реакцията се използва за определяне на кръвните нива на имуноглобулини от различни класове, компоненти на системата на комплемента и др.

Имуноелектрофореза- комбинация от метода на електрофореза и имунопреципитация: смес от антигени се въвежда в ямките на гела и се разделя в гела с помощта на електрофореза. След това, успоредно на зоните на електрофореза, в жлеба се въвежда имунен серум, чиито антитела, дифундирайки в гела, се образуват в точката на среща с антигена на линията на утаяване.

реакция на флокулация(според Рамон) (от лат. флокус-вълнени люспи) - появата на опалесценция или флокулентна маса (имунопреципитация) в епруветка по време на реакция токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Използва се за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид.

Имунна електронна микроскопия- електронна микроскопия на микроби, по-често вируси, третирани с подходящи антитела. Вирусите, третирани с имунен серум, образуват имунни агрегати (микропреципитати). Около вирионите се образува "венче" от антитела, контрастирани с фосфорволфрамова киселина или други електронно-оптически плътни препарати.

Реакции, включващи комплемент

Реакции, включващи комплементвъз основа на активирането на комплемента от комплекс антиген-антитяло (реакция на фиксиране на комплемента, радиална хемолиза и др.).

Реакция на фиксиране на комплемента (RSK) се крие във факта, че когато съответстват един на друг, антигените и антителата образуват имунен комплекс, към който чрезФК -фрагмент от антитела се присъединява към комплемента (С), т.е. свързването на комплемента става с комплекс антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен (фиг. 13.8). RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, по време на образуването на комплекса антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не отговарят едно на друго (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.

RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман).

Реакцията на радиална хемолиза (RRH ) поставени в ямки от агар гел, съдържащ еритроцити от овен и комплемент. След добавяне на хемолитичен серум (антитела срещу еритроцити на коч) към ямките на гела, около тях се образува зона на хемолиза (в резултат на радиална дифузия на антитела). По този начин е възможно да се определи активността на комплемента и хемолитичния серум, както и антителата в кръвния серум на пациенти с грип, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи. За да направите това, съответните антигени на вируса се адсорбират върху еритроцитите и кръвният серум на пациента се добавя към ямките на гела, съдържащ тези еритроцити. Антивирусните антитела взаимодействат с вирусните антигени, адсорбирани върху еритроцитите след това

Компонентите на комплемента се прикрепят към този комплекс, причинявайки хемолиза.

Реакция на имунна адхезия (RIP ) се основава на активирането на системата на комплемента от корпускулярни антигени (бактерии, вируси), третирани с имунен серум. В резултат на това се образува активиран трети компонент на комплемента (C3b), който се прикрепя към корпускуларния антиген като част от имунния комплекс. На еритроцитите, тромбоцитите, макрофагите има рецептори за C3b, поради което, когато тези клетки се смесват с имунни комплекси, носещи C3b, те се комбинират и аглутинират.

Реакция на неутрализация

Имунните серумни антитела са в състояние да неутрализират увреждащото действие на микробите или техните токсини върху чувствителни клетки и тъкани, което е свързано с блокадата на микробните антигени от антитела, т.е. неутрализиране. Реакция на неутрализация(RN) се извършва чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). При липса на увреждащ ефект на микроорганизми или техните антигени, токсини при животни и тестови обекти, те говорят за неутрализиращия ефект на имунния серум и следователно за специфичността на взаимодействието на комплекса антиген-антитяло (фиг. 13.9).

Имунофлуоресцентна реакция - RIF (метод на Кунс)

Има три основни разновидности на метода: директен, косвен (фиг. 13.10), с допълнение. Реакцията на Кунс е бърз диагностичен метод за откриване на микробни антигени или откриване на антитела.

Директен RIF метод се основава на факта, че тъканни антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп.

Бактериите в намазка, обработени с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница.

Индиректен RIF метод е да се идентифицира комплексът антиген-антитяло, като се използва антиглобулинов (анти-антитяло) серум, белязан с флуорохром. За да направите това, петна от суспензия от микроби се третират с антитела от антимикробен заешки диагностичен серум. След това антителата, които не са свързани с микробни антигени, се отмиват и антителата, останали върху микробите, се откриват чрез третиране на намазката с антиглобулинов (анти-заешки) серум, белязан с флуорохроми. В резултат на това се образува сложен микроб + антимикробни заешки антитела + анти-заешки антитела, белязани с флуорохром. Този комплекс се наблюдава във флуоресцентен микроскоп, както при директния метод.

ELISA метод или анализ (ELISA)

ELISA -откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани с маркиращ ензим (пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза или алкална фосфатаза). След като антигенът се комбинира с ензимно белязаните имунни серуми, субстратът/хромогенът се добавя към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и цветът на реакционния продукт се променя - интензитетът на цвета е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Твърда фаза ELISA - най-често срещаният вариант на имунологичния тест, когато един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитела) се адсорбира върху твърд носител, например в ямките на полистиролови плаки

При определяне на антитела кръвният серум на пациента, антиглобулиновият серум, маркиран с ензима, и субстратът (хромоген) за ензима се добавят последователно към ямките на плаките с адсорбирания антиген.

Всеки път след добавянето на следващия компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. При положителен резултат цветът на хромогенния разтвор се променя. Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитела. След това желаният антиген се въвежда в ямките с адсорбирани антитела, добавя се имунният серум срещу антигена, маркиран с ензима, и след това се добавя субстратът за ензима.

Конкурентна ELISA . целевият антиген и белязаният с ензим антиген се конкурират един с друг за свързването на ограничено количество имунни серумни антитела. Друг тест са антителата, които търсите

и белязаните антитела се конкурират помежду си за антигени.

Радиоимунологичен метод или анализ (RIA)

Високочувствителен метод, базиран на реакцията антиген-антитяло, използваща антигени или антитела, маркирани с радионуклид (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr и др.). След тяхното взаимодействие, полученият радиоактивен имунен комплекс се отделя и неговата радиоактивност се определя в съответния брояч (бета или гама лъчение):

интензивността на радиацията е право пропорционална на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

При твърдофазна версия на RIA един от реакционните компоненти (антиген или антитела) се адсорбира върху твърд носител, например в ямки от полистиренови микрочипове. Друга версия на метода е конкурентен RIA.целевият антиген и белязаният с радионуклид антиген се конкурират помежду си за свързване на ограничено количество имунни серумни антитела. Тази опция се използва за определяне на количеството антиген в тестовия материал.

