Serodiagnóstico de infecciones virales, reacciones empleadas. Métodos de diagnóstico microbiológico de enfermedades virales. Métodos de aislamiento e identificación de virus. Pruebas serológicas utilizadas para diagnosticar enfermedades virales Las pruebas serológicas se utilizan
infección por VIH
La infección por VIH es una enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), largo tiempo persistente en linfocitos, macrófagos, células tejido nervioso, lo que resulta en un daño lentamente progresivo en el sistema inmunitario y sistemas nerviosos organismo, manifestado por infecciones secundarias, tumores, encefalitis subaguda y otros cambios patológicos.
Patógenos - virus de inmunodeficiencia humana de los tipos t-th y 2nd - VIH-1, VIH-2 (VIH-I, VIH-2, virus de inmunodeficiencia humana, tipos I, 11) - pertenecen a la familia de los retrovirus, una subfamilia de virus lentos. Los viriones son partículas esféricas con un diámetro de 100-140 nm. La partícula viral tiene una capa exterior de fosfolípidos, que incluye glicoproteínas (proteínas estructurales) con un cierto peso molecular, medido en kilodaltons. En el VIH-1, estos son gp 160, gp 120, gp 41. La envoltura interna del virus que cubre el núcleo también está representada por proteínas con un peso molecular conocido: p 17, p 24, p 55 (el VIH-2 contiene gp 140, gp 105, gp 36, p 16, p 25, p 55).
El genoma del VIH contiene ARN y la enzima transcriptasa inversa (revertasa). Para que el genoma del retrovirus se conecte con el genoma de la célula huésped, primero se sintetiza el ADN en la plantilla de ARN viral usando reversatasa. A continuación, el ADN del provirus se integra en el genoma de la célula huésped. El VIH tiene una variabilidad antigénica pronunciada, que supera significativamente la del virus de la gripe.
En el cuerpo humano, el objetivo principal del VIH son los linfocitos T que transportan en la superficie el numero mas grande receptores CD4. Después de que el VIH ingresa a la célula con la ayuda de la reversa, el virus sintetiza ADN basado en el patrón de su ARN, que se integra en el aparato genético de la célula huésped (linfocitos T) y permanece allí de por vida en el estado de un provirus. . Además de los ayudantes de linfocitos T, se ven afectados los macrófagos y los linfocitos B. células neurogliales, mucosa intestinal y algunas otras células. La razón de la disminución del número de linfocitos T (células CD4) no es solo el efecto citopático directo del virus, sino también su fusión con células no infectadas. Junto con la derrota de los linfocitos T en pacientes con infección por VIH, se observa una activación policlonal de los linfocitos B con un aumento en la síntesis de inmunoglobulinas de todas las clases, especialmente IgG e IgA, y el posterior agotamiento de esta sección. sistema inmunitario. Desregulación procesos inmunes también se manifiesta por un aumento en el nivel de alfa-interferón, beta-2-microglobulina y una disminución en el nivel de interleucina-2. Como resultado de la disfunción del sistema inmunológico, especialmente con una disminución en el número de linfocitos T (CD4) a 400 o menos células por 1 μl de sangre, surgen condiciones para la replicación incontrolada del VIH con un aumento significativo en el número de viriones. en varios ambientes del cuerpo. Como resultado de la derrota de muchas partes del sistema inmunológico, una persona infectada con el VIH se vuelve indefensa contra los patógenos de diversas infecciones. En el vestíbulo del aumento de la inmunosupresión, se desarrollan enfermedades progresivas graves que no ocurren en una persona con un sistema inmunitario que funciona normalmente. La OMS definió estas enfermedades como marcador (indicador) del SIDA.
El primer grupo: enfermedades que son inherentes solo a la inmunodeficiencia grave (nivel de CD4 por debajo de 200). El diagnóstico clínico se realiza en ausencia de anticuerpos anti-VIH o antígenos del VIH.
El segundo grupo: enfermedades que se desarrollan tanto en el contexto inmunodeficiencia severa, y en algunos casos sin ella. Por lo tanto, en tales casos, es necesaria la confirmación de laboratorio del diagnóstico.
2. Reacciones serológicas Se utiliza para diagnosticar infecciones virales.
Métodos serológicos, es decir, métodos para estudiar anticuerpos y antígenos utilizando reacciones antígeno-anticuerpo determinadas en suero sanguíneo y otros fluidos, así como en tejidos corporales. La detección de anticuerpos contra los antígenos del patógeno en el suero sanguíneo del paciente permite diagnosticar la enfermedad. Los estudios serológicos también se utilizan para identificar antígenos microbianos, diversas sustancias biológicamente activas, grupos sanguíneos, antígenos tisulares y tumorales, inmunocomplejos, receptores celulares, etc. Cuando se aísla un microbio de un paciente, se identifica el patógeno estudiándolo. propiedades antigénicas utilizando sueros de inmunodiagnóstico, es decir, sueros sanguíneos de animales hiperinmunizados que contienen anticuerpos específicos. Esta es la llamada identificación serológica de microorganismos. Las características de la interacción de un anticuerpo con un antígeno son la base de las reacciones de diagnóstico en los laboratorios. La reacción in vitro entre un antígeno y un anticuerpo consta de una fase específica y otra no específica. La unión específica rápida se produce en la fase específica. centro activo anticuerpos con un antígeno determinante. Luego viene la fase inespecífica - más lenta, que se manifiesta por fenómenos físicos visibles, como la formación de escamas (fenómeno de aglutinación) o precipitado en forma de turbidez. Esta fase requiere ciertas condiciones (electrolitos, pH óptimo del medio). La unión de un determinante de antígeno (epítopo) al sitio activo de un fragmento Fab de anticuerpo se debe a las fuerzas de van der Waals, los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. La fuerza y la cantidad de antígeno unido por los anticuerpos dependen de la afinidad, la avidez de los anticuerpos y su valencia.
3. Los agentes causales de la malaria. paludismo - antroponótico enfermedad infecciosa, causada por varias especies de protozoos del género Plasmodium, transmitida por mosquitos (Anopheles), acompañada de fiebre, anemia, agrandamiento del hígado y del bazo. Los agentes causantes de la malaria pertenecen a los protozoos, el filo Apicomplexa, la clase Sporozoa y la especie Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.
Epidemiología. La fuente de infección es una persona infestada; el portador es un mosquito hembra del género Anopheles. El principal mecanismo de transmisión es transmisible, a través de la picadura de un mosquito hembra infestado.
Tratamiento y prevención. Los medicamentos antipalúdicos tienen diferentes efectos en las etapas asexuales y sexuales de Plasmodium. Los principales medicamentos antipalúdicos incluyen quinina, cloroquina, quinacrina, primaquina, quinocida, bigumal, cloridina, etc. Acciones preventivas dirigido a la fuente del patógeno (tratamiento de pacientes con malaria y portadores) y la destrucción de los portadores del patógeno: los mosquitos. Se están desarrollando métodos de vacunación basados en antígenos obtenidos por ingeniería genética.
1. Clasificación de los antibióticos por estructura química, mecanismo, espectro y tipo de acción.De acuerdo con la química. estructura Clase 1 - B-lactámicos - penicilina, cefalosporina. Clase 2 - macrólidos - eritromicina, azitromicina. Clase 3 - aminoglucósidos - estreptomicina, kanamicina. Clase 4 - tetraciclinas - oxitetraciclina, doxiciclina. 5 células - polipéptidos - polimixina. 6 células - polien- nistatina 7kl-anzamicina-rifampicina .
