reazioni immunodiagnostiche. Reazioni antigene-anticorpo e reazioni con componenti marcati. Utilizzare per l'identificazione di microrganismi e per scopi diagnostici malattie infettive.

Le reazioni immunitarie sono utilizzate negli studi diagnostici e immunologici nei pazienti e persone sane. A tale scopo, applicare metodi sierologici (dal lat. siero - siero e loghi - dottrina), cioè metodi per studiare anticorpi e antigeni utilizzando reazioni antigene-anticorpo determinate nel siero del sangue e in altri fluidi, nonché nei tessuti corporei.

La rilevazione di anticorpi contro gli antigeni dell'agente patogeno nel siero del sangue del paziente consente di diagnosticare la malattia. Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni microbici, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.

Quando un microbo viene isolato da un paziente, l'agente patogeno viene identificato studiandolo. proprietà antigeniche utilizzando sieri diagnostici immunitari, cioè sieri di sangue di animali iperimmunizzati contenenti anticorpi specifici. Questo cosiddetto identificazione sierologica microrganismi.

In microbiologia e immunologia, l'agglutinazione, la precipitazione, le reazioni di neutralizzazione, le reazioni che coinvolgono il complemento, utilizzando anticorpi e antigeni marcati (metodi radioimmunologici, immunoenzimatici, immunofluorescenza) sono ampiamente utilizzati. Le reazioni elencate differiscono nell'effetto registrato e nella tecnica di impostazione, tuttavia, sono tutte fondamentali. furgoni sulla reazione dell'interazione di un antigene con un anticorpo e sono utilizzati per rilevare sia gli anticorpi che gli antigeni. Le reazioni immunitarie sono caratterizzate da elevata sensibilità e specificità.

I seguenti sono i principi e gli schemi del principale immunologico reazioni diagnostiche. Tecnica di dettaglio l'impostazione delle reazioni è fornita. Linee guida pratiche per l'immunodiagnostica.

Reazione di agglutinazione - RA(dal lat. agglutini- nazione- legame) - una semplice reazione in cui gli anticorpi legano antigeni corpuscolari (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi, nonché aggregati macromolecolari). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.

Vengono utilizzate varie varianti della reazione di agglutinazione: espansa, approssimata, indiretta, ecc. La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti

AR è utilizzato per:

determinazione degli anticorpi nel siero del sangue di pazienti, ad esempio, con brucellosi (reazioni di Wright, Heddelson), tifo e paratifo (reazione di Vidal) e altre malattie infettive;

determinazione del patogeno isolato dal paziente;

determinazione dei gruppi sanguigni mediante anticorpi monoclonali contro gli allogene eritrocitari.

Per determinare gli anticorpi del paziente metterereazione di agglutinazione prolungata: aggiungere alle diluizioni del siero del sangue del paziente diagnostico(sospensione di microbi uccisi) e dopo diverse ore di incubazione a 37 ° C, si nota la massima diluizione sierica (titolo sierico), alla quale si è verificata l'agglutinazione, cioè si è formato un precipitato.

La natura e la velocità di agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e di anticorpi. Un esempio è l'interazione dei diagnostici (antigeni O e R) con anticorpi specifici. Reazione di agglutinazione con O-diagnostico(batteri uccisi dal calore, mantenendo un termostabile O antigene) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formalina, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è a grana grossa e procede più velocemente.

Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, mettere orientare la reazione di agglutinazione, utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), ovvero viene eseguita la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione approssimativa viene eseguita su un vetrino. Ad una goccia di siero agglutinante diagnostico in diluizione 1:10 o 1:20 aggiungere una coltura pura del patogeno isolato dal paziente. Un controllo viene posto nelle vicinanze: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Quando un sedimento flocculante appare in una goccia con siero e microbi, lo mettono ampia reazione di agglutinazione in provetta con diluizioni crescenti di siero agglutinante, a cui si aggiungono 2-3 gocce della sospensione del patogeno. L'agglutinazione è presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di chiarificazione del liquido. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con soluzione isotonica di cloruro di sodio dovrebbe essere trasparente, una sospensione di microbi nella stessa soluzione dovrebbe essere uniformemente torbida, senza sedimenti.

Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, rendendo difficile la loro identificazione. Pertanto, divertiti sieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi cross-reattivi sono stati rimossi mediante adsorbimento da parte dei loro batteri correlati. In tali sieri rimangono anticorpi specifici solo per questo batterio. La preparazione di sieri agglutinanti diagnostici monorecettore in questo modo fu proposta da A. Castellani (1902).

La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva). (RNHA, RPHA) si basa sull'uso di eritrociti con antigeni o anticorpi adsorbiti sulla superficie, la cui interazione con i corrispondenti anticorpi o antigeni del siero sanguigno della palla fa sì che gli eritrociti aderiscano e cadano sul fondo di la provetta o la cella in la forma di un sedimento smerlato (Fig. 13.2). Con una reazione negativa, gli eritrociti si depositano sotto forma di un "bottone". Di solito, gli anticorpi vengono rilevati in RNHA utilizzando un diagnostico eritrocitario antigenico, che è costituito da eritrociti con adsorbito su loro antigeni. A volte usiamo la diagnostica degli eritrociti anticorpali, su cui vengono adsorbiti gli anticorpi. Ad esempio, la tossina botulinica può essere rilevata aggiungendovi l'anticorpo eritrocitario botulinum diagnosticum (questa reazione è chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa- ROGA). RNHA è usato per diagnosticare malattie infettive, determinare l'ormone gonadotropico in urina quando viene stabilita la gravidanza, per rilevare ipersensibilità a medicinali, ormoni e in alcuni altri casi.

Reazione di coagulazione . Le cellule patogene vengono determinate utilizzando stafilococchi, pretrattati con siero diagnostico immunitario. Stafilococchi contenenti proteine E, avere un'affinità per Fc -frammento di immunoglobuline, adsorbono in modo non specifico anticorpi antimicrobici, che poi interagiscono con centri attivi con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. Come risultato della coagglutinazione, si formano scaglie, costituite da stafilococchi, anticorpi sierici diagnostici e il microbo da determinare.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) si basa sul blocco, la soppressione degli antigeni dei virus da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito della quale i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi (Fig. 13.3). RTHA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (influenza, morbillo, rosolia, encefalite da zecche, ecc.) Possono agglutinare gli eritrociti di vari animali.