RIA се използва за откриване на микробни антигени, определяне на хормони, ензими, лекарствени веществаи имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в тестовия материал в незначителни концентрации - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Методът представлява определена опасност за околната среда.

Имуноблотинг

Имуноблотинг (IB)- високочувствителен метод, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA.

Антигенът се изолира с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел, след което се прехвърля (блотинг - от англ. петно, петно) от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и проявено чрез ELISA. Фирмите произвеждат такива ленти с "петна"

антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. След това, след инкубация, пациентът се измива от несвързаните антитела на пациента и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязан с ензим. Комплексът антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig, образуван върху лентата, се открива чрез добавяне на субстрат / хромоген, който променя цвета си под действието на ензима (фиг. 13.12).

IB се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

Реакция на аглутинация Реакция на аглутинация

(RA) - метод за откриване и количествено определяне на Ag и Ab, базиран на способността им да образуват агломерати, видими с просто око. В клиниката по инфекции. заболявания или за други цели, той се използва за идентифициране на непознати микроби и клетки, за определяне на наличието и количеството на антитела в кръвта и други течности. Принципът на определяне се основава на спецификата на взаимодействието между Ag и Am и се състои в намирането на известното от неизвестното. Има много варианти на РА: количествени и качествени, ин витро и върху стъкло, обемни и капкови, конвенционални, ускорени и експресни методи. За да настроите RA, трябва: 1) с-ка кръв.Във варианта с дефиницията на вида (var) на бактериите се използват индустриални аглутиниращи s-ki, произведени чрез имунизиране на зайци. Във варианта с дефиницията на типа Ab те вземат кръвна проба, получена от изследването. хора или животни. S-ka трябва да бъде стерилна и да не съдържа суспендирани частици. Пригответе основното разреждане във физиологичен разтвор. Той трябва да бъде 2-4 пъти по-нисък от диагностичния титър за това заболяване; 2) Ag .При варианта на реакцията с определяне на вида на Ab се използва производствена диагностика; във варианта с определяне на Ag, диагностикумите се приготвят сами под формата на 1-3 милиардна суспензия във физиологичен разтвор на 18-20-часов агар (по-рядко бульон) за изследване. микроб, инактивиран чрез нагряване във водна баня при 70°C за 1 h или 24-часова инкубация при 37°C с формалин (0,2% крайна концентрация); 3) физиологичен електролит.Техника на настройка обемна серийна тръба RA за определяне на титъра на Ab в s-ke: няколко реда работни разреждания се приготвят от основното разреждане на s-ki. Броят на редовете зависи от броя на диагностикумите, взети в експеримента, броят и факторите на разреждане се определят от диагностичния титър на предполагаемото заболяване. Редът трябва да съдържа най-малко едно разреждане, съответстващо на диагностичния титър на Ab, две разреждания под и две разреждания над него. например, ако диагностичният титър е 1: 100, тогава с обемния метод за определяне на RA трябва да се приготвят следните разреждания на s-ki: 1: 25, 1: 50, 1: 100, 1: 200, 1 "400; при капковия метод не е необходимо първото разреждане (1:25), но е необходимо друго по-високо разреждане - 1:800. научно изследванес-ку титриран до отрицателна реакция. Разрежда се, както следва: във всички експериментални епруветки, с изключение на 1-ва, се изсипват 0,25 ml физиологичен разтвор при настройка на реакцията в обем от 0,5 ml и 0,5 ml при настройка на реакцията в обем от 1 ml. Изсипете 0,25 (0,5) ml от основното разреждане на s-ki в 1-ва и 2-ра епруветки, от 2-ра епруветка в нарязан обем и отглеждане си се увеличава 2 пъти, 0,25 (0,5) ml се прехвърля на 3-ти, от 3-ти на 4-ти и т.н. до последно, от разфасовка във всичко се налива 0,25 (0,5) мл за балансиране на обемите. Всяко разреждане с-ки се извършва с помощта на отделна пипета. Ако в експеримента се вземат няколко диагностикума, тогава за всеки от тях се приготвя серия от разреждане по същия начин. Към всяко разреждане на s-ki се добавя Diagnosticum в обем, равен на обема на s-ki, в резултат на което разреждането във всяка епруветка се увеличава 2 пъти. Опитът съответства на контрола на s-ki (0,25 -0,5 ml от основното разреждане на s-ki и същото количество физиологичен разтвор) и контрола на AG (0,25 - 0,5 ml диагностикум и същото количество физиологичен разтвор). Ако в експеримента се вземат няколко диагностикума, тогава всеки от тях има своя контролна Ag. Стелажът с епруветките се разклаща добре и се поставя в термостат при 37°C за 4 часа, след което се оставя на стайна температура, докато следващия ден, след което се отчита RA, въз основа на количеството на утайката и степента на избистряне на течността. Определянето на тези показатели, в зависимост от естеството на аглутинатите, се извършва с невъоръжено око на тъмен фон, в аглутиноскоп или върху вдлъбната повърхност на огледало на микроскоп. Отчитането започва с контроли: контролата трябва да е прозрачна, Ag трябва да е равномерно мътна (след разклащане на епруветката). При добри контроли се установява наличие и степен на аглутинация във всички опитни епруветки, които се обозначават с плюсове: голяма утайка и пълно избистряне на течността - 4 плюса; голяма утайка и непълно просветляване на течността -3 плюса; забележима утайка и забележимо просветление на течността - 2 плюса. След това се определя титърът: най-високото разреждане с интензитет на аглутинация най-малко 2 плюса. Титър на изпита s-ki се сравнява с диагностичен титър за това заболяване. Ако титърът на изследването s-ki е 2 пъти по-нисък от диагностичния, реакцията се оценява като съмнителна; ако титърът е равен на диагностичния - като слабо положителен; ако е 2-4 пъти по-висока от нея - като положителна, ако е 8 и повече пъти по-висока - като рязко положителна. При широко разпространение на Ab при здрави хора, повишаването на титъра на Ab се използва за оценка на RA. За да се определи вида на Ag в серийния RA, броят на редовете трябва да съответства на броя, взет за идентификация диагностични с-то. От основното разреждане на диагностичните s-ki се приготвя серия от последователни двукратни разреждания по същия начин, както в RA, за да се определи титърът на At. Коефициентите на разреждане зависят от титъра на аглутиниращите s. В експеримента наличието на разреждане, равно на титъра на s. разреждания 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Същият обем на изследване Ag е добавени към разрежданията на s-ki, в резултат на това разреждането на s-to се увеличава 2 пъти.включват се няколко s-to, след което всеки от тях се нуждае от собствен контрол.След завършване на реакцията стативът се разклаща енергично и се поставя в термостат при 37°C. Резултатите се вземат предвид, както е описано по-горе. Ag, взет в експеримента с-ke, титърът на реакцията трябва да съответства на поне половината от титъра на стандартния диагностичен тест Титри от 1 4 и по-ниски се считат за групова реакция капе m dНастройката на RA се различава от обемната по това, че s-ku се разрежда в обем от 1 ml, Ag се използва в по-висока концентрация (10 милиарда / ml) и се добавя 1 - 2 капки в епруветка Разреждането на s-ki след добавяне на Ag се счита за непроменено.В противен случай методът на настройка, записване и оценка е подобен на обемния метод