2. Según el mecanismo de acción, se distinguen cinco grupos de antibióticos: Antibióticos de 1.gr que interrumpen la síntesis de la pared celular - β-lactámicos. 2.gr antibióticos que alteran la organización y síntesis molecular membranas celulares- polimixinas, polienos 3.gr antibióticos que interrumpen la síntesis de proteínas - aminoglucósidos, tetraciclinas, macrólidos, cloranfenicol 4.gr antibióticos - inhibidores de la síntesis ácidos nucleicos- quinolonas interrumpen la síntesis de ADN, rifampicina - síntesis de ARN; 5.gr antibióticos que inhiben la síntesis de purinas y aminoácidos - sulfonamidas Según el espectro de acción, los antibióticos se dividen en cinco grupos, según a qué microorganismos afectan. Cada uno de estos grupos incluye dos subgrupos: antibióticos de amplio espectro y de estrecho espectro.1gr. Los antibióticos antibacterianos constituyen el grupo más grande de medicamentos.
a) antibióticos una amplia gama las acciones afectan a representantes de las tres divisiones de bacterias: aminoglucósidos, tetraciclinas, etc.
b) Los antibióticos de espectro reducido son efectivos contra una pequeña variedad de bacterias: las mixinas de vuelo actúan sobre los gracilicutes, la vancomicina afecta a las bacterias grampositivas.
2gr - Medicamentos antituberculosos, antileprosos, antisifilíticos.
3. Antibióticos antimicóticos.
a) La anfotericina B tiene un amplio espectro de acción, eficaz en candidiasis, blastomicosis, aspergilosis; al mismo tiempo
b) un antibiótico de espectro reducido.- la nistatina, que actúa sobre hongos del género Candida, es
4. Los antibióticos antiprotozoarios y antivirales tienen una pequeña cantidad de medicamentos.
5. Antibióticos antitumorales: medicamentos que tienen un efecto citotóxico. La mayoría de ellos se usan en muchos tipos de tumores: mitomicina C. La acción de los antibióticos sobre los microorganismos está asociada con su capacidad para suprimir ciertas reacciones bioquímicas que ocurren en la célula microbiana.
2. Teorías de la inmunidad.1. Teoría de la inmunidad Mechnikov: la fagocitosis juega un papel decisivo en la inmunidad antibacteriana. II Mechnikov fue el primero en considerar la inflamación como un fenómeno protector más que destructivo. El científico llamó a las células de defensa que actúan de esta manera "células devoradoras". Sus jóvenes colegas franceses sugirieron usar raíces griegas del mismo significado. II Mechnikov aceptó esta opción y apareció el término "fagocito". 2. Teoría de la inmunidad Ehrlich es una de las primeras teorías de formación de anticuerpos, según la cual las células tienen receptores específicos de antígeno que se liberan como anticuerpos bajo la acción de un antígeno. Ehrlich llamó a las sustancias sanguíneas antimicrobianas "anticuerpos". P. Ehrlich se dio cuenta de que incluso antes del contacto con un microbio específico, el cuerpo ya tiene anticuerpos en la forma que él llamó "cadenas laterales": estos son receptores de antígenos de linfocitos. Entonces Ehrlich "aplicó" a la farmacología: en su teoría de la quimioterapia, asumió la preexistencia de receptores en el cuerpo para sustancias medicinales. En 1908, P. Erlich fue premiado premio Nobel para la teoría humoral de la inmunidad. 3. La teoría de la inmunidad de Bezredka- una teoría que explica la protección del cuerpo contra una serie de enfermedades infecciosas por la aparición de inmunidad celular local específica a los patógenos. 4. Teorías instructivas inmunidad - el nombre general de las teorías de formación de anticuerpos, según el cual el papel principal en la respuesta inmune se le da al antígeno, que está directamente involucrado como matriz en la formación de una configuración específica del antideterminante o actúa como un factor que cambia direccionalmente la biosíntesis de inmunoglobulinas por células plasmáticas.
3. El agente causal del botulismo. género Clostridium especie Clostridium botulinum causa botulismo - intoxicación alimentaria, caracterizada por daño al sistema nervioso central. La enfermedad ocurre como resultado de comer alimentos que contienen toxinas C. Botulinum, bacilos grampositivos con extremos redondeados. Tiene forma de raqueta de tenis. No forme una cápsula. Móvil. anaerobios obligados. Según las propiedades antigénicas de las cuales se dividen en 7 serovares. La exotoxina botulínica, el más poderoso de todos los venenos biológicos, tiene un efecto neurotóxico (la dosis letal para los humanos es de aproximadamente 0,3 microgramos). Diagnóstico microbiológico. Detección e identificación de toxina botulínica en el material de prueba mediante la reacción de hemaglutinación indirecta inversa (RONHA), la reacción de neutralización de la toxina con antitoxina (suero antitóxico) en animales de laboratorio. Método bacteriológico para la detección de un patógeno en el material de ensayo. profilaxis específica. Los toxoides botulínicos A, B, E forman parte de la sextanatoxina, utilizados según indicaciones. Para la profilaxis pasiva de emergencia, es posible utilizar sueros antitóxicos antibotulínicos. Tratamiento. Se utilizan sueros heterólogos anti-botulínicos antitóxicos e inmunoglobulinas homólogas.
cultivo. En agar sangre forma pequeñas colonias transparentes rodeadas por una zona de hemólisis. resistencia. Las esporas de C. botulinum tienen una resistencia muy alta a las altas temperaturas.
Epidemiología. Desde el suelo entra el bacilo botulínico productos alimenticios donde se multiplica y libera exotoxina. La vía de transmisión de la infección es la comida. Muy a menudo, los alimentos enlatados (champiñones, vegetales, carne, pescado) son un factor en la transmisión de la infección. La enfermedad no se transmite de persona a persona. Patogénesis. La toxina botulínica se ingiere a través de los alimentos. tubo digestivo. Resistente a la acción de las enzimas digestivas, la toxina se absorbe a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo y provoca una toxemia prolongada. La toxina se une a las células nerviosas y bloquea la transmisión de impulsos a través de sinapsis neuromusculares. Como resultado, se desarrolla la parálisis de los músculos de la laringe, la faringe y los músculos respiratorios, lo que conduce a problemas para tragar y respirar, se observan cambios en los órganos de la visión. cuadro clinico. Periodo de incubación dura de 6-24 horas a 2-6 días. Cuanto más corto es el período de incubación, más grave es la enfermedad. Por lo general, la enfermedad comienza de forma aguda, pero la temperatura corporal permanece normal. Son posibles varias variantes de botulismo, con predominio de síntomas de daño en el tracto digestivo, trastornos visuales o función respiratoria. En el primer caso, la enfermedad comienza con la aparición de boca seca, náuseas, vómitos y diarrea. En el segundo, las primeras manifestaciones de la enfermedad se asocian con discapacidad visual (el paciente se queja de "niebla" ante los ojos y visión doble). Como resultado de la parálisis de los músculos de la laringe, aparece ronquera y luego desaparece la voz. Los pacientes pueden morir de parálisis respiratoria. La enfermedad puede empeorar neumonía aguda, miocarditis tóxica, sepsis. La mortalidad en el botulismo es del 15-30%. Inmunidad. no se forma. Los anticuerpos que se producen durante el curso de una enfermedad se dirigen contra un serovariedad específico.