Reazione di agglutinazione per la determinazione dei gruppi sanguigni utilizzato per stabilire il sistema ABO (vedere la sezione 10.1.4.1) utilizzando l'agglutinazione di eritrociti con anticorpi di siero immunitario contro antigeni dei gruppi sanguigni A (II), B (III). I controlli sono: siero privo di anticorpi, cioè siero AB (GU) gruppi sanguigni; antigeni contenuti negli eritrociti dei gruppi A (II), B (III). Il controllo negativo non contiene antigeni, ovvero vengono utilizzati eritrociti di gruppo 0 (I).

IN reazioni di agglutinazione per determinare il fattore Rh(vedi sezione 10.1.4.1) utilizzare sieri anti-Rh (almeno due serie diverse). In presenza dell'antigene Rh sulla membrana degli eritrociti studiati, si verifica l'agglutinazione di queste cellule. Gli eritrociti Rh-positivi e Rh-negativi standard di tutti i gruppi sanguigni fungono da controlli.

Reazione di agglutinazione per la determinazione degli anticorpi anti-Rhesus ( reazione indiretta Coombs)utilizzato in pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti si riscontrano anticorpi anti-Rhesus, che sono incompleti, monovalenti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non ne causano l'agglutinazione. La presenza di tali anticorpi incompleti è determinata nella reazione indiretta di Coombs. Per fare ciò, il siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane) viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti (Fig. 13.4). Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio la malattia emolitica del neonato: gli eritrociti di un feto Rh-positivo si combinano con anticorpi incompleti contro il fattore Rh circolante nel sangue, che ha attraversato la placenta da una madre Rh-negativa.

Reazioni di precipitazione

reazione di precipitazione -RP (dalat. praeci-pito- precipitato,) è la formazione e la precipitazione di un complesso di un antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, chiamato precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario.

Reazioni di precipitazione poste in provette (reazione di precipitazione dell'anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc. Le varietà della reazione di precipitazione in un gel semiliquido di agar o agarosio sono ampiamente utilizzate: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony. immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi e così via.

Reazione di precipitazione dell'anello . La reazione viene condotta in provette precipitanti strette con siero immune, su cui è stratificato un antigene solubile. Con un rapporto ottimale di antigene e anticorpi, si forma un anello precipitato opaco al confine di queste due soluzioni (Fig. 13.5). Un eccesso di antigene non influenza il risultato della reazione di precipitazione dell'anello a causa della diffusione graduale dei reagenti al confine liquido. Se estratti acquosi bolliti e filtrati di organi o tessuti vengono utilizzati come antigeni nella reazione di precipitazione dell'anello, tale reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione-iii (reazione di Ascoli, con antrace /

Doppia reazione di immunodiffusione di Oukhteruni . Per avviare la reazione, il gel di agar fuso viene versato in uno strato sottile su una lastra di vetro e, dopo che si è indurito, vengono praticati dei fori di 2-3 mm. Antigeni e sieri immuni vengono posti separatamente in questi pozzetti, che diffondono l'uno verso l'altro. Al punto di incontro in proporzioni equivalenti, formano un precipitato a forma di banda bianca. Nei sistemi multicomponente, diverse linee di precipitato compaiono tra i pozzetti con diversi antigeni e anticorpi sierici; per antigeni identici, le linee del precipitato si fondono; per quelli non identici, si intersecano (Fig. 13.6).

Reazione di immunodiffusione radiale . Il siero immunitario con gel di agar fuso viene versato uniformemente sul bicchiere. Dopo la solidificazione nel gel, vengono realizzati dei pozzetti in cui viene posto l'antigene varie diluizioni. L'antigene, diffondendosi nel gel, forma zone di precipitazione ad anello attorno ai pozzetti con gli anticorpi (Fig. 13.7). Il diametro dell'anello di precipitazione è proporzionale alla concentrazione dell'antigene. La reazione viene utilizzata per determinare i livelli ematici di immunoglobuline di varie classi, componenti del sistema del complemento, ecc.

Immunoelettroforesi- una combinazione del metodo dell'elettroforesi e dell'immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi. Quindi, parallelamente alle zone di elettroforesi, viene introdotto nel solco un siero immunitario i cui anticorpi, diffondendosi nel gel, si formano nel punto di incontro con l'antigene della linea di precipitazione.

reazione di flocculazione(secondo Ramon) (dal lat. floccus- fiocchi di lana) - la comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante una reazione tossina-antitossina o anatossina-antitossina. Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.

Microscopia elettronica immunitaria- microscopia elettronica di microbi, più spesso virus, trattati con opportuni anticorpi. I virus trattati con siero immunitario formano aggregati immunitari (microprecipitati). Attorno ai virioni si forma una "corolla" di anticorpi, contrastata con acido fosfotungstico o altri preparati elettron-otticamente densi.

Reazioni che coinvolgono il complemento

Reazioni che coinvolgono il complementobasato sull'attivazione del complemento da parte di un complesso antigene-anticorpo (reazione di fissazione del complemento, emolisi radiale, ecc.).

Reazione di fissazione del complemento (RSK) risiede nel fatto che, in corrispondenza tra loro, antigeni e anticorpi formano un complesso immunitario, al quale, attraverso Fc -frammento di anticorpi si unisce al complemento (C), cioè il legame del complemento avviene con un complesso antigene-anticorpo. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero (Fig. 13.8). RSK si svolge in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente tre componenti dell'antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendovi un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, durante la formazione del complesso antigene-anticorpo, si verifica il legame del complemento, quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi; la reazione è positiva. Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono tra loro (non c'è antigene o anticorpo nel campione in esame), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unirà al complesso anticorpo eritrocita-antieritrocita, provocando l'emolisi; la reazione è negativa.

RSK è usato per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wasserman).

La reazione di emolisi radiale (RRH ) posto in pozzetti di gel di agar contenente eritrociti di ariete e complemento. Dopo l'aggiunta di siero emolitico (anticorpi contro gli eritrociti di ariete) ai pozzetti del gel, attorno ad essi si forma una zona di emolisi (come risultato della diffusione radiale degli anticorpi). Pertanto, è possibile determinare l'attività del complemento e del siero emolitico, nonché gli anticorpi nel siero del sangue di pazienti con influenza, rosolia, encefalite da zecche. Per fare ciò, i corrispondenti antigeni del virus vengono adsorbiti sugli eritrociti e il siero del sangue del paziente viene aggiunto ai pozzetti del gel contenente questi eritrociti. Gli anticorpi antivirali interagiscono con antigeni virali adsorbiti su erythrocytes dopo

I componenti del complemento si attaccano a questo complesso, causando l'emolisi.