(Източник: Речник на термините в микробиологията)

Реакция на аглутинация (от лат. аглутинация- свързване) - свързване на корпускули (бактерии, еритроцити и др.) с антитела в присъствието на електролити.

Реакция на аглутинациясе проявява под формата на люспи или утайка, състояща се от корпускули (например бактерии), „залепени заедно“ от антитела (фиг. 7.37). Реакцията на аглутинация се използва за: определяне на патогена, изолиран от пациента; определяне на антитела в кръвния серум на пациента; определяне на кръвни групи.

Ориз. 7.37 а, б. Реакция на аглутинация сIgM-антитела (а) иIgG-антитела (б)

1. Определяне на патогена, изолиран от пациента. Приблизителна реакция на аглутинация върху стъкло (фиг. 7.38). Към капка аглутиниращ серум се добавя суспензия от бактерии, изолирани от пациента (разреждане 1:20). Образува се люспеста утайка.

Ориз. 7.38.

Разширена реакция на аглутинация с патоген, изолиран от пациент (фиг. 7.39). Към разрежданията на аглутиниращия серум се добавя суспензия от бактерии, изолирани от пациента.

Ориз. 52

2. Определяне на антитела в кръвния серум на пациента
Разширена реакция на аглутинация с кръвния серум на пациента (фиг. 7.39). Diagnosticum се добавя към разрежданията на серума на пациента.
- Аглутинацията с O-diagnosticum (бактерии, убити чрез нагряване, запазващи 0-антигена) протича под формата на финозърнеста аглутинация.
- Аглутинацията с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи флагеларния H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.
3. Аглутинационен тест за определяне на кръвни групиРеакцията на аглутинация за определяне на кръвни групи се използва за установяване на системата ABO (Таблица b) чрез аглутиниране на еритроцити с имунни серумни антитела срещу антигени на кръвни групи A (I), B (III). Контролите са: серум, който не съдържа антитела, т.е. серум AB (IV) кръвни групи; антигени, съдържащи се в еритроцитите от групи A (II), B (III). Отрицателната контрола не съдържа антигени, т.е. използвани са еритроцити от група О (I).

Таблица 7.6. Определяне на ABO кръвни групи

1.1. РЕАКЦИЯ НА АГЛУТИНАЦИЯ (RA)

РЕАКЦИЯ НА АГЛУТИНАЦИЯ (RA)

Поради своята специфика, лекота на настройка и демонстративност, реакцията на аглутинация е широко разпространена в микробиологичната практика за диагностика на много инфекциозни заболявания.

Реакцията на аглутинация се основава на спецификата на взаимодействието на антитела (аглутинини) с цели микробни или други клетки (аглутиногени). В резултат на това взаимодействие се образуват частици - агломерати, които се утаяват (аглутинират) под формата на люспи.

В реакцията на аглутинация могат да участват както живи, така и мъртви бактерии, спирохети, гъбички, протозои, рикетсии, както и еритроцити и други клетки. Реакцията протича в две фази: първата (невидима) специфична, свързването на антигена и антителата, втората (видима) неспецифична, свързването на антигени, т.е. образуване на аглутинат.

Аглутинатът се образува, когато един активен центърдвувалентно антитяло с детерминантна антигенна група. Реакцията на аглутинация, както всяка серологична реакция, протича в присъствието на електролити.

Външно проявата на положителна реакция на аглутинация е двойна. При микробите без камшик, които имат само соматичен О антиген, самите микробни клетки се слепват директно. Такава аглутинация се нарича финозърнеста. Провежда се в рамките на 18 22 часа. v

Камшичестите микроби имат два антигена соматичен О антиген и флагеларен Н антиген. Ако клетките се слепват с флагели, се образуват големи хлабави люспи и такава реакция на аглутинация се нарича едрозърнеста. Пристига след 24 часа.

Реакцията на аглутинация може да се зададе както с цел качествено и количествено определяне на специфични антитела в кръвния серум на пациента, така и с цел определяне на вида на изолирания патоген. v

Реакцията на аглутинация може да бъде зададена както в подробна версия, която позволява работа със серум, разреден до диагностичен титър, така и във варианта на настройка на индикативна реакция, която позволява по принцип да се открият специфични антитела или да се определи вида на патоген.

При установяване на подробна реакция на аглутинация, за откриване на специфични антитела в кръвния серум на субекта, тест серумът се взема в разреждане 1:50 или 1:100. Това се дължи на факта, че в целия или леко разреден серум нормалните антитела могат да присъстват в много високи концентрации и тогава резултатите от реакцията може да са неточни. Материалът за изследване при този вариант на реакцията е кръвта на пациента.

Кръвта се взема на празен стомах или не по-рано от 6 часа след хранене (в противен случай може да има капчици мазнини в кръвния серум, което го прави мътен и неподходящ за изследване). Кръвният серум на пациента обикновено се получава през втората седмица от заболяването, като се събират стерилни от кубиталната вена 3-4 ml кръв (по това време се концентрира максималното количество специфични антитела). Като известен антиген се използва диагностикум, приготвен от убити, но неунищожени микробни клетки от определен вид със специфична антигенна структура.

При поставяне на подробна реакция на аглутинация за определяне на вида, вида на патогена, антигенът е жив патоген, изолиран от тестовия материал. Известни са антителата, съдържащи се в имунния диагностичен серум. v

Серумът за имунна диагностика се получава от кръвта на ваксиниран заек. След определяне на титъра (максималното разреждане, в което се откриват антитела), диагностичният серум се излива в ампули с добавяне на консервант. Този серум се използва за идентифициране чрез антигенната структура на изолирания патоген.