1.Métodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos. 1) Método de difusión en agar. El microbio estudiado se inocula en medio nutritivo de agar y luego se agregan antibióticos. las preparaciones se introducen en pozos especiales en agar o se colocan discos con antibióticos en la superficie de la semilla (el "método del disco"). Los resultados se registran en un día por la presencia o ausencia de crecimiento microbiano alrededor de los agujeros (discos). 2) Métodos de determinación. nivel mínimo de antibiótico, que permite in vitro prevenir el crecimiento visible de microbios en el medio nutritivo o esterilizarlo completamente. A) Determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos mediante el método del disco. El cultivo bacteriano estudiado se inocula con césped en agar nutritivo o medio AGV en placa Petri B) Medio AGV: caldo de pescado nutritivo seco, agar-agar, fosfato de sodio disustituido. C) Se colocan discos de papel que contienen ciertas dosis de diferentes antibióticos sobre la superficie sembrada con pinzas a la misma distancia entre sí. Los cultivos se incuban a 37°C hasta el día siguiente. Según el diámetro de las zonas de inhibición del crecimiento del cultivo bacteriano estudiado, se juzga su sensibilidad a los antibióticos.
D) Determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos por el método de diluciones seriadas. determinar la concentración mínima del antibiótico que inhibe el crecimiento del cultivo bacteriano estudiado.
E) La evaluación de los resultados de determinar la sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos se lleva a cabo de acuerdo con una tabla especial preparada, que contiene los valores límite de los diámetros de las zonas de inhibición del crecimiento para cepas resistentes, moderadamente resistentes y sensibles, como así como los valores de MIC de antibióticos para cepas resistentes y sensibles. 3) Determinación de un antibiótico en sangre, orina y otros fluidos del cuerpo humano. Se colocan dos filas de tubos de ensayo en una gradilla. En uno de ellos se preparan diluciones del antibiótico de referencia, en el otro, el líquido de prueba. Luego, se agrega a cada tubo de ensayo una suspensión de bacterias de prueba preparada en medio Hiss con glucosa. Cuando se determina penicilina, tetraciclinas, eritromicina en el líquido de prueba, se usa una cepa estándar de S. aureus como bacteria de prueba, y cuando se determina estreptomicina, se usa E. coli. Después de la incubación de las inoculaciones a 37 °C durante 18-20 horas, se anotan los resultados del experimento sobre la turbidez del medio y su tinción con un indicador debido a la descomposición de la glucosa por las bacterias de ensayo. La concentración de antibiótico se determina multiplicando la dilución más alta del líquido de prueba que inhibe el crecimiento de bacterias de prueba por la concentración mínima del antibiótico de referencia que inhibe el crecimiento de las mismas bacterias de prueba. Por ejemplo, si la dilución máxima del líquido de prueba que inhibe el crecimiento de bacterias de prueba es 1:1024, y la concentración mínima del antibiótico de referencia que inhibe el crecimiento de las mismas bacterias de prueba es 0,313 µg/ml, entonces el producto de 1024-0.313=320 µg/ml es la concentración de antibiótico en 1 ml.
4) Determinación de la capacidad de S. aureus para producir beta-lactamasas. En un matraz con 0,5 ml de un caldo de cultivo diario de una cepa estándar de estafilococo sensible a la penicilina, agregar 20 ml de agar nutritivo fundido y enfriado a 45 °C, mezclar y verter en una placa de Petri. Después de que el agar se ha solidificado, se coloca un disco que contiene penicilina en el centro del plato sobre la superficie del medio. Las culturas estudiadas se siembran a lo largo de los radios del disco con un bucle. Las inoculaciones se incuban a 37 °C hasta el día siguiente, después de lo cual se anotan los resultados del experimento. La capacidad de las bacterias estudiadas para producir beta-lactamasa se juzga por la presencia de crecimiento de una cepa estándar de estafilococos alrededor de uno u otro de los cultivos estudiados (alrededor del disco).
2. Trastornos del sistema inmunitario: inmunodeficiencias primarias y secundarias.Inmunodeficiencias son trastornos del estado inmunitario normal causados por un defecto en uno o más mecanismos de respuesta inmunitaria Inmunodeficiencias primarias o congénitas Los trastornos del sistema inmunitario pueden afectar tanto a los principales enlaces específicos en el funcionamiento del sistema inmunitario, así como factores que determinan resistencias inespecíficas. Son posibles variantes combinadas y selectivas de trastornos inmunitarios. Según el nivel y la naturaleza de los trastornos, se distinguen inmunodeficiencias humorales, celulares y combinadas.
Causas: duplicación de cromosomas, mutaciones puntuales, defecto en las enzimas del metabolismo de los ácidos nucleicos, trastornos de membrana determinados genéticamente, daño del genoma en el período embrionario, etc. Las inmunodeficiencias primarias aparecen en las primeras etapas del período posnatal y se heredan de forma autosómica recesiva. Manifestaciones- insuficiencia de fagocitosis, sistema del complemento, inmunidad humoral (sistema B), inmunidad celular (sistema T). Inmunodeficiencias secundarias o adquiridas Las inmunodeficiencias secundarias, a diferencia de las primarias, se desarrollan en individuos con un sistema inmunitario que funciona normalmente desde el nacimiento. Se forman bajo la influencia del medio ambiente a nivel de fenotipo y son causados por una violación de la función del sistema inmunológico como resultado de diversas enfermedades o efectos adversos en el cuerpo. Son afectados los T- y B-sistemas de la inmunidad, los factores de la resistencia no específica, también son posibles sus combinaciones. Las inmunodeficiencias secundarias son mucho más comunes que las primarias. Las inmunodeficiencias secundarias son susceptibles de inmunocorrección,
Las inmunodeficiencias secundarias pueden ser:
después de infecciones (especialmente virales) e invasiones (protozoarias y helmintiasis);
con enfermedad de quemaduras;
con uremia; con tumores;
con trastornos metabólicos y agotamiento;
con disbiosis;
en heridas graves, operaciones quirúrgicas extensas, especialmente realizadas bajo anestesia general; cuando se irradia, la acción de los productos químicos;
con el envejecimiento,
medicamentos asociados con la toma de medicamentos.
Según clínica El flujo se distingue: 1) compensado, - mayor susceptibilidad del cuerpo a los agentes infecciosos. 2) subcompensado - cronización de procesos infecciosos.
3) descompensado: infecciones generalizadas causadas por microbios oportunistas (OPM) y neoplasias malignas.
3. El agente causal de la amebiasis. Taxonomía. Característica. Diagnóstico microbiológico. tratamiento específico. La amebiasis es una enfermedad infecciosa causada por Entamoeba histolytica, acompañada de lesiones ulcerativas del colon; posible formación de abscesos en varios órganos; corre crónicamente. Protozoos, filo Sarcomastidophora, subfilo Sarcodina.
Morfología y cultivo. El patógeno existe en dos etapas de desarrollo: vegetativo y quístico. El estadio vegetativo tiene varias formas (tejido, vegetativo grande, luminal y prequístico). El quiste (etapa de reposo) tiene forma ovalada, se forma a partir de formas vegetativas en el intestino. La infección ocurre cuando los quistes del patógeno ingresan al intestino, donde forman formas vegetativas intestinales.
resistencia. Fuera del cuerpo, el tejido y las formas luminales del patógeno mueren rápidamente (después de 30 minutos). Los quistes son estables en el medio ambiente, permaneciendo en heces y agua a una temperatura de 20ºС durante un mes. En los alimentos, en verduras y frutas, los quistes persisten durante varios días.
mecanismo de transferencia - fecal-pero-oral. La infección ocurre cuando los quistes se introducen con alimentos, especialmente verduras y frutas, con menos frecuencia con agua, a través de artículos para el hogar. Las moscas y las cucarachas contribuyen a la propagación de los quistes.