Reazione di adesione immunitaria (RIP ) si basa sull'attivazione del sistema del complemento da parte di antigeni corpuscolari (batteri, virus) trattati con siero immunitario. Di conseguenza, si forma un componente del terzo complemento attivato (C3b), che si attacca all'antigene corpuscolare come parte del complesso immunitario. Su eritrociti, piastrine, macrofagi sono presenti recettori per C3b, a causa dei quali, quando queste cellule vengono mescolate con complessi immunitari contenenti C3b, si combinano e si agglutinano.

Reazione di neutralizzazione

Gli anticorpi del siero immunitario sono in grado di neutralizzare l'effetto dannoso dei microbi o delle loro tossine su cellule e tessuti sensibili, che è associato al blocco degli antigeni microbici da parte degli anticorpi, cioè il loro neutralizzazione. Reazione di neutralizzazione(RN) viene effettuata introducendo una miscela antigene-anticorpo in animali o in oggetti di prova sensibili (coltura cellulare, embrioni). In assenza dell'effetto dannoso dei microrganismi o dei loro antigeni, tossine negli animali e oggetti di prova, parlano dell'effetto neutralizzante del siero immunitario e, quindi, della specificità dell'interazione del complesso antigene-anticorpo (Fig. 13.9).

Reazione di immunofluorescenza - RIF (metodo Koons)

Esistono tre varietà principali del metodo: diretto, indiretto (Fig. 13.10), con un complemento. La reazione di Koons è un metodo diagnostico rapido per rilevare antigeni microbici o rilevare anticorpi.

Metodo RIF diretto si basa sul fatto che gli antigeni tissutali o i microbi trattati con sieri immuni con anticorpi marcati con fluorocromi sono in grado di brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza.

I batteri in uno striscio, trattati con un siero così luminescente, brillano lungo la periferia cellulare sotto forma di un bordo verde.

Metodo RIF indiretto consiste nell'identificare il complesso antigene-anticorpo utilizzando un siero antiglobulina (anticorpo) marcato con fluorocromo. Per fare ciò, gli strisci di una sospensione di microbi vengono trattati con anticorpi di siero diagnostico di coniglio antimicrobico. Quindi gli anticorpi che non sono legati dagli antigeni microbici vengono lavati via e gli anticorpi rimasti sui microbi vengono rilevati trattando lo striscio con siero antiglobulina (anti-coniglio) marcato con fluorocromi. Di conseguenza, si forma un microbo complesso + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi anti-coniglio marcati con fluorocromo. Questo complesso è osservato in un microscopio a fluorescenza, come nel metodo diretto.

Metodo ELISA o analisi (ELISA)

ELISA -rilevamento di antigeni utilizzando i loro corrispondenti anticorpi coniugati con un enzima di marcatura (perossidasi di rafano, beta-galattosidasi o fosfatasi alcalina). Dopo che l'antigene è stato combinato con i sieri immuni marcati con enzima, il substrato/cromogeno viene aggiunto alla miscela. Il substrato viene scisso dall'enzima e il colore del prodotto di reazione cambia: l'intensità del colore è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigene e anticorpo legate.

ELISA in fase solida - la variante più comune del test immunologico, quando uno dei componenti della risposta immunitaria (antigene o anticorpi) viene adsorbito su un supporto solido, ad esempio nei pozzetti delle piastre di polistirene

Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue del paziente, il siero dell'antiglobulina marcato con l'enzima e il substrato (cromogeno) per l'enzima vengono aggiunti in sequenza ai pozzetti delle piastre con l'antigene adsorbito.

Ogni volta dopo l'aggiunta del componente successivo, i reagenti non legati vengono rimossi dai pozzetti mediante lavaggio accurato. Con un risultato positivo, il colore della soluzione cromogena cambia. Un vettore in fase solida può essere sensibilizzato non solo con un antigene, ma anche con anticorpi. Quindi, l'antigene desiderato viene introdotto nei pozzetti con anticorpi adsorbiti, viene aggiunto il siero immunitario contro l'antigene marcato con l'enzima, e quindi viene aggiunto il substrato per l'enzima.

ELISA competitivo . l'antigene bersaglio e l'antigene marcato con l'enzima competono tra loro per il legame di una quantità limitata di anticorpi del siero immunitario. Un altro test sono gli anticorpi che stai cercando

e gli anticorpi marcati competono tra loro per gli antigeni.

Metodo o analisi radioimmunologica (RIA)

Un metodo altamente sensibile basato sulla reazione antigene-anticorpo utilizzando antigeni o anticorpi marcati con un radionuclide (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, ecc.). Dopo la loro interazione, l'immunocomplesso radioattivo risultante viene separato e la sua radioattività viene determinata nell'apposito contatore (radiazione beta o gamma):

l'intensità della radiazione è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigeni e anticorpi legati.

In versione in fase solida di RIA uno dei componenti della reazione (antigene o anticorpi) viene adsorbito su un supporto solido, ad esempio in pozzetti di microarray di polistirene. Un'altra versione del metodo è RIA competitiva. l'antigene bersaglio e l'antigene marcato con radionuclide competono tra loro per legare una quantità limitata di anticorpi del siero immunitario. Questa opzione viene utilizzata per determinare la quantità di antigene nel materiale di prova.

La RIA viene utilizzata per rilevare antigeni microbici, determinare ormoni, enzimi, sostanze medicinali e immunoglobuline, nonché altre sostanze contenute nel materiale di prova in concentrazioni minori - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Il metodo presenta un certo rischio ambientale.

Immunoblotting

Immunoblotting (IB)- un metodo altamente sensibile basato su una combinazione di elettroforesi ed ELISA o RIA.

L'antigene viene isolato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide, quindi viene trasferito (blotting - dall'inglese. macchia, spot) dal gel su carta attivata o membrana di nitrocellulosa e sviluppato da ELISA. Le aziende producono tali strisce con "macchie"

antigeni. Su queste strisce viene applicato il siero del paziente. Quindi, dopo l'incubazione, il paziente viene lavato dagli anticorpi non legati del paziente e viene applicato il siero contro le immunoglobuline umane, marcate con un enzima. Il complesso antigene + anticorpo del paziente + anticorpo contro le Ig umane formatosi sulla striscia viene rilevato aggiungendo un substrato/cromogeno che cambia colore sotto l'azione dell'enzima (Fig. 13.12).