ВАРИАНТИ НА АГЛУТИНАЦИОННА РЕАКЦИЯ

В тези реакции участват антигени под формата на частици (микробни клетки, еритроцити и други корпускулни антигени), които се слепват с антитела и се утаяват.

За провеждане на реакция на аглутинация (РА) са необходими три компонента: 1) антиген (аглутиноген); 2) антитяло (аглутинин) и 3) електролит (изотоничен разтвор на натриев хлорид).

ИНДИКАТИВНА (ПЛАЧКА) РЕАКЦИЯ НА АГЛУТИНАЦИЯ (RA)

Приблизителният, или ламеларен, RA се поставя върху предметно стъкло при стайна температура. За да направите това, капка серум в разреждане 1:10 1:20 и контролна капка изотоничен разтвор на натриев хлорид се нанасят отделно върху стъклото с пипета на Пастьор. Колониите или ежедневната бактериална култура (капка диагностикум) се въвеждат в двете бактериологични бримки и се смесват старателно. Реакциите се отчитат за няколко минути визуално, понякога с лупа (x5). При положителен RA в капка със серум се отбелязва появата на големи и малки люспи, при отрицателен, серумът остава равномерно мътен.

РЕАКЦИЯ НА ИНДИРЕКТНА (ПАСИВНА) ХЕМАГЛУТИНАЦИЯ (RNHA, RPHA)

Реакцията се задава: 1) за откриване на полизахариди, протеини, екстракти от бактерии и други силно диспергирани вещества, рикетсии и вируси, чиито комплекси с аглутинини не могат да се видят при обикновен RA, или 2) за откриване на антитела в серума на пациентите към тези силно диспергирани вещества и най-малките микроорганизми.

Под индиректна или пасивна аглутинация се разбира реакция, при която антителата взаимодействат с антигени, предварително адсорбирани върху инертни частици (латекс, целулоза, полистирол, бариев оксид и др. или еритроцити на овен, I (0) човешки кръвни групи).

При реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA) като носител се използват еритроцитите. Натоварените с антиген еритроцити се слепват в присъствието на специфични антитела към този антиген и се утаяват. Антиген-сенсибилизираните еритроцити се използват в RPHA като еритроцитна диагностика за откриване на антитела (серодиагностика). Ако еритроцитите са заредени с антитела (диагностикум на еритроцитни антитела), тогава може да се използва за откриване на антигени.

Постановка. В ямките на полистиролови таблетки пригответе серия от серийни разреждания на серум. 0,5 ml известен положителен серум се добавят към предпоследната ямка и 0,5 ml физиологичен разтвор (контроли) се добавят към последната ямка. След това към всички ямки се добавя 0,1 ml разреден еритроцитен диагностикум, разклаща се и се поставя в термостат за 2 часа.

Счетоводство. В положителен случай еритроцитите се установяват на дъното на дупката под формата на равномерен слой клетки със сгънат или назъбен ръб (обърнат чадър), в отрицателен случай се установяват под формата на копче или пръстен .

1.2. РЕАКЦИЯ НА НЕУТРАЛИЗИРАНЕ. ЛИЗИС,
ОПСОНОФАГОЦИТНА РЕАКЦИЯ, РЕАКЦИЯ НА СВЪРХЪМ ЧУВСТВИТЕЛНОСТ

РЕАКЦИЯ НА НЕУТРАЛИЗИРАНЕ НА ЕКЗОТОКСИНА С АНТИТОКСИН (RN)

Реакцията се основава на способността на антитоксичния серум да неутрализира действието на екзотоксина. Използва се за титруване на антитоксични серуми и определяне на екзотоксин.

При титруване на серума определена доза от съответния токсин се добавя към различни разреждания на антитоксичен серум. При пълно неутрализиране на антигена и липса на неизползвани антитела настъпва първоначална флокулация. Реакцията на флокулация може да се използва не само за титруване на серум (например дифтериен), но и за титруване на токсин и токсоид. Реакцията на неутрализация на токсина с антитоксин има голяма практическа стойносткато метод за определяне на активността на антитоксични терапевтични серуми. Антигенът в тази реакция е истински екзотоксин.

Силата на антитоксичния серум се определя от конвенционалните единици AE.

1 AU ботулинов серум неговото количество неутрализира 1000 DLM ботулинов токсин. Реакцията на неутрализация за определяне на вида или вида на екзотоксина (при диагностицирането на тетанус, ботулизъм, дифтерия и др.) Може да се извърши in vitro (според Ramon), а при определяне на токсигенността на микробните клетки - в гела ( според Оухтерлони).

Реакция на лизис (RL)

Едно от защитните свойства на имунния серум е способността му да разтваря микроби или клетъчни елементи, които влизат в тялото.

Специфичните антитела, които причиняват разтварянето (лизиране) на клетките, се наричат ​​лизини. В зависимост от природата на антигена те могат да бъдат бактериолизини, цитолизини, спирохетолизини, хемолизини и др.

Лизините проявяват своя ефект само при наличието на допълнителен фактор - комплемент. Комплементът като неспецифичен фактор хуморален имунитетнамира се в почти всички телесни течности, с изключение на гръбначно-мозъчна течности течност на предната камера. В човешкия кръвен серум се отбелязва доста високо и постоянно съдържание на комплемент и много от него в кръвния серум. морско свинче. При други бозайници съдържанието на комплемент в кръвния серум е различно.

Комплементът е сложна система суроватъчните протеини. Той е нестабилен и се срутва при 55 градуса за 30 минути. При стайна температура комплементът се разрушава в рамките на два часа. Много е чувствителен към продължително разклащане, към действието на киселини и ултравиолетови лъчи. Комплементът обаче се съхранява дълго време (до шест месеца) в изсушено състояние при ниска температура. Комплементът насърчава лизиране на микробни клетки и еритроцити.

Разграничете реакцията на бактериолиза и хемолиза.

Същността на реакцията на бактериолиза е, че когато специфичен имунен серум се комбинира със съответните му хомоложни живи микробни клетки в присъствието на комплемент, микробите се лизират.

Реакцията на хемолиза се състои в това, че когато еритроцитите са изложени на специфичен, имунен към тях серум (хемолитичен) в присъствието на комплемент, еритроцитите се разтварят, т.е. хемолиза.

Реакцията на хемолиза в лабораторната практика се използва за определяне на tyr на комплемента, както и за отчитане на резултатите от диагностичните тестове за фиксиране на комплемента. Титърът на комплемента е най-малкото количество, което предизвиква лизис на червени кръвни клетки в рамките на 30 минути в хемолитична система в обем от 2,5 ml. Реакцията на лизис, подобно на всички серологични реакции, протича в присъствието на електролит.