Patogenia y cuadro clínico. Los quistes que han ingresado a los intestinos y las formas de amebas formadas por el lumen pueden vivir en él sin causar enfermedad. Con una disminución en la resistencia del cuerpo, la ameba penetra en la pared intestinal y se multiplica. Desarrollando amebiasis intestinal. Algunos representantes de la microflora intestinal contribuyen a este proceso. El colon superior se ve afectado con la formación de úlceras, a veces el recto. Hay heces sueltas frecuentes. En las heces, se encuentran elementos purulentos y moco. Puede ocurrir una perforación pared intestinal con el desarrollo de peritonitis purulenta. Las amebas con flujo sanguíneo pueden ingresar al hígado, los pulmones y el cerebro; se desarrolla amebiasis extraintestinal. Quizás la aparición de amebiasis cutánea, que se desarrolla como resultado de un proceso secundario. Se forman erosiones y úlceras indoloras en la piel de la región perianal, perineo y glúteos. Inmunidad. Con la amebiasis, la inmunidad es inestable. Tratamiento y prevención. Los siguientes medicamentos se usan en el tratamiento: actúan sobre las amebas ubicadas en la luz intestinal (derivados de oxiquinolina - quiniofon, enteroseptol, mexaform, intestopan, así como compuestos de arsénico - aminarson, osarsol, etc.); actuando sobre formas tisulares de amebas (preparados de emetina); actuando sobre las formas translúcidas de amebas y amebas localizadas en la pared intestinal (tetraciclinas); actuando sobre las amebas en cualquiera de sus localizaciones (derivados de imidazol - metronidazol). Prevención la amebiasis se asocia con la identificación y el tratamiento de excretores quísticos y portadores de amebas.
Diagnóstico microbiológico. El método principal es un examen microscópico de las heces del paciente, así como el contenido de los abscesos de los órganos internos. Los frotis se tiñen con solución de Lugol o hematoxilina para identificar quistes y trofozoítos. Método serológico: RIGA, ELISA, RSK, etc. El título de anticuerpos más alto se detecta en la amebiasis extraintestinal.
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Diagnóstico de laboratorio
UDC-078
Diagnóstico de laboratorio de infecciones virales
N. N. Nosik, V. M. stajánov
Instituto de Virología. D.I. Ivanovsky RAMS, Moscú
Diagnóstico de laboratorio de infecciones virales
N. N. Nosik, V. M. Stachanova
Introducción
La ampliación de oportunidades en el tratamiento y prevención de enfermedades virales con el uso de medicamentos antivirales, inmunomoduladores y vacunas con diversos mecanismos de acción requiere diagnósticos de laboratorio rápidos y precisos. La estrecha especificidad de algunos antivirales también requiere un diagnóstico rápido y altamente específico del agente infeccioso. Había una necesidad de métodos cuantitativos para la detección de virus para monitorear la terapia antiviral. Además de establecer la etiología de la enfermedad, el diagnóstico de laboratorio es importante para organizar medidas antiepidémicas.
El diagnóstico temprano de los primeros casos de infecciones epidémicas permite la implementación oportuna de medidas antiepidémicas: cuarentena, hospitalización, vacunación, etc. La implementación de programas para eliminar enfermedades infecciosas, como la viruela, ha demostrado que a medida que se implementan, el papel de aumenta el diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de laboratorio juega un papel esencial al servicio de la sangre y práctica obstétrica como la identificación de donantes infectados virus de inmunodeficiencia humana(VIH), virus de la hepatitis B (VHB), diagnóstico de rubéola e infección por citomegalovirus en mujeres embarazadas.
Métodos de diagnóstico
Existen tres enfoques principales para el diagnóstico de laboratorio de infecciones virales (Tabla 1, Tabla 2):
1) examen directo del material para detectar la presencia de un antígeno viral o ácidos nucleicos;
2) aislamiento e identificación del virus a partir de material clínico;
3) diagnóstico serológico, basado en el establecimiento de un aumento significativo de anticuerpos virales durante el curso de la enfermedad.
Con cualquier enfoque elegido para el diagnóstico viral, uno de los factores más importantes es la calidad del material de prueba. Así, por ejemplo, para el análisis directo de una muestra o para el aislamiento de un virus, el material de prueba debe obtenerse al comienzo de la enfermedad, cuando el patógeno todavía se excreta en relativamente poco tiempo. grandes cantidades y aún no se une a los anticuerpos, y el volumen de la muestra debe ser suficiente para el análisis directo. También es importante elegir el material de acuerdo con la supuesta enfermedad, es decir, el material en el que, en función de la patogenia de la infección, la probabilidad de presencia del virus es mayor.
El entorno en el que se toma el material, cómo se transporta y cómo se almacena juega un papel importante en el diagnóstico exitoso. Entonces, hisopos nasofaríngeos o rectales, el contenido de las vesículas se coloca en un medio que contiene una proteína que evita la pérdida rápida de la infectividad del virus (si se planea el aislamiento), o en un tampón apropiado (si se planea trabajar con ácidos nucleicos). ).
Métodos directos para el diagnóstico de material clínico
Los métodos directos son métodos que permiten la detección de un virus, antígeno viral o ácido nucleico(NC) directamente en el material clínico, es decir, son los más rápidos (2-24 horas). Sin embargo, debido a una serie de características de los patógenos, los métodos directos tienen sus limitaciones (la posibilidad de obtener resultados falsos positivos y falsos negativos). Por lo tanto, a menudo requieren confirmación por métodos indirectos.
Microscopía electrónica (ME). Con este método, puede detectar el virus real. Para una detección exitosa del virus, su concentración en la muestra debe ser de aproximadamente 1·10 6 partículas por 1 ml. Pero dado que la concentración del patógeno, por regla general, en el material de los pacientes es insignificante, la búsqueda del virus es difícil y requiere su precipitación preliminar mediante centrifugación de alta velocidad seguida de tinción negativa. Además, EM no permite tipificar virus, ya que muchos de ellos no presentan diferencias morfológicas dentro de la familia. Por ejemplo, los virus herpes simplex, citomegalovirus o herpes zoster son morfológicamente prácticamente indistinguibles.
Una de las variantes de EM utilizada con fines de diagnóstico es microscopía electrónica inmune(IEM), en el que se utilizan anticuerpos específicos contra virus. Como resultado de la interacción de los anticuerpos con los virus, se forman complejos que, después de la tinción negativa, se detectan más fácilmente.
IEM es algo más sensible que EM y se usa cuando el virus no se puede cultivar. in vitro, por ejemplo, al buscar patógenos de hepatitis viral.
Reacción de inmunofluorescencia (RIF). El método se basa en el uso de anticuerpos unidos a un colorante, como el isotiocianato de fluoresceína. RIF se usa ampliamente para detectar antígenos virales en el material de los pacientes y para un diagnóstico rápido.
En la práctica, se utilizan dos variantes del RIF: derecho y indirecto. En el primer caso, se utilizan anticuerpos contra virus marcados con tinte, que se aplican a las células infectadas (frotis, cultivo celular). Por lo tanto, la reacción procede en un solo paso. El inconveniente del método es la necesidad de tener un gran conjunto de sueros conjugados específicos para muchos virus.
En la variante indirecta del RIF, se aplica un suero específico al material de prueba, cuyos anticuerpos se unen al antígeno viral presente en el material, y luego el suero antiespecie se aplica en capas a las gammaglobulinas del animal en el que se encuentran. se preparó el suero inmune específico, por ejemplo, anti-conejo, anti-caballo, etc. Ventaja La variante indirecta de RIF consiste en la necesidad de un solo tipo de anticuerpo marcado.