IB è usato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV, ecc.

Reazione di agglutinazione Reazione di agglutinazione

(RA) - un metodo per il rilevamento e la quantificazione di Ag e Ab, basato sulla loro capacità di formare agglomerati visibili ad occhio nudo. Nella clinica delle infezioni. malattie o per altri scopi, viene utilizzato per identificare microbi e cellule sconosciuti, per determinare la presenza e la quantità di anticorpi nel sangue e in altri fluidi. Il principio di determinazione si basa sulla specificità dell'interazione tra Ag e Am e consiste nel trovare il noto dall'ignoto. Esistono molte varianti di RA: metodi quantitativi e qualitativi, in vitro e su vetro, volumetrici e drip, convenzionali, accelerati ed express. Per configurare RA, è necessario: 1) s-ka sangue. Nella variante con la definizione della specie (var) di batteri si utilizzano agglutinanti industriali s-ki, prodotti immunizzando conigli. Nella variante con la definizione del tipo di Ab, prelevano un campione di sangue ottenuto dalla ricerca. persone o animali. S-ka deve essere sterile e non contenere particelle sospese. Preparare la diluizione principale in soluzione fisiologica. Dovrebbe essere 2-4 volte inferiore al titolo diagnostico per questa malattia; 2) Ag. Nella variante della reazione con la determinazione del tipo di Ab, viene utilizzata la diagnostica di produzione; nella variante con la determinazione di Ag, i diagnostici vengono preparati essi stessi sotto forma di una sospensione di 1-3 miliardesimo in soluzione salina di 18-20 ore di agar (meno spesso brodo) per la ricerca. microbo inattivato mediante riscaldamento in bagnomaria a 70°C per 1 ora o 24 ore di incubazione a 37°C con formalina (concentrazione finale 0,2%); 3) elettrolita salino. Tecnica di impostazione tubo seriale sfuso RA per determinare il titolo Ab in s-ke: diverse file di diluizioni di lavoro vengono preparate dalla diluizione principale di s-ki. Il numero di righe dipende dal numero di diagnostici prelevati nell'esperimento, il numero e i fattori di diluizione sono determinati dal titolo diagnostico della malattia sospetta. La riga deve contenere almeno una diluizione corrispondente al titolo Ab diagnostico, due diluizioni sotto e due diluizioni sopra. ad esempio, se il titolo diagnostico è 1:100, quindi con il metodo volumetrico di impostazione dell'AR, devono essere preparate le seguenti diluizioni di s-ki: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1 "400; con il metodo a goccia non è necessaria la prima diluizione (1:25), ma è necessaria un'altra diluizione superiore - 1:800. ricerca scientifica con-ku titolato a reazione negativa. Viene diluito come segue: in tutte le provette sperimentali, ad eccezione della 1a, versare 0,25 ml di soluzione salina quando si imposta la reazione in un volume di 0,5 ml e 0,5 ml quando si imposta la reazione in un volume di 1 ml. Versare 0,25 (0,5) ml della diluizione principale di s-ki nella 1a e 2a provetta, dalla 2a provetta, in un volume tagliato e allevamento con e aumentato di 2 volte, 0,25 (0,5) ml vengono trasferiti al 3°, dal 3° al 4°, ecc. all'ultimo, da un taglio si versano 0,25 (0,5) ml su tutto per equilibrare i volumi. Ogni diluizione con-ki effettuata utilizzando una pipetta separata. Se nell'esperimento vengono presi diversi diagnostici, per ciascuno di essi viene preparata una serie di diluizioni allo stesso modo. Diagnosticum viene aggiunto a ciascuna diluizione di s-ki in un volume pari al volume di s-ki, per cui la diluizione in ciascuna provetta aumenta di 2 volte. L'esperienza corrisponde al controllo di s-ki (0,25 -0,5 ml della diluizione principale di s-ki e la stessa quantità di soluzione fisiologica) e al controllo di AG (0,25 - 0,5 ml di diagnosticum e la stessa quantità di soluzione fisiologica). Se nell'esperimento vengono presi diversi diagnostici, ognuno di essi ha il proprio Ag di controllo. Il rack con le provette viene agitato bene e posto in un termostato a 37°C per 4 ore, quindi lasciato a temperatura ambiente fino a giorno dopo, dopodiché viene contabilizzato l'AR, in base alla quantità di sedimento e al grado di chiarificazione del liquido. La determinazione di questi indicatori, a seconda della natura degli agglutinati, viene effettuata ad occhio nudo su fondo scuro, in agglutinoscopio o sulla superficie concava di uno specchio da microscopio. La contabilità inizia con i controlli: il controllo dovrebbe essere trasparente, l'Ag dovrebbe essere uniformemente torbido (dopo aver agitato il tubo). Se i controlli sono buoni, vengono stabiliti la presenza e il grado di agglutinazione in tutte le provette sperimentali, che sono indicati dai vantaggi: grande sedimento e completa chiarificazione del liquido - 4 vantaggi; grande sedimento e illuminazione incompleta del liquido -3 vantaggi; un notevole sedimento e un'evidente illuminazione del liquido - 2 vantaggi. Successivamente, viene determinato il titolo: la massima diluizione con intensità di agglutinazione di almeno 2 plus. Titolo d'esame s-ki viene confrontato con un titolo diagnostico per questa malattia. Se il titolo dello studio s-ki è 2 volte inferiore a quello diagnostico, la reazione è valutata come dubbia; se il titolo è uguale a diagnostico - debolmente positivo; se è 2-4 volte più alto di esso - come positivo, se è 8 o più volte più alto - come nettamente positivo. Con un'ampia distribuzione di Ab nelle persone sane, un aumento del titolo di Ab viene utilizzato per valutare l'AR. Per determinare il tipo di Ag nel seriale RA, il numero di righe deve corrispondere al numero preso per l'identificazione diagnostica s-a. Dalla diluizione principale dello s-ki diagnostico, viene preparata una serie di diluizioni doppie consecutive nello stesso modo dell'AR per determinare il titolo di At. I fattori di diluizione dipendono dal titolo dell'agglutinante S. Nell'esperimento, la presenza di una diluizione pari al titolo delle diluizioni S. 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Lo stesso volume di ricerca Ag è aggiunto alle diluizioni di s-ki, di conseguenza, la diluizione di s-to aumenta di 2 volte.sono coinvolti diversi s-to, quindi ognuno di essi necessita del proprio controllo.Al termine della reazione, il treppiede viene agitato vigorosamente e posto in un termostato a 37°C. I risultati vengono presi in considerazione come sopra descritto. Ag preso nell'esperimento con-ke, il titolo della reazione deve corrispondere ad almeno la metà del titolo del test diagnostico standard I titoli di 1 4 e inferiori sono considerati una reazione di gruppo gocciolare m d L'impostazione RA differisce da quella volumetrica in quanto s-ku viene diluito in un volume di 1 ml, Ag viene utilizzato a una concentrazione più elevata (10 miliardi / ml) e viene aggiunto 1 - 2 gocce in provetta Si considera invariata la diluizione di s-ki dopo l'aggiunta di Ag. Altrimenti, il metodo di impostazione, registrazione e valutazione è simile al metodo volumetrico