РЕАКЦИИ НА СВЪРХЪМ ЧУВСТВИТЕЛНОСТ (АЛЕРГИЧНИ).

Някои форми на антиген, при многократен контакт с тялото, могат да причинят реакция, която е основно специфична, но включва неспецифични клетъчни и молекулярни фактори на остър възпалителен отговор. Познати са две форми на хиперреактивност: свръхчувствителност незабавен тип(GHT) и свръхчувствителност от забавен тип (DTH). Първият тип реакция се проявява с участието на антитела, докато реакцията се развива не по-късно от 2 часа след повторен контакт с алергена. Вторият тип се осъществява с помощта на възпалителни Т-клетки (Tr3) като основни ефектори на реакцията, които осигуряват натрупването на макрофаги в зоната на възпалението, реакцията се проявява след 6-8 часа и по-късно.

Развитието на реакция на свръхчувствителност се предхожда от среща с антиген и възникване на сенсибилизация, т.е. появата на антитела, активно сенсибилизирани лимфоцити и пасивно сенсибилизирани от цитофилни антитела на други левкоцити (макрофаги, гранулоцити).

Реакциите на свръхчувствителност имат три фази на развитие: имунологична; патохимични; патофизиологичен.

В първата, специфична фаза, алергенът взаимодейства с антитела и (или) сенсибилизирани клетки. Във втората фаза има освобождаване на биологично активни веществаот активираните клетки. Освободените медиатори (хистамин, серотонин, левкотриени, брадикинин и др.) предизвикват различни периферни ефекти, характерни за съответния тип реакция - третата фаза.

Реакции на свръхчувствителност от четвърти тип

Реакциите от този тип се причиняват от патогенни междуклетъчни взаимодействия на сенсибилизирани Thelpers, цитотоксични T-лимфоцити (Tkillers) и активирани клетки на мононуклеарната фагоцитна система, причинени от продължително стимулиране на имунната система от бактериални антигени, при което има относителна недостатъчност на имунната система на организма. система за елиминиране от вътрешната среда бактериални патогениинфекциозни заболявания. Тези реакции на свръхчувствителност причиняват туберкулозни белодробни кухини, тяхната казеозна некроза и обща интоксикация при пациенти с туберкулоза. Кожната грануломатоза при туберкулоза и проказа в морфопатогенетично отношение до голяма степен се състои от реакции на свръхчувствителност от четвърти тип.

Най-известният пример за реакция на свръхчувствителност тип 4 е реакцията на Манту, която се развива на мястото на интрадермално приложение на туберкулин на пациент, чието тяло и система са сенсибилизирани към микобактериални антигени. В резултат на реакцията се образува плътна хиперемична папула с некроза в центъра, която се появява само няколко часа по-късно (бавно) след интрадермално приложение на туберкулин. Образуването на папула започва с излизането от съдово леглов междуклетъчните пространства на мононуклеарните фагоцити на циркулиращата кръв. Едновременно с това започва емиграция от съдовото легло на полиморфонуклеарни клетки. След това неутрофилната инфилтрация намалява и инфилтратът започва да се състои предимно от лимфоцити и мононуклеарни фагоцити. Това е разликата между реакцията на Манту и реакцията на Артюс, при която на мястото на лезията се натрупват предимно полиморфонуклеарни левкоцити.

При реакции на свръхчувствителност от четвърти тип, продължителното стимулиране на сенсибилизираните лимфоцити с антигени води до патологични променитъкани до патологично интензивно и продължително освобождаване на цитокини от Thelpers. Интензивното освобождаване на цитокини в локусите на тъканно увреждане причинява хиперактивиране на клетките на системата от мононуклеарни фагоцити, разположени там, много от които образуват нишки от епителни клетки в хиперактивирано състояние, а някои се сливат помежду си, за да образуват гигантски клетки. Макрофагите, на чиято повърхност са изложени бактериални и вирусни антигени, могат да бъдат унищожени чрез функционирането на Tkillers (естествени убийци).

Реакцията на свръхчувствителност от четвъртия тип се предизвиква от разпознаването на чужд бактериален антиген от Т-хелперите, чувствителни към него. Необходимо условие за разпознаване е взаимодействието на индуктори с антигени, изложени на повърхността на антиген-представящи клетки след ендоцитоза и обработка на чужди имуногени от мононуклеарни фагоцити. Друг необходимо условиеекспозиция на антигени в комбинация с клас I молекули от основния комплекс за тъканна съвместимост. След разпознаване на антигена сенсибилизираните помощници освобождават цитокини и по-специално интерлевкин2, който активира естествените убийци и мононуклеарните фагоцити. Активираните мононуклеарни фагоцити освобождават протеолитични ензими и свободни кислородни радикали, които увреждат тъканите.

Кожни алергични тестове тестове за установяване на чувствителността на организма към алергени, определяне на неговата инфекция, например туберкулоза, бруцелоза, ниво колективен имунитеткато туларемия. Според мястото на въвеждане на алергена се различават: 1) кожни проби; 2) скарифициране; 3) интрадермално; 4) подкожно. Клиничната реакция към алерген при кожно-алергичен тест се разделя на локална, обща и фокална, както и незабавна и забавена.

Локалните реакции от медиаторния тип на HIT се появяват след 5-20 минути, изразяват се като еритема и мехур, изчезват след няколко часа, оценяват се по плюсовия метод по количеството на еритема, измерено в mm. Локалните реакции на ХЗТ се появяват след 24-48 часа, продължават дълго време, проявяват се като инфилтрат, понякога с некроза в центъра и се оценяват по размера на инфилтрата в mm, също и по системата плюс. При цитотоксични и имунокомплексни типове GNT, хиперемия и инфилтрация се наблюдават след 3-4 часа, достигат максимум на 6-8 часа и изчезват след около ден. Понякога се наблюдават комбинирани реакции.

1.3. РЕАКЦИЯ НА СВЪРЗВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТА (CFR)

Тази реакция се използва за лабораторни изследванияза откриване на антитела в кръвния серум при различни инфекции, както и за идентифициране на патогена чрез антигенна структура.

Тестът за свързване на комплемента е сложен серологичен тест и се характеризира с висока чувствителност и специфичност.