El método RIF se usa ampliamente para descifrar rápidamente la etiología de las infecciones virales respiratorias agudas en el análisis de frotis-huellas de la membrana mucosa de la parte superior tracto respiratorio. El uso exitoso de RIF para la detección directa de un virus en material clínico solo es posible si contiene una cantidad suficientemente grande de células infectadas y una contaminación insignificante por microorganismos que pueden producir luminiscencia inespecífica.
Inmunoensayo enzimático (ELISA). Los métodos de inmunoensayo enzimático para la determinación de antígenos virales son, en principio, similares a RIF, pero se basan en el marcaje de anticuerpos con enzimas en lugar de colorantes. La peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina son las más utilizadas, también se utilizan la β-galactosidasa y las β-lactamasas. Los anticuerpos marcados se unen al antígeno y dicho complejo se detecta agregando un sustrato para la enzima a la que se conjugan los anticuerpos. El producto final de la reacción puede ser en forma de precipitado insoluble, y luego se realiza el recuento con un microscopio óptico convencional, o en forma de producto soluble, que suele ser coloreado (o puede ser fluorescente o luminiscente) y grabado instrumentalmente.
Dado que los antígenos solubles se pueden medir mediante ELISA, no se necesitan células intactas en la muestra y, por lo tanto, se pueden usar varios tipos de material clínico.
Otra ventaja importante del método ELISA es la capacidad de cuantificar antígenos, lo que permite utilizarlo para evaluar curso clínico enfermedad y eficacia de la quimioterapia. ELISA, como RIF, se puede utilizar tanto en forma directa como indirecta.
ELISA en fase sólida, que da un producto de reacción coloreado soluble, ha encontrado la mayor distribución. ELISA se puede usar tanto para determinar el antígeno (luego se aplican los anticuerpos a la fase sólida, el fondo del pocillo de la placa de poliestireno) como para determinar los anticuerpos (luego se aplican los antígenos a la fase sólida).
Radioinmunoensayo (RIA) . El método se basa en el marcaje de anticuerpos con radioisótopos, lo que asegura una alta sensibilidad en la determinación del antígeno viral. El método se generalizó en la década de 1980, especialmente para la determinación de marcadores de VHB y otros virus no cultivables. Las desventajas del método incluyen la necesidad de trabajar con sustancias radiactivas y el uso de equipos costosos (contadores gamma).
Métodos moleculares. Inicialmente, el método altamente específico de hibridación de NA se consideró un método clásico para detectar el genoma viral, pero ahora el aislamiento de genomas de virus usando reacción en cadena de la polimerasa(PCR).
Hibridación molecular de ácidos nucleicos. El método se basa en la hibridación de cadenas complementarias de ADN o ARN con la formación de estructuras de doble cadena y su detección mediante un marcador. Para ello se utilizan sondas especiales de ADN o ARN, marcadas con un isótopo (32 P) o biotina, que detectan cadenas complementarias de ADN o ARN. Hay varias variantes del método: - hibridación puntual: se aplica NA aislado y desnaturalizado a los filtros y luego se agrega una sonda marcada; indicación de resultados - autorradiografía usando 32 R o tinción - con avidina-biotina; - hibridación por transferencia - un método para aislar fragmentos de NA cortados por endonucleasas de restricción del ADN total y transferidos a filtros de nitrocelulosa y probados con sondas marcadas; utilizado como prueba de confirmación de la infección por VIH; – hibridación en el lugar– permite determinar NK en células infectadas.
PCR basado en el principio de la replicación natural del ADN. La esencia del método consiste en la repetición repetida de ciclos de síntesis (amplificación) de una secuencia de ADN específica del virus utilizando una polimerasa de ADN Taq termoestable y dos cebadores específicos, los llamados cebadores.
Cada ciclo consta de tres etapas con diferentes condiciones de temperatura. En cada ciclo, se duplica el número de copias de la región sintetizada. Los fragmentos de ADN recién sintetizados sirven como molde para la síntesis de nuevas hebras en el siguiente ciclo de amplificación, lo que permite acumular un número suficiente de copias de la región de ADN seleccionada en 25-35 ciclos para su determinación, generalmente mediante gel de agarosa. electroforesis
El método es altamente específico y muy sensible. Le permite detectar múltiples copias de ADN viral en el material de prueba. EN últimos años La PCR se utiliza cada vez más para el diagnóstico y seguimiento de infecciones víricas (virus de la hepatitis, herpes, citomegalovirus, papilomas, etc.).
Se ha desarrollado una variante de PCR cuantitativa que permite determinar el número de copias del sitio de ADN amplificado. La técnica es compleja, costosa y aún no suficientemente unificada para su uso rutinario.
métodos citológicos actualmente tienen un valor diagnóstico limitado, pero aún deben usarse en varias infecciones. Se examinan materiales de autopsia, biopsias, frotis que, después del procesamiento apropiado, se tiñen y analizan bajo un microscopio. En la infección por citomegalovirus, por ejemplo, en secciones de tejido o en la orina, se encuentran células gigantes características, "ojo de búho", con rabia, inclusiones en el citoplasma de las células (cuerpos de Babes-Negri). En algunos casos, por ejemplo, en el diagnóstico diferencial de la hepatitis crónica, es importante la valoración del estado del tejido hepático.
Índice de materias de la asignatura "Métodos de detección de virus. Métodos de diagnóstico de micosis (enfermedades fúngicas). Métodos de detección de protozoos.":Métodos serológicos para el diagnóstico de infecciones virales. Inhibición de la hemaglutinación. Inhibición del efecto citopático por interferencia viral. Inmunofluorescencia directa. Microscopía inmunoelectrónica.
con la mayoria infecciones virales desarrollar reacciones inmunitarias aplicado a diagnóstico. Las respuestas celulares suelen evaluarse en pruebas de citotoxicidad de los linfocitos frente a agentes infecciosos o células diana infectadas por ellos, o la capacidad de los linfocitos para responder a diversos antígenos y mitógenos. En el trabajo de los laboratorios prácticos, rara vez se determina la gravedad de las reacciones celulares. Los métodos para identificar los AT antivirales se han generalizado.
RN se basa en supresión del efecto citopatógeno después de mezclar el virus con AT específico. El virus desconocido se mezcla con antisueros comerciales conocidos y, después de una incubación adecuada, se introduce en la monocapa celular. La ausencia de muerte celular indica un desajuste entre el agente infeccioso y los anticuerpos conocidos.
Inhibición de la hemaglutinación
RTGA se utiliza para identificar virus capaz de aglutinar varios eritrocitos. Para ello, el medio de cultivo que contiene el patógeno se mezcla con un antisuero comercial conocido y se introduce en el cultivo celular. Después de la incubación, se determina la capacidad de hemaglutinación del cultivo y, en su ausencia, se llega a una conclusión sobre el desajuste del virus con el antisuero.
Inhibición del efecto citopático por interferencia del virus.
La reacción de inhibición del efecto citopático debido a la interferencia de virus. Se utiliza para identificar un patógeno que interfiere con un virus citopatogénico conocido en un cultivo de células sensibles. Para ello, se introduce un suero comercial (por ejemplo, al virus de la rubéola si se sospecha) en el medio de cultivo que contiene el virus en estudio, se incuba e infecta el segundo cultivo; después de 1-2 días, se le introduce un virus citopatogénico conocido (por ejemplo, cualquier virus ECHO). En presencia de un efecto citopatogénico, se concluye que el primer cultivo estaba infectado con un virus correspondiente al AT aplicado.