(Fonte: Glossario dei termini di microbiologia)

Reazione di agglutinazione (dal lat. agglutinazione- legame) - legame di corpuscoli (batteri, eritrociti, ecc.) con anticorpi in presenza di elettroliti.

Reazione di agglutinazione si manifesta sotto forma di scaglie o sedimenti, costituiti da corpuscoli (ad esempio batteri), “incollati tra loro” da anticorpi (Fig. 7.37). La reazione di agglutinazione viene utilizzata per: determinare il patogeno isolato dal paziente; determinazione degli anticorpi nel siero del sangue del paziente; determinazione dei gruppi sanguigni.

Riso. 7.37 a, b. Reazione di agglutinazione conIgM-anticorpi (a) eIgG-anticorpi (b)

1. Determinazione del patogeno isolato dal paziente Reazione di agglutinazione approssimativa su vetro (Fig. 7.38). Ad una goccia di siero agglutinante (diluizione 1:20) viene aggiunta una sospensione di batteri isolati dal paziente. Si forma un precipitato a scaglie.

Riso. 7.38.

Una prolungata reazione di agglutinazione con un agente patogeno isolato da un paziente (Fig. 7.39). Alle diluizioni del siero agglutinante viene aggiunta una sospensione di batteri isolati dal paziente.

Riso. 52

2. Determinazione degli anticorpi nel siero del sangue del paziente
Una prolungata reazione di agglutinazione con il siero del sangue del paziente (Fig. 7.39). Diagnosticum viene aggiunto alle diluizioni del siero del paziente.
- L'agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal riscaldamento, che trattengono l'antigene 0) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine.
- L'agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formalina, che conservano l'antigene flagellare H) è a grana grossa e procede più velocemente.
3. Test di agglutinazione per la determinazione dei gruppi sanguigni La reazione di agglutinazione per la determinazione dei gruppi sanguigni viene utilizzata per stabilire il sistema ABO (Tabella b) agglutinando gli eritrociti con anticorpi sierici immuni contro gli antigeni dei gruppi sanguigni A (I), B (III). I controlli sono: siero che non contiene anticorpi, cioè gruppi sanguigni sierici AB (IV); antigeni contenuti negli eritrociti dei gruppi A (II), B (III). Il controllo negativo non contiene antigeni, cioè vengono utilizzati eritrociti di gruppo O (I).

Tabella 7.6. Determinazione dei gruppi sanguigni ABO

1.1. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE (RA)

REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE (RA)

Per la sua specificità, facilità di impostazione e dimostratività, la reazione di agglutinazione si è diffusa nella pratica microbiologica per la diagnosi di molte malattie infettive.

La reazione di agglutinazione si basa sulla specificità dell'interazione degli anticorpi (agglutinine) con intere cellule microbiche o di altro tipo (agglutinogeni). Come risultato di questa interazione, si formano particelle - agglomerati che precipitano (agglutinano) sotto forma di scaglie.

Alla reazione di agglutinazione possono partecipare sia batteri vivi che morti, spirochete, funghi, protozoi, rickettsia, nonché eritrociti e altre cellule. La reazione procede in due fasi: la prima (invisibile) specifica, la connessione dell'antigene e degli anticorpi, la seconda (visibile) non specifica, il legame degli antigeni, cioè formazione di agglutinati.

L'agglutinato si forma quando uno centro attivo un anticorpo bivalente con un gruppo antigenico determinante. La reazione di agglutinazione, come ogni reazione sierologica, procede in presenza di elettroliti.

Esternamente, la manifestazione di una reazione di agglutinazione positiva è duplice. Nei microbi non flagellati, che hanno solo un antigene O somatico, le cellule microbiche stesse si uniscono direttamente. Tale agglutinazione è chiamata a grana fine. Si svolge entro 18 22 ore. v

I microbi flagellati hanno due antigeni, l'antigene somatico O e l'antigene flagellare H. Se le cellule si uniscono ai flagelli, si formano grandi fiocchi sciolti e tale reazione di agglutinazione è chiamata a grana grossa. Arriva entro 2 4 ore.

La reazione di agglutinazione può essere impostata sia per la determinazione qualitativa e quantitativa di anticorpi specifici nel siero del sangue del paziente, sia per la determinazione della specie del patogeno isolato. v

La reazione di agglutinazione può essere impostata sia in una versione dettagliata, che consente di lavorare con siero diluito a un titolo diagnostico, sia nella variante di impostazione di una reazione indicativa, che consente, in linea di principio, di rilevare anticorpi specifici o determinare la specie del patogeno.

Quando si imposta una reazione di agglutinazione dettagliata, al fine di rilevare anticorpi specifici nel siero del sangue del soggetto, il siero del test viene prelevato a una diluizione di 1:50 o 1:100. Ciò è dovuto al fatto che nel siero intero o leggermente diluito possono essere presenti anticorpi normali in concentrazioni molto elevate e quindi i risultati della reazione possono essere imprecisi. Il materiale di prova in questa variante della reazione è il sangue del paziente.

Il sangue viene prelevato a stomaco vuoto o non prima di 6 ore dopo un pasto (altrimenti, potrebbero esserci goccioline di grasso nel siero del sangue, rendendolo torbido e inadatto alla ricerca). Il siero del sangue del paziente viene solitamente ottenuto nella seconda settimana della malattia, raccogliendo sterile dalla vena cubitale 3 4 ml di sangue (a questo punto si concentra la quantità massima di anticorpi specifici). Come antigene noto viene utilizzato un diagnostico preparato da cellule microbiche uccise ma non distrutte di una specie specifica con una struttura antigenica specifica.