Характеристика на тази реакция е, че промяната в антигена по време на взаимодействието му със специфични антитела се случва само в присъствието на комплемент. Комплементът се адсорбира само върху комплекса антитяло-антиген. Комплекс антитяло-антиген се образува само ако има афинитет между антигена и антитялото, присъстващо в серума.

Адсорбцията на комплемента върху комплекса „антигенно антитяло“ може да повлияе на съдбата на антигена по различни начини, в зависимост от неговите характеристики.

Някои от антигените са изложени при тези условия на остър морфологични промени, до разтваряне (хемолиза, феномен на Isaev Pfeifer, цитолитичен ефект). Други променят скоростта на движение (имобилизация на трепонема). Трети умират без остри разрушителни промени(бактерицидно или цитотоксично действие). И накрая, адсорбцията на комплемента може да не бъде придружена от промени в антигена, които са лесно забележими.

Според механизма RSC протича в две фази:

1. Първата фаза е образуването на комплекса "антигенно антитяло" и адсорбцията върху този комплекс на комплемента. Резултатът от фазата не е визуално видим (взаимодействието на антиген и антитела със задължителното участие на комплемента).
2. Втората фаза е промяна в антигена под въздействието на специфични антитела в присъствието на комплемент. Резултатът от фазата може да бъде визуално видим или невидим (откриване на резултатите от реакцията с помощта на индикаторна хемолитична система (овчи еритроцити и хемолитичен серум).

Разрушаването на еритроцитите от хемолитичен серум се случва само в случай на прикрепване на комплемента към хемолитичната система. Ако комплементът е адсорбиран по-рано върху комплекса антиген-антитяло, тогава хемолизата на еритроцитите не настъпва.

Резултатът от експеримента се оценява, като се отбелязва наличието или отсъствието на хемолиза във всички епруветки. Реакцията се счита за положителна при пълно забавяне на хемолизата, когато течността в епруветката е безцветна и еритроцитите се утаяват на дъното, отрицателна при пълен лизис на еритроцитите, когато течността е интензивно оцветена ("лакова" кръв). Степента на забавяне на хемолизата се оценява в зависимост от интензитета на цвета на течността и количеството еритроцитна утайка на дъното (++++, +++, ++, +).

В случай, че промените в антигена остават недостъпни за визуално наблюдение, е необходимо да се използва втора система, която действа като индикатор, който ви позволява да оцените състоянието на комплемента и да направите заключение за резултата от реакцията.

Тази индикаторна система е представена от компонентите на реакцията на хемолиза, която включва овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ специфични антитела към еритроцитите (хемолизини), но не съдържащи комплемент. Тази индикаторна система се добавя към епруветките един час след задаване на основния CSC. Ако реакцията на фиксиране на комплемента е положителна, тогава се образува комплекс антитяло-антиген, който адсорбира комплемента върху себе си. Тъй като комплементът се използва в количеството, необходимо само за една реакция, и лизисът на еритроцитите може да настъпи само в присъствието на комплемент, тогава, когато се адсорбира върху комплекса „антигенно антитяло“, няма да настъпи лизис на еритроцитите в хемолитичната (индикаторна) система . Ако реакцията на фиксиране на комплемента е отрицателна, комплексът "антигенно антитяло" не се образува, комплементът остава свободен и когато се добави хемолитична система, настъпва лизис на еритроцитите.

1.4. ДНК ПРОБИ. ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ (PCR),
ЕНЗИМЕН ИМУнен МЕТОД (ELISA), ФЛУОРЕСЦЕНТЕН МЕТОД НА АНТИТЕЛА (MFA)

МЕТОДИ ЗА ГЕННО СОНДИРАНЕ

В основата бяха интензивното развитие на молекулярната биология и създаването на перфектна методологична база за генетични изследвания генното инженерство. В областта на диагностиката възникна и бързо се развива направление за определяне на специфични нуклеотидни последователности на ДНК и РНК, т. нар. генно сондиране. Такива методи се основават на способността на нуклеиновите киселини да се хибридизират, за да образуват двойноверижни структури поради взаимодействието на комплементарни нуклеотиди (AT, GC).

За да се определи желаната последователност на ДНК (или РНК), специално се създава така наречената полинуклеотидна проба със специфична базова последователност. В състава му се въвежда специален етикет, който позволява да се идентифицира образуването на комплекса.

Въпреки че генното сондиране не може да се припише на методите на имунохимичния анализ, неговият основен принцип (взаимодействие на комплементарни структури) се прилага методично по същите начини като индикаторните методи на имунодиагностиката. В допълнение, методите за генно сондиране позволяват да се попълни информация за инфекциозен агент при липса на фенотипна експресия (вируси, вградени в генома, "мълчаливи" гени).

За ДНК анализ пробата се подлага на денатурация, за да се получат едноверижни структури, с които реагират молекулите на ДНК или РНК пробите. Сондите се приготвят, като се използва и двете различни разделиДНК (или РНК), изолирана от естествен източник (например един или друг микроорганизъм), обикновено представена като генетични последователности като част от векторни плазмиди или химически синтезирани олигонуклеотиди. В някои случаи като сонда се използват препарати от геномна ДНК, хидролизирана на фрагменти, понякога РНК препарати, особено често рибозомна РНК. Същите индикатори се използват като етикет, както в различни видовеимунохимичен анализ: радиоактивни изотопи, флуоресцеини, биотоп (с по-нататъшно проявление от авидинензимния комплекс) и др.

Редът на анализа се определя от свойствата на наличната сонда

В момента все повече се използват търговски комплекти, съдържащи всички необходими съставки.

В повечето случаи процедурата за анализ може да бъде разделена на следните етапи: подготовка на пробата (включително екстракция и денатурация на ДНК), фиксиране на пробата върху носител (най-често полимерен мембранен филтър), прехибридизация, самата хибридизация, измиване на несвързаните продукти, откриване. Без стандартно лекарствоДНК или РНК сонда се получава предварително и се маркира.

За подготовката на пробата може да се наложи „отглеждане“ на тестовия материал, за да се идентифицират отделни бактериални колонии или да се увеличи концентрацията на вируси в клетъчна култура. Директен анализ на проби от кръвен серум, урина, профилирани елементикръв или цяла кръвза наличие на инфекциозен агент. За да се освободят нуклеиновите киселини от състава на клетъчните структури, клетките се лизират, а в някои случаи ДНК препаратът се пречиства с помощта на фенол.