Inmunofluorescencia directa
Entre otras pruebas, la más utilizada reacción de inmunofluorescencia directa(el más rápido, más sensible y reproducible). Por ejemplo, la identificación de CMV por su efecto citopatogénico requiere al menos 2-3 semanas, y cuando se utilizan anticuerpos monoclonales marcados, la identificación es posible después de 24 horas.Examinar mediante microscopía de fluorescencia (permite detectar la presencia de fluorescencia de las células infectadas) .
Microscopía inmunoelectrónica
Microscopía inmunoelectrónica(similar al método anterior) le permite identificar diferentes tipos virus detectados por microscopía electrónica (por ejemplo, varios tipos de herpesvirus), lo que no se puede hacer en función de las características morfológicas. Se utilizan antisueros marcados en lugar de antisueros para la identificación. diferentes caminos AT, pero la complejidad y el alto costo del método limitan su aplicación.
PARA DIAGNÓSTICO enfermedades virales solicitar siguientes métodos:
1) Viroscópico.
2) Microscopía inmunoelectrónica.
3) Virológico.
4) Serológico.
5) Inmunofluorescente.
6) Biológico.
7) Uso de sondas de ADN (ARN).
8) Reacción en cadena de la polimerasa.
La reproducción (reproducción) de virus en cultivo celular se juzga por el efecto citopático (CPE), que se puede detectar microscópicamente y se caracteriza cambios morfológicos células.
La naturaleza del CPD de los virus se utiliza tanto para su detección (indicación) como para su identificación tentativa, es decir, determinar su especie.
Métodos de detección de virus:
1) Reacción de hemadsorción - basada en la capacidad de la superficie de las células en las que se reproducen para adsorber eritrocitos - la reacción de hemadsorción. Para ponerlo en un cultivo de células infectadas con virus, se agrega una suspensión de eritrocitos y después de un tiempo de contacto, las células se lavan con solución isotónica de cloruro de sodio. Los eritrocitos adheridos permanecen en la superficie de las células afectadas por el virus.
2) Reacción de hemaglutinación (RG). Se utiliza para detectar virus en el líquido de cultivo de cultivos celulares o líquido corionallantoico o amniótico de un embrión de pollo.
Los métodos serológicos se pueden utilizar para detectar tanto anticuerpos específicos como antígenos virales en el material de prueba. Para estos fines, se pueden utilizar todas las reacciones serológicas conocidas:
1) Reacción de unión del complemento.
2) La reacción de hemaglutinación pasiva y sus variantes (PHAg, PHAt).
3) Reacción de inhibición de la hemaglutinación.
4) La reacción de hemaglutinación de adhesión inmune (el complejo antígeno + anticuerpo en presencia de complemento se adsorbe sobre los eritrocitos).
5) Reacciones de precipitación en gel.
6) Reacciones de neutralización de virus.
7) Método radioinmune.
8) Métodos inmunoensayo enzimático.
Todos los métodos anteriores más popular Se utilizan métodos ELISA, que se caracterizan por una alta especificidad y facilidad de uso.
7. Reacción de hemaglutinación, su mecanismo en virus gripales. Reacción de inhibición de la hemaglutinación, su aplicación práctica.
Reacción de hemaglutinación (RG). Se utiliza para detectar virus en el líquido de cultivo de cultivos celulares o líquido corionallantoico o amniótico de un embrión de pollo.
8. Características de la inmunidad antiviral. El papel de la fagocitosis y los factores humorales en la inmunidad. Interferones, características de las principales propiedades, clasificación. Características de la acción de los interferones sobre los virus. .
Todos los sistemas inmunológicos están involucrados en la protección del cuerpo contra los virus, pero la inmunidad antiviral tiene características específicas significativas. Están determinados por el hecho de que, en primer lugar, no son los sistemas del complemento y los macrófagos los que reaccionan a la penetración del virus en el cuerpo, sino los sistemas de interferones y células T-killer. Otra característica de la formación de la inmunidad se debe al hecho de que los virus tienen un efecto antigénico débil sobre los linfocitos B, y para su activación, proliferación y diferenciación, la participación de los ayudantes T y, en consecuencia, la presentación del antígeno viral procesado. (fragmentos peptídicos) con la participación de moléculas MHC de clase II. Por tanto, el papel de los macrófagos y otras células presentadoras de antígenos no es tanto en la fagocitosis en sí, sino en el procesamiento y presentación del antígeno.
El sistema de los interferones, que suprimen la reproducción intracelular de los virus, reacciona ante todo a la penetración del virus. Además, los inhibidores a y b en el suero sanguíneo tienen un efecto antiviral. Inhibidor alfa: un sustrato termoestable, forma parte de las a-globulinas, evita la adsorción de virus en la célula, es destruido por la neuraminidasa de orto y paramixovirus. Inhibidor beta: mucopéptido termolábil, forma parte de las globulinas b, inhibe la multiplicación de orto y paramixovirus.
Sin embargo, los interferones y los inhibidores no fueron suficientes para proteger contra los virus, por lo que la naturaleza creó otro mecanismo de defensa muy poderoso a nivel corporal contra los virus. Se presenta principalmente Linfocitos T-citotóxicos y otras células asesinas. Estas células reconocen todos los antígenos extraños, incluidos los virales, representados por moléculas MHC de clase I. importancia biológica Células T-killer y consiste en la detección y destrucción de cualquier célula infectada con antígenos extraños.
El interferón es una familia de glicoproteínas que son sintetizadas por las células del sistema inmunitario y tejido conectivo. Según qué células sintetizan interferón, hay tres tipos: ?, ? y?-interferones.
El interferón alfa es producido por los leucocitos y se llama leucocito; el interferón beta se llama fibroblástico, ya que es sintetizado por fibroblastos, células del tejido conectivo, y el interferón gamma se llama inmune, ya que es producido por linfocitos T activados, macrófagos, asesinos naturales, es decir, células inmunes.
La producción de interferón aumenta considerablemente cuando se infecta con virus, además del efecto antiviral, el interferón tiene protección antitumoral, ya que retrasa la proliferación (reproducción) de células tumorales, así como la actividad inmunomoduladora, estimulando la fagocitosis, asesinos naturales, regulando la formación de anticuerpos por las células B, activando la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad.
Mecanismo de acción. El interferón no actúa directamente sobre el virus fuera de la célula, sino que se une a receptores celulares especiales y afecta el proceso de reproducción del virus dentro de la célula en la etapa de síntesis de proteínas.
Virología privada
1. Virus que causan infecciones respiratorias agudas (IRA). Clasificación. características generales ortomixovirus. La estructura del virión de influenza. Características de su genoma y la puesta en práctica de la información contenida en él. Replicación del ARN del virión.
1. Virus: agentes causantes de infecciones respiratorias agudas. clasificación.
Los agentes causantes de las IRA son los siguientes virus:
1. Virus de la influenza A, B, C (Orthomyxoviridae)
2. Paramixovirus (Paramyxoviridae): esta familia incluye tres géneros: paramixovirus: virus de parainfluenza humana (VPH) tipos 1, 2, 3, 4, enfermedad de Newcastle, parainfluenza aviar y paperas; Neumovirus - virus respiratorio sincitial (RS-virus); El morbillivirus es el virus del sarampión.
3. Coronavirus respiratorios (Coronaviridae).
4. Reovirus respiratorios (Reoviridae).
5. Picornavirus (Picornaviridae).
virus de la gripe A
El virión tiene forma esférica y un diámetro de 80-120 nm. El genoma del virus está representado por un ARN negativo fragmentado (8 fragmentos) monocatenario con un PM total de 5 MD. El tipo de simetría de la nucleocápside es helicoidal. Virion Tiene una supercápside (membrana) que contiene dos glicoproteínas: hemaglutinina y neuraminidasa, que sobresalen por encima de la membrana en forma de varios picos.