Quando si imposta una reazione di agglutinazione dettagliata per determinare la specie, il tipo di patogeno, l'antigene è un patogeno vivo isolato dal materiale di prova. Sono noti gli anticorpi contenuti nel siero diagnostico immunitario. v

Il siero immunodiagnostico è ottenuto dal sangue di un coniglio vaccinato. Dopo aver determinato il titolo (la massima diluizione in cui vengono rilevati gli anticorpi), il siero diagnostico viene versato in fiale con l'aggiunta di un conservante. Questo siero viene utilizzato per l'identificazione mediante la struttura antigenica del patogeno isolato.

OPZIONI DI REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE

A queste reazioni prendono parte gli antigeni sotto forma di particelle (cellule microbiche, eritrociti e altri antigeni corpuscolari), che si uniscono agli anticorpi e precipitano.

Tre componenti sono necessari per avviare una reazione di agglutinazione (RA): 1) un antigene (agglutinogeno); 2) anticorpo (agglutinina) e 3) elettrolita (soluzione isotonica di cloruro di sodio).

REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE INDICATIVA (PLATE) (RA)

L'AR approssimativo o lamellare viene posto su un vetrino a temperatura ambiente. Per fare ciò, una goccia di siero in una diluizione di 1:10 1:20 e una goccia di controllo di soluzione isotonica di cloruro di sodio vengono applicate separatamente al vetro con una pipetta Pasteur. Le colonie o una coltura giornaliera di batteri (una goccia di diagnosticum) vengono introdotte in entrambe le anse batteriologiche e miscelate accuratamente. Le reazioni vengono prese in considerazione in pochi minuti visivamente, a volte con una lente d'ingrandimento (x5). Con un RA positivo in una goccia con siero si nota la comparsa di scaglie grandi e piccole, con un negativo il siero rimane uniformemente torbido.

REAZIONE DELL'EMAGLUTINAZIONE INDIRETTA (PASSIVA) (RNHA, RPHA)

La reazione è impostata: 1) per rilevare polisaccaridi, proteine, estratti di batteri e altre sostanze altamente disperse, rickettsiae e virus, i cui complessi con agglutinine non possono essere visti nell'AR ordinaria, o 2) per rilevare anticorpi nel siero di pazienti a questi sostanze altamente disperse e i microrganismi più piccoli.

Per agglutinazione indiretta, o passiva, si intende una reazione in cui gli anticorpi interagiscono con antigeni precedentemente adsorbiti su particelle inerti (lattice, cellulosa, polistirene, ossido di bario, ecc. o eritrociti di ariete, I (0) gruppi sanguigni umani).

Nella reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA), gli eritrociti vengono utilizzati come trasportatori. Gli eritrociti carichi di antigene si uniscono in presenza di anticorpi specifici contro questo antigene e precipitano. Gli eritrociti sensibilizzati all'antigene sono utilizzati in RPHA come diagnostico eritrocitario per la rilevazione di anticorpi (serodiagnosi). Se gli eritrociti sono carichi di anticorpi (anticorpo diagnostico eritrocitario), allora può essere utilizzato per rilevare gli antigeni.

Messa in scena. Nei pozzetti delle compresse di polistirene preparare una serie di diluizioni seriali di siero. 0,5 ml di siero positivo noto vengono aggiunti al penultimo pozzetto e 0,5 ml di soluzione fisiologica (controlli) vengono aggiunti all'ultimo pozzetto. Quindi, 0,1 ml di erythrocyte diagnosticum diluito vengono aggiunti a tutti i pozzetti, agitati e posti in un termostato per 2 ore.

Contabilità. In caso positivo, gli eritrociti si depositano sul fondo del foro sotto forma di uno strato uniforme di cellule con un bordo piegato o frastagliato (un ombrello rovesciato), in caso negativo, si depositano sotto forma di un bottone o di un anello .

1.2. REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE. LISI,
REAZIONE OPSONOFAGOCITICA, REAZIONE DI IPERSENSIBILITÀ

REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELL'ESOTOSSINA CON ANTITOSSINA (RN)

La reazione si basa sulla capacità del siero antitossico di neutralizzare l'azione dell'esotossina. Viene utilizzato per la titolazione di sieri antitossici e la determinazione dell'esotossina.

Quando il siero viene titolato, una certa dose della tossina corrispondente viene aggiunta a diverse diluizioni di siero antitossico. Con la completa neutralizzazione dell'antigene e l'assenza di anticorpi inutilizzati, si verifica la flocculazione iniziale. La reazione di flocculazione può essere utilizzata non solo per la titolazione del siero (ad esempio, difterite), ma anche per la titolazione della tossina e del tossoide. La reazione di neutralizzazione della tossina con l'antitossina ha un grande valore pratico come metodo per determinare l'attività dei sieri terapeutici antitossici. L'antigene in questa reazione è una vera esotossina.

La forza del siero antitossico è determinata dalle unità convenzionali di AE.

1 AU di siero botulinico la sua quantità neutralizza 1000 DLM di tossina botulinica. La reazione di neutralizzazione per determinare la specie o il tipo di esotossina (nella diagnosi di tetano, botulismo, difterite, ecc.) può essere effettuata in vitro (secondo Ramon) e quando si determina la tossigenicità delle cellule microbiche - nel gel ( secondo Ouchterlony).

Reazione di lisi (RL)

Una delle proprietà protettive del siero immunitario è la sua capacità di dissolvere i microbi o gli elementi cellulari che entrano nel corpo.

Anticorpi specifici che causano la dissoluzione (lisi) delle cellule sono chiamati lisine. A seconda della natura dell'antigene, possono essere batteriolisine, citolisine, spirochetolizine, emolisine, ecc.

Le lisine mostrano il loro effetto solo in presenza di un fattore aggiuntivo: il complemento. Complemento come fattore aspecifico immunità umorale trovato in quasi tutti i fluidi corporei tranne liquido cerebrospinale e liquido della camera anteriore. Un contenuto di complemento piuttosto alto e costante si nota nel siero del sangue umano e molto nel siero del sangue. porcellino d'India. In altri mammiferi, il contenuto di complemento nel siero del sangue è diverso.