Денатурирането на ДНК, т.е. нейният преход към едноверижна форма, възниква по време на обработка с алкали. След това пробата от нуклеинова киселина се фиксира върху нитроцелулозен или найлонов мембранен носител, обикновено чрез инкубиране за 10 минути до 4 часа при 80°C под вакуум. Освен това, в процеса на прехибридизация, се постига инактивиране на свободни свързващи места, за да се намали неспецифичното взаимодействие на сондата с мембраната. Процесът на хибридизация отнема от 2 до 20 часа, в зависимост от концентрацията на ДНК в пробата, концентрацията на използваната проба и нейния размер.

След като хибридизацията приключи и несвързаните продукти се отмият, полученият комплекс се открива. Ако сондата съдържа радиоактивен етикет, тогава мембраната се излага на фотографски филм, за да се прояви реакцията (авторадиография). За други етикети използвайте подходящите процедури.

Най-перспективно е производството на нерадиоактивни (т.нар. студени) сонди. На същата основа се разработва техника за хибридизация, която позволява да се установи наличието на патоген в препарати от срезове, тъканни пункции, което е особено важно при патоморфологичния анализ (хибридизация in situ).

Съществена стъпка в развитието на методите за генно сондиране беше използването на реакцията на полимеразна амплификация (PCR). Този подход позволява да се увеличи концентрацията на специфична (преди известна) ДНК последователност в проба чрез синтезиране на множество копия in vitro. За провеждане на реакцията, ДНК полимеразен ензимен препарат, излишък от деоксинуклеотиди за синтез и така наречените праймери, два вида олигонуклеотиди от 20-25 бази, съответстващи на крайните участъци на интересуващата ни ДНК последователност, се добавят към ДНК проба в процес на изследване. Единият от праймерите трябва да бъде копие на началото на областта на четене на кодиращата ДНК верига в посоката на четене 53, а вторият трябва да бъде копие на противоположния край на некодиращата верига. След това, с всеки цикъл на полимеразната реакция, броят на ДНК копията се удвоява.

За свързването на праймерите се изисква денатуриране на ДНК (топене) при 94°C, последвано от довеждане на сместа до 4055°C.

За провеждане на реакцията са проектирани програмируеми инкубатори за микропроби, за да се редуват лесно температурните промени, които са оптимални за всеки етап от реакцията.

Реакцията на усилване може значително да повиши чувствителността на анализа по време на генното сондиране, което е особено важно при ниски концентрации на инфекциозния агент.

Едно от значителните предимства на генното сондиране с амплификация е възможността за изследване на субмикроскопично количество патологичен материал.

Друга особеност на метода, по-важна за анализа на инфекциозен материал, е възможността за откриване на скрити (тихи) гени. Методите, свързани с използването на генно сондиране, със сигурност ще бъдат по-широко въведени в практиката за диагностициране на инфекциозни заболявания, тъй като стават по-прости и по-евтини.

Методите ELISA и RIF са предимно качествени или полуколичествени. С много ниски концентрациикомпоненти, образуването на комплекс антиген-антитяло не може да се регистрира нито визуално, нито с прости инструментални средства. Индикацията на комплекса антиген антитяло в такива случаи може да се извърши, ако един от първоначалните компоненти антиген или антитяло въведе етикет, който може лесно да бъде открит в концентрации, сравними с концентрацията на аналита, който трябва да се определи.

Радиоактивни изотопи (например 125I), флуоресцентни вещества и ензими могат да се използват като етикет.

В зависимост от използвания етикет има радиоимунни (RIA), флуоресцентни имунни (FIA), ензимен имуноанализ (ELISA) методи за анализ и др. последните годиниширок практическа употребаполучи ELISA, което се свързва с възможността количествени определения, висока чувствителност, специфичност и автоматизация на счетоводството.

ELISA методи за анализ група от методи, които позволяват откриването на комплекс антиген антитяло с помощта на субстрат, който се разцепва от ензим с външен вид на цвят.

Същността на метода се състои в комбинирането на компонентите на реакцията антиген антитяло с измерен ензимен етикет. Антигенът или антитялото, които реагират, се маркират с ензим. Чрез трансформацията на субстрата под действието на ензима може да се прецени количеството на компонента на реакцията антиген-антитяло, който е влязъл във взаимодействието. Ензимът в този случай служи като маркер на имунния отговор и ви позволява да го наблюдавате визуално или инструментално.

Ензимите са много удобни етикети, тъй като техните каталитични свойства им позволяват да действат като подобрители, тъй като една ензимна молекула може да произведе повече от 1 x 105 молекули на каталитичен продукт на минута. Необходимо е да се избере ензим, който запазва своята каталитична активност за дълго време, не я губи при свързване с антиген или антитяло и има висока специфичност по отношение на субстрата.

Основните методи за получаване на антитела или антигени, маркирани с ензим, конюгати: химическо, имунологично и генно инженерство. Най-често за ELISA се използват ензими: пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, галактозидаза и др.

За откриване на активността на ензима в комплекса антиген-антитяло с цел визуално и инструментално отчитане на реакцията се използват хромогенни субстрати, чиито разтвори, първоначално безцветни, в процеса ензимна реакцияпридобиват цвят, чийто интензитет е пропорционален на количеството ензим. По този начин, за откриване на активността на пероксидазата на хрян в твърдофазен ELISA, 5-аминосалициловата киселина се използва като субстрат, който дава интензивен кафяв цвят, ортофенилендиамин, който образува оранжево-жълт цвят. За откриване на активността на алкалната фосфатаза и β-галатозидаза се използват съответно нитрофенилфосфати и нитрофенилгалактозиди.

Резултатът от реакцията при образуването на оцветен продукт се определя визуално или с помощта на спектрофотометър, който измерва абсорбцията на светлина с определена дължина на вълната.

Има много възможности за поставяне на ELISA. Има хомогенни и разнородни варианти.

Според метода на настройка се разграничават конкурентни и неконкурентни ELISA методи. Ако на първия етап в системата присъстват само анализираното съединение и съответните му свързващи центрове (антиген и специфични антитела), тогава методът е неконкурентен. Ако анализираното съединение (антиген) и неговият аналог (ензимно белязан антиген) присъстват на първия етап, конкурирайки се помежду си за свързване към специфичните свързващи центрове (антитела), налични в дефицита, тогава методът е конкурентен. В този случай, колкото повече изследваният антиген съдържа разтвора, толкова по-малко количествосвързване на белязани антигени.

МЕТОД НА ФЛУОРЕСЦЕНТНИ АНТИТЕЛА (MFA) или ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНТНИ РЕАКЦИИ (RIF)

Имунофлуоресцентният метод е методът на избор за бързо откриване и идентифициране на неизвестен микроорганизъм в изследвания материал.