Los virus son los agentes causantes de las enfermedades respiratorias agudas. Características de la manifestación de enfermedades causadas por virus influenza, parainfluenza, rinovirus, virus respiratorio sincitial y adenovirus. Métodos de laboratorio su diagnostico.
El virión tiene forma esférica y un diámetro de 80-120 nm. El genoma del virus está representado por un ARN negativo fragmentado (8 fragmentos) monocatenario con un PM total de 5 MD. El tipo de simetría de la nucleocápside es helicoidal. El virión tiene una supercápside (membrana) que contiene dos glicoproteínas, hemaglutinina y neuraminidasa, que sobresalen por encima de la membrana en forma de varios picos.
En los virus de influenza A de humanos, mamíferos y aves, se encontraron 13 tipos de hemaglutinina que difieren en el antígeno, a los que se les asignó una numeración continua (de H1 a H13).
La neuraminidasa (N) es un tetrámero con un peso molecular de 200-250 kD, cada monómero tiene un peso molecular de 50-60 kD.
El virus de la influenza A tiene 10 variantes diferentes de neuraminidasa
Diagnóstico de laboratorio. El material para el estudio es la descarga de la nasofaringe, que se obtiene por lavado o usando hisopos de gasa de algodón, y sangre. Se utilizan los siguientes métodos de diagnóstico:
1. Virológica: infección de embriones de pollo, cultivos de células renales de monos verdes (Vero) y perros (MDSC). Los cultivos celulares son particularmente efectivos para el aislamiento de virus A (H3N2) y B.
2. Serológico: detección de anticuerpos específicos y aumento de su título (en sueros pareados) mediante RTGA, RSK, inmunoensayo enzimático.
3. Como diagnóstico acelerado, se utiliza un método inmunofluorescente, que permite detectar rápidamente el antígeno viral en frotis-improntas de la mucosa nasal o en hisopos de la nasofaringe de los pacientes.
4. Para la detección e identificación del virus (antígenos virales), se han propuesto métodos de sonda de ARN y PCR.
Profilaxis específica
1) vivir del virus atenuado; 2) mataron todo el virión; 3) vacuna de subvirión (a partir de viriones divididos); 4) vacuna de subunidades que contiene solo hemaglutinina y neuraminidasa.
Virus de la influenza (ortomixovirus). Características generales. Proteínas de la supercápside, sus funciones, importancia de la variabilidad (cambio y deriva) para la epidemiología de la influenza. Métodos diagnóstico de laboratorio. Vacunas utilizadas para prevenir la influenza.
Enfermedad infecciosa aguda, con fiebre, daño hepático. antroponosis.
Taxonomía, morfología, estructura antigénica: Familia Picornaviridae, género Hepatovirus. La especie tipo tiene un serotipo. Es un virus que contiene ARN, simplemente organizado, tiene un antígeno específico del virus.
Cultivo: El virus se cultiva en cultivos celulares. El ciclo de reproducción es más largo que el de los enterovirus, el efecto citopático no es pronunciado.
Resistencia: Resistente al calor; inactivado por ebullición durante 5 min. relativamente estable en ambiente externo(agua).
Epidemiología. La fuente son los pacientes. El mecanismo de infección es fecal-oral. Los virus se eliminan en las heces al principio. manifestaciones clínicas. Con la aparición de la ictericia, la intensidad del aislamiento del virus disminuye. Los virus se transmiten a través del agua, los alimentos, las manos.
La mayoría de los niños de 4 a 15 años están enfermos.
Diagnóstico microbiológico. El material para el estudio es suero y heces. El diagnóstico se basa principalmente en la determinación de IgM en sangre mediante ELISA, RIA e inmunomicroscopía electrónica. Los mismos métodos pueden detectar el antígeno viral en las heces. No se realizan pruebas virológicas.
3. Diagnóstico virológico de influenza. Aislamiento del virus, determinación de su tipo. Métodos serológicos para el diagnóstico de influenza: RSK, RTGA. Un método de diagnóstico acelerado que utiliza anticuerpos fluorescentes.
Diagnóstico microbiológico. El diagnóstico de "influenza" se basa en (1) el aislamiento e identificación del virus, (2) la determinación de antígenos virales en las células del paciente, (3) la búsqueda de anticuerpos específicos del virus en el suero del paciente. Al seleccionar material para la investigación, es importante obtener células afectadas por virus, ya que es en ellas donde se produce la replicación del virus. Material para la investigación - secreción nasofaríngea. Para determinar los anticuerpos, se examinan los sueros sanguíneos emparejados del paciente.
Diagnóstico exprés. Los antígenos virales se detectan en el material de prueba mediante RIF (opciones directas e indirectas) y ELISA. El genoma de los virus se puede detectar en el material mediante PCR.
Método virológico. El modelo de laboratorio óptimo para el cultivo de cepas es el embrión de pollo. La indicación de virus se realiza en función del modelo de laboratorio (por muerte, por cambios clínicos y patomorfológicos, CPP, formación de "placas", "muestra de color", RHA y hemadsorción). Los virus se identifican por su estructura antigénica. Se utilizan RSK, RTGA, ELISA, RBN (reacción de neutralización biológica) de virus, etc. Por lo general, el tipo de virus de influenza se determina en RSK, el subtipo en RTGA.
Método serológico. El diagnóstico se realiza con un aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos en sueros pareados del paciente, obtenidos a intervalos de 10 días. Aplicar virus RTGA, RSK, ELISA, RBN.
Adenovirus, características de propiedades, composición del grupo. Adenovirus patógenos para humanos. Características de la patogenia. infecciones por adenovirus, métodos de cultivo de adenovirus. Diagnóstico de enfermedades por adenovirus.
La familia Adenoviridae se divide en dos géneros: Mastadenovirus - adenovirus de mamíferos, incluye adenovirus humanos (41 serovariantes), monos (24 serovariantes), así como grandes ganado, caballos, ovejas, cerdos, perros, ratones, anfibios; y Aviadenovirus - adenovirus aviares (9 serotipos).
Los adenovirus carecen de supercápside. El virión tiene la forma de un icosaedro, un tipo de simetría cúbica, su diámetro es de 70-90 nm. La cápside consta de 252 capsómeros con un diámetro de 7-9 nm.
El virión contiene al menos 7 antígenos. El período de incubación es de 6-9 días. El virus se replica en células epiteliales tracto respiratorio superior, membranas mucosas de los ojos. Puede penetrar en los pulmones, afectar los bronquios y los alvéolos, causar neumonía grave; una propiedad biológica característica de los adenovirus es el tropismo por el tejido linfoide.
Las enfermedades por adenovirus pueden caracterizarse como febriles con inflamación catarral mucosa de las vías respiratorias y de los ojos, acompañada de un aumento del tejido linfoide submucoso y de los ganglios linfáticos regionales.
Diagnóstico de laboratorio. 1. Detección de antígenos virales en células afectadas mediante métodos de inmunofluorescencia o IFM. 2. Aislamiento del virus. El material para el estudio es la descarga de la nasofaringe y la conjuntiva, sangre, heces (el virus se puede aislar no solo al comienzo de la enfermedad, sino también entre los días 7 y 14). Para aislar el virus, se utilizan cultivos celulares primarios tripsinizados (incluidos los diploides) de un embrión humano, que son sensibles a todas las serovariantes de los adenovirus. Los virus se detectan por su efecto citopático y por CSC, ya que todos comparten un antígeno fijador de complemento común. La identificación se lleva a cabo mediante antígenos específicos de tipo utilizando RTGA y pH en cultivo celular. 3. Detección de un aumento en el título de anticuerpos en sueros emparejados de un paciente usando RSC. La determinación del aumento del título de anticuerpos específicos de tipo se realiza con serocepas de referencia de adenovirus en RTGA o RN en cultivo celular.