Il complemento è un sistema complesso proteine ​​del siero di latte. È instabile e crolla a 55 gradi per 30 minuti. A temperatura ambiente, il complemento viene distrutto entro due ore. È molto sensibile allo scuotimento prolungato, all'azione degli acidi e dei raggi ultravioletti. Tuttavia, il complemento viene conservato a lungo (fino a sei mesi) allo stato essiccato a bassa temperatura. Il complemento promuove la lisi delle cellule microbiche e degli eritrociti.

Distingua la reazione di batterioliz e gemoliz.

L'essenza della reazione di batteriolisi è che quando uno specifico siero immunitario viene combinato con le sue corrispondenti cellule microbiche viventi omologhe in presenza di complemento, i microbi vengono lisati.

La reazione di emolisi consiste nel fatto che quando gli eritrociti sono esposti a un siero specifico, immune a loro (emolitico) in presenza di complemento, gli eritrociti si dissolvono, cioè emolisi.

La reazione di emolisi nella pratica di laboratorio viene utilizzata per determinare il tiro del complemento, nonché per tenere conto dei risultati dei test diagnostici di fissazione del complemento. Il titolo del complemento è la quantità minima che provoca la lisi dei globuli rossi entro 30 minuti in un sistema emolitico in un volume di 2,5 ml. La reazione di lisi, come tutte le reazioni sierologiche, avviene in presenza di un elettrolita.

REAZIONI DI IPERSENSIBILITÀ (ALLERGICA).

Alcune forme di antigene, a contatto ripetuto con l'organismo, possono provocare una reazione fondamentalmente specifica, ma che include fattori cellulari e molecolari non specifici di una risposta infiammatoria acuta. Sono note due forme di iperreattività: l'ipersensibilità tipo immediato(GHT) e ipersensibilità di tipo ritardato (DTH). Il primo tipo di reazione si manifesta con la partecipazione di anticorpi, mentre la reazione si sviluppa entro e non oltre 2 ore dopo il ripetuto contatto con l'allergene. Il secondo tipo viene implementato con l'ausilio di cellule T infiammatorie (Tr3) come principali effettori della reazione, che assicurano l'accumulo di macrofagi nella zona infiammatoria, la reazione si manifesta dopo 6-8 ore e successivamente.

Lo sviluppo di una reazione di ipersensibilità è preceduto da un incontro con un antigene e dal verificarsi di sensibilizzazione, ad es. la comparsa di anticorpi, linfociti sensibilizzati attivamente e sensibilizzati passivamente da anticorpi citofili di altri leucociti (macrofagi, granulociti).

Le reazioni di ipersensibilità hanno tre fasi di sviluppo: immunologiche; patochimico; fisiopatologico.

Nella prima fase specifica, l'allergene interagisce con gli anticorpi e (o) le cellule sensibilizzate. Nella seconda fase, c'è un rilascio di biologicamente sostanze attive da cellule attivate. I mediatori rilasciati (istamina, serotonina, leucotrieni, bradichinina, ecc.) provocano vari effetti periferici caratteristici del corrispondente tipo di reazione - la terza fase.

Reazioni di ipersensibilità del quarto tipo

Reazioni di questo tipo sono causate da interazioni intercellulari patogene di Thelper sensibilizzati, linfociti T citotossici (Tkiller) e cellule attivate del sistema dei fagociti mononucleari causate dalla stimolazione prolungata del sistema immunitario da parte di antigeni batterici, in cui vi è una relativa insufficienza del sistema immunitario del corpo sistema per eliminare dall'ambiente interno patogeni batterici malattie infettive. Queste reazioni di ipersensibilità causano cavità polmonari tubercolari, la loro necrosi caseosa e intossicazione generale nei pazienti con tubercolosi. La granulomatosi cutanea nella tubercolosi e nella lebbra in termini morfopatogenetici è in gran parte composta da reazioni di ipersensibilità del quarto tipo.

L'esempio più famoso di una reazione di ipersensibilità di tipo 4 è la reazione di Mantoux, che si sviluppa nel sito di somministrazione intradermica della tubercolina a un paziente il cui corpo e sistema sono sensibilizzati agli antigeni micobatterici. Come risultato della reazione, si forma una densa papula iperemica con necrosi al centro, che compare solo poche ore dopo (lentamente) dopo la somministrazione intradermica di tubercolina. La formazione di papule inizia con l'uscita da letto vascolare negli spazi intercellulari dei fagociti mononucleari del sangue circolante. Contemporaneamente inizia l'emigrazione dal letto vascolare delle cellule polimorfonucleate. Quindi l'infiltrazione dei neutrofili si attenua e l'infiltrato inizia a consistere prevalentemente di linfociti e fagociti mononucleati. Questa è la differenza tra la reazione di Mantoux e la reazione di Arthus, in cui i leucociti prevalentemente polimorfonucleati si accumulano nel sito della lesione.

Nelle reazioni di ipersensibilità del quarto tipo, la stimolazione prolungata dei linfociti sensibilizzati con antigeni porta a alterazioni patologiche tessuti al rilascio patologicamente intenso e prolungato di citochine da parte di Thelpers. Un intenso rilascio di citochine nei loci del danno tissutale provoca l'iperattivazione delle cellule del sistema di fagociti mononucleari ivi localizzati, molti dei quali formano filamenti di cellule epitelioidi in uno stato iperattivato, e alcuni si fondono tra loro per formare cellule giganti. I macrofagi, sulla cui superficie sono esposti antigeni batterici e virali, possono essere distrutti attraverso il funzionamento dei Tkiller (killer naturali).

La reazione di ipersensibilità del quarto tipo è indotta dal riconoscimento di un antigene batterico estraneo da parte di T-helper sensibilizzati verso di esso. Una condizione necessaria per il riconoscimento è l'interazione degli induttori con gli antigeni esposti sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene dopo l'endocitosi e l'elaborazione di immunogeni estranei da parte dei fagociti mononucleati. Altro condizione necessaria esposizione di antigeni in combinazione con molecole di classe I dal principale complesso di compatibilità tissutale. Dopo il riconoscimento dell'antigene, gli helper sensibilizzati rilasciano citochine e, in particolare, interleuchina2, che attiva natural killer e fagociti mononucleati. I fagociti mononucleari attivati ​​rilasciano enzimi proteolitici e radicali liberi dell'ossigeno che danneggiano i tessuti.