Ag + AT + електролит = UV светещ комплекс

Микробен серум, белязан с флуорохром

Багрилото флуоресцеин изотиоцианат често се използва FITC

В това изследване се използва флуоресцентен микроскоп.

RIF постановка

30 µl от разтвор на антитела, маркирани с FITC, се прилагат към цитонамазката.

Поставете чашата във влажна камера и инкубирайте при стайна температура за 20-25 минути или в термостат при 37°C за 15 минути.

Изплакнете чашата в течаща чешмяна вода за 2 минути, изплакнете с дестилирана вода и изсушете на въздух.

Капка монтираща течност се нанася върху изсъхналото намазка, намазката се покрива с покривно стъкло и се микроскопира с помощта на флуоресцентен микроскоп или флуоресцентна приставка към конвенционален оптичен микроскоп.

в микробиологията

"Реакция на аглутинация и нейните видове (RA)"

план:

1. Въведение………………………………………………………………………………………..3

2. RA върху стъкло……………………………………………………………………………………….4

3. Епруветка PA………………………………………………………………………………….5

4. Използвана литература………………………………………………………………………..7

1. Въведение.

Взаимодействието на микробния антиген и антитела е строго специфично и е насочено в животинския организъм за неутрализиране на патогена и неговите токсини. Взаимодействието на антиген и антитела in vitro при определени условия е придружено от видими явления (аглутинация, утаяване, имунен лизис), което позволява използването на AG-AT реакции, наречени серологични (от латински serum-серум), за практически цели. Биофабриките произвеждат антигени и имунни серуми (антитела) с известна специфична посока (диагностика). С помощта на такива серуми при серологични реакции е възможно да се идентифицира неизвестен микроорганизъм или, като се използва известен антиген, да се открият антитела в тялото, синтезирани в отговор на въвеждането на патоген, и по този начин да се постави диагноза (серологична диагноза) . В допълнение, серологичните реакции могат да се използват за оценка на интензивността на имунния отговор след ваксинация или инфекциозно заболяване.

Реакциите на аглутинация, като непряка аглутинация и Coombs, се основават на in vitro взаимодействието на корпускулните антигени с антителата и способността на получените комплекси да се утаяват. Като корпускулярни антигени се използват бактериални клетки или разтворими антигени, извлечени от микроорганизми и адсорбирани върху корпускули на носители: еритроцити, латексни частици и др.

Антигенните детерминанти на корпускулярните антигени специфично взаимодействат с хомоложни антитела (специфична, невидима фаза на реакцията), след което комплексите антиген-антитяло образуват големи, видими с просто око конгломерати, които се утаяват - аглутинират (неспецифична, видима фаза на реакцията) . В нефлагелирани форми на микроби (Brucella) се образуват гранулирани аглутинанти, в камшичета (Escherichia, Salmonella) - голям памук, който се утаява на дъното на епруветката под формата на обърнат чадър и лесно се чупи при разклащане . Антигените и антителата взаимодействат само в присъствието на електролит (в 0,8% разтвор на натриев хлорид). Ходът на реакцията се влияе от концентрацията на сол в електролита, броя на микробните клетки в суспензията, серумната концентрация, pH, температурата и други фактори.

Реакция на аглутинация (ra).

Разграничете специфичната аглутинация, роят се основава на взаимодействието на антигена схомоложно антитяло , съдържащ се в тялото на животното, Krom е въведен този антиген (имуноаглутинация); неспецифични (химични), произтичащи от промени в pH на околната среда, концентрацията на електролити; спонтанен, to-ruyu се наблюдава, когато бактериите (които са в R-форма) се суспендират във физиологичен разтвор и при нагряване, което е свързано с промяна в колоидното състояние на бактериалната клетка. Антиген , участващи в RA се нарича аглутиноген, антитялото се нарича аглутинин, получената утайка се нарича аглутинат. При образуването на аглутинат има значение количественото съотношение на антигена и антителата (оптимално явление). При излишък или дефицит на антитела, A.

Реакцията на аглутинация (РА) е една от първите имунологични реакции, които се използват в микробиологичната практика. За първи път (1895) F. Vidal използва RA за диагностика на коремен тиф. По-късно (1897 г.) А. Райт използва същата реакция за диагностициране на бруцелоза при хора. РА е намерил приложение и в диагностиката на пулороза на пилета, лептоспироза, инфекциозен аборт на кобили, както и за типизиране на неизвестни култури от микроби според известен аглутиниращ серум. RA е силно чувствителен; той може да открие 0,01 µg азотен протеин на антитяло в 1 ml.

Разработени са няколко варианта на реакцията на аглутинация, които се различават по методологично изпълнение и цел на изследването.

2. Ра върху стъкло.

При този вариант на РА могат да се изследват както серум, така и антиген, но този вариант най-често се използва за идентифициране на микроорганизми.

1. За идентифициране на микроорганизма (m / o), капка от известен аглутиниращ серум, като салмонелиоза, и капка физиологичен разтвор (контрола) се прилагат отделно върху обезмаслено стъкло. След това, използвайки бактериологична примка, бактериалната маса на изследваната култура се взема от колонията в петриево блюдо или от повърхността на наклонената МРА в епруветка и се суспендира отделно в имунен серум и физиологичен разтвор, докато се получи хомогенна суспензия . Резултатът се взема предвид след 2 ... 4 минути.

Отчитане на резултатите: не трябва да има промяна в контролната проба. При специфично съответствие на бактериалната култура с имунния серум се появяват люспи от аглутинат (положителен резултат), при липса на феномен на аглутинация се заключава, че изследваната бактериална култура не съответства на имунния серум.

2. Откриването на антитела в изследвания кръвен серум ще бъде разгледано с помощта на примера на розово-бенгалския тест, използван при серодиагностиката на бруцелоза. 0,3 ml от изследвания животински кръвен серум и 0,03 ml бруцелален антиген (бруцелни клетки, оцветени с розов бенгал) се нанасят върху предметно стъкло. Компонентите се смесват старателно чрез разклащане на чашата и резултатът се отчита след 4 минути.

Счетоводни резултати: при положителна реакция се появяват розови люспи от аглутинат. Серологична реакция от този тип се класифицира като качествена, тъй като може да се използва за откриване на антитела срещу патогена в кръвния серум на животното, но е невъзможно да се оцени тяхното количествено съдържание.