5. Virus Coxsackie y ECHO. Caracterización de sus propiedades. La composición de los grupos. Métodos diagnóstico microbiológico enfermedades causadas por los virus Coxsackie y ECHO.
Coxsackie es el más cardiotrópico de todos los enterovirus. En el 20-40% de los pacientes menores de 20 años, la infección por Coxsackie se complica con miocarditis. Los virus Coxsackie están representados por dos grupos: el grupo Coxsackie A incluye 23 serovariantes (A1-A22, 24); el grupo Coxsackie B incluye 6 serovariantes (B1-B6).
Los virus Coxsackie A y B pueden causar en humanos, además de enfermedades similares a la poliomielitis, a veces acompañadas de parálisis, y otras enfermedades diversas con una clínica peculiar: meningitis aséptica, mialgia epidémica (enfermedad de Bornholm), herpangina, enfermedad menor, gastroenteritis aguda enfermedades respiratorias, miocarditis
ECHO, que significa: E - entérico; C - citopatógeno; H - humano; O - huérfano - un huérfano. contiene 32 serotipos.
La fuente de las infecciones Coxsackie y ECHO es una persona. La infección por virus se produce por vía fecal-oral.
La patogénesis de las enfermedades causadas por los virus Coxsackie y ECHO es similar a la patogenia de la poliomielitis. Las puertas de entrada son la membrana mucosa de la nariz, faringe, intestino delgado, en cuyas células epiteliales, así como en el tejido linfoide, se multiplican estos virus.
La afinidad por el tejido linfoide es una de las rasgos característicos estos virus. Después de la reproducción, los virus penetran en la linfa y luego en la sangre, causando viremia y generalización de la infección.
Una vez en el torrente sanguíneo, los virus se diseminan por vía hematógena por todo el cuerpo, asentándose selectivamente en aquellos órganos y tejidos por los que tienen tropismo.
Métodos para el diagnóstico de enfermedades por enterovirus. usar método virológico y diversas reacciones serológicas. el estudio debe realizarse en todo el grupo de enterovirus. Para su aislamiento se utilizan contenidos intestinales, lavados y frotis de garganta, menos frecuentemente líquido cefalorraquídeo o sangre, y en caso de fallecimiento del paciente, trozos de tejido de varios organos. Los cultivos celulares (poliovirus, ECHO, Coxsackie B y algunos serovares de Coxsackie A), así como ratones recién nacidos (Coxsackie A) se infectan con el material de prueba.
La tipificación de los virus aislados se lleva a cabo en reacciones de neutralización, RTGA, RSK, reacciones de precipitación, utilizando mezclas de referencia de sueros de varias combinaciones. Para detectar anticuerpos en sueros humanos infecciones enterovirales utilizar las mismas pruebas serológicas (RN, pruebas de color, RTGA, RSK, reacciones de precipitación), pero para estos fines es necesario tener sueros pareados de cada paciente (en el período agudo y después de 2-3 semanas desde el inicio de la enfermedad ). Las reacciones se consideran positivas cuando el título de anticuerpos aumenta al menos 4 veces. Estos dos métodos también usan IFM (para detectar anticuerpos o antígenos).
Hepatitis B. Estructura y características de las principales propiedades del virión. Antígeno de superficie, su significado. Características de la interacción del virus con la célula. Formas de infección. Métodos de diagnóstico de laboratorio. profilaxis específica.
Virus de la hepatitis B, VHB El virión contiene tres antígenos principales
1. HBsAg - superficial (superficial), o soluble (soluble), o antígeno australiano.
2. HBcAg - antígeno central (cog-antígeno).
3. HBeAg - antígeno e, localizado en el núcleo del virión
El virión real, la partícula de Dane, tiene una forma esférica y un diámetro de 42 nm. La supercápside del virión consta de tres proteínas: la principal (principal), grande y mediana (Fig. 88.1). El genoma está encerrado en una cápside y está representado por ADN circular de doble cadena con un m.m. de 1,6 MD. El ADN consta de aproximadamente 3200 nucleótidos, pero su cadena "más" es un 20-50% más corta que la cadena "menos".
El antígeno de superficie - HBsAg - existe en forma de tres variantes morfológicamente diferentes: 1) representa la supercápside de todo el virión; 2) se presenta en grandes cantidades en forma de partículas con un diámetro de 20 nm, que tienen forma esférica; 3) en forma de hilos de 230 nm de largo. Químicamente son idénticos. HBsAg contiene un antígeno común a y dos pares de determinantes específicos de tipo mutuamente excluyentes: d/y y w/r, por lo que hay cuatro subtipos principales de HBsAg (y, en consecuencia, HBV): adw, adr, ayw y ayr. El antígeno a proporciona la formación de inmunidad cruzada general a todos los subtipos del virus.
Las proteínas que forman el antígeno de superficie existen en formas glicosiladas (gp) y no glicosiladas. Gp27, gp33, gp36 y gp42 están glicosilados (los números indican m.m. en CD). La supercápside del VHB consta de la proteína S principal o principal (92%); proteína M mediana (4%) y proteína L grande o larga (1%).
Proteína mayor - p24/gp27, Proteína grande - p39/gp42, Proteína mediana - gp33/gp36.
interacción con la célula.
1. Adsorción en la célula.
2. Penetración en la célula utilizando el mecanismo de endocitosis mediada por receptor (fosa cubierta -> vesícula bordeada -> lisosoma -> liberación de la nucleocápside y penetración del genoma viral en el núcleo del hepatocito).
3. Reproducción intracelular.
La fuente de infección con el virus de la hepatitis B es solo una persona. La infección se produce no sólo por vía parenteral, pero también sexual y vertical (de madre a feto)
Actualmente, el método principal para el diagnóstico de la hepatitis B es el uso de la hemaglutinación pasiva inversa (RPHA) para detectar el virus o su antígeno de superficie, HBsAg. Como ya se señaló, la sangre contiene muchas veces más antígeno de superficie que el propio virus (100-1000 veces). Para la reacción de ROPHA se utilizan eritrocitos sensibilizados con anticuerpos contra el virus de la hepatitis B. En presencia de un antígeno en la sangre, se produce una reacción de hemaglutinación. Para detectar anticuerpos contra el antígeno viral HBsAg, varios métodos inmunológicos(RSK, RPGA, IFM, RIM, etc.)
Profilaxis específica
Las vacunas contra la hepatitis B son obligatorias y deben administrarse en el primer año de vida. Se han propuesto dos tipos de vacunas para la vacunación. Para la preparación de uno de ellos se utiliza como materia prima el plasma de portadores de virus, ya que contiene el antígeno viral en cantidades suficientes para preparar una vacuna. La principal condición para la preparación de este tipo de vacunas es su total seguridad.Para la fabricación de otro tipo de vacunas se utilizan métodos Ingeniería genética En particular, para obtener material antigénico se utiliza un clon de levadura recombinante que produce el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.
En Rusia se han creado vacunas tanto para adultos como para recién nacidos y niños temprana edad. El ciclo completo de vacunación consta de tres inyecciones:
Dosis - inmediatamente después del nacimiento; II dosis - después de 1-2 meses; III dosis - hasta el final del 1er año de vida.