Test cutanei test per stabilire la sensibilizzazione del corpo agli allergeni, determinarne l'infezione, ad esempio tubercolosi, brucellosi, livello immunità di gregge come la tularemia. A seconda del luogo di introduzione dell'allergene esistono: 1) test cutanei; 2) scarificante; 3) intradermico; 4) sottocutaneo. La reazione clinica a un allergene in un test allergico cutaneo è suddivisa in locale, generale e focale, nonché immediata e ritardata.

Le reazioni locali del tipo mediatore di HIT si verificano dopo 5-20 minuti, sono espresse come eritema e vesciche, scompaiono dopo poche ore, sono stimate con il metodo plus dalla quantità di eritema, misurata in mm. Le reazioni locali della TOS si verificano dopo 24-48 ore, durano a lungo, appaiono come un infiltrato, a volte con necrosi al centro, e sono valutate dalla dimensione dell'infiltrato in mm, anche dal sistema plus. Nei tipi citotossici e immunocomplessi di GNT, l'iperemia e l'infiltrazione si osservano dopo 3-4 ore, raggiungono un massimo a 6-8 ore e regrediscono dopo circa un giorno. A volte si osservano reazioni combinate.

1.3. REAZIONE DI LEGAME DEL COMPLEMENTO (CFR)

Questa reazione è usata per ricerca di laboratorio per la rilevazione di anticorpi nel siero del sangue in varie infezioni, nonché per l'identificazione dell'agente patogeno mediante struttura antigenica.

Il test di fissazione del complemento è un test sierologico complesso ed è caratterizzato da elevata sensibilità e specificità.

Una caratteristica di questa reazione è che il cambiamento nell'antigene durante la sua interazione con anticorpi specifici avviene solo in presenza di complemento. Il complemento è adsorbito solo sul complesso anticorpo-antigene. Un complesso antigene-anticorpo si forma solo se esiste un'affinità tra l'antigene e l'anticorpo presente nel siero.

L'adsorbimento del complemento sul complesso "antigene anticorpo" può influenzare il destino dell'antigene in modi diversi, a seconda delle sue caratteristiche.

Alcuni degli antigeni sono esposti in queste condizioni a un forte cambiamenti morfologici, fino alla dissoluzione (emolisi, fenomeno Isaev Pfeifer, effetto citolitico). Altri cambiano la velocità del movimento (immobilizzazione del treponema). Altri ancora muoiono senza affilato cambiamenti distruttivi(azione battericida o citotossica). Infine, l'adsorbimento del complemento potrebbe non essere accompagnato da cambiamenti nell'antigene facilmente osservabili.

Secondo il meccanismo, RSC procede in due fasi:

1. La prima fase è la formazione del complesso "antigene anticorpo" e l'adsorbimento su questo complesso del complemento. Il risultato della fase non è visivamente visibile (l'interazione di antigene e anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento).
2. La seconda fase è un cambiamento nell'antigene sotto l'influenza di anticorpi specifici in presenza di complemento. Il risultato della fase può essere visivamente visibile o non visibile (rilevamento dei risultati della reazione utilizzando un sistema emolitico indicatore (eritrociti di pecora e siero emolitico).

La distruzione degli eritrociti da parte del siero emolitico si verifica solo in caso di attaccamento del complemento al sistema emolitico. Se il complemento è stato adsorbito in precedenza sul complesso antigene-anticorpo, non si verifica l'emolisi degli eritrociti.

Il risultato dell'esperimento viene valutato rilevando la presenza o l'assenza di emolisi in tutte le provette. La reazione è considerata positiva con un completo ritardo nell'emolisi, quando il liquido nella provetta è incolore e gli eritrociti si depositano sul fondo, negativa con completa lisi degli eritrociti, quando il liquido è intensamente colorato (sangue "lacca"). Il grado di ritardo dell'emolisi è stimato in base all'intensità del colore del liquido e alla quantità di sedimento eritrocitario sul fondo (++++, +++, ++, +).

Nel caso in cui i cambiamenti nell'antigene rimangano inaccessibili per l'osservazione visiva, è necessario utilizzare un secondo sistema che funge da indicatore che consente di valutare lo stato del complemento e trarre una conclusione sul risultato della reazione.

Questo sistema indicatore è rappresentato dai componenti della reazione di emolisi, che comprende eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi specifici contro gli eritrociti (emolisine), ma non contenente complemento. Questo sistema indicatore viene aggiunto alle provette un'ora dopo aver impostato il CSC principale. Se la reazione di fissazione del complemento è positiva, si forma un complesso anticorpo-antigene che adsorbe il complemento su se stesso. Poiché il complemento viene utilizzato nella quantità necessaria per una sola reazione e la lisi degli eritrociti può avvenire solo in presenza del complemento, quando viene adsorbito sul complesso "antigene anticorpo", la lisi degli eritrociti nel sistema emolitico (indicatore) non si verificherà . Se la reazione di fissazione del complemento è negativa, il complesso "antigene anticorpo" non si forma, il complemento rimane libero e quando viene aggiunto il sistema emolitico si verifica la lisi degli eritrociti.

1.4. DNAPROBES. REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR),
METODO ENZIMATICO IMMUNITARIO (ELISA), METODO ANTICORPI FLUORESCENTI (MFA)

METODI DI Sondaggio GENE

L'intenso sviluppo della biologia molecolare e la creazione di una base metodologica perfetta per la ricerca genetica sono state la base Ingegneria genetica. Nel campo della diagnostica, è emersa e si sta rapidamente sviluppando una direzione per determinare specifiche sequenze nucleotidiche di DNA e RNA, il cosiddetto sondaggio genico. Tali metodi si basano sulla capacità degli acidi nucleici di ibridarsi per formare strutture a doppio filamento dovute all'interazione di nucleotidi complementari (AT, GC).

Per determinare la sequenza di DNA (o RNA) desiderata, viene appositamente creata una cosiddetta sonda polinucleotidica con una specifica sequenza di basi. Nella sua composizione viene introdotta un'etichetta speciale, che consente di identificare la formazione del complesso.

Sebbene il sondaggio genico non possa essere attribuito ai metodi dell'analisi immunochimica, il suo principio principale (interazione di strutture complementari) è implementato metodicamente allo stesso modo dei metodi indicatori dell'immunodiagnostica. Inoltre, i metodi di sondaggio genetico consentono di inserire informazioni su un agente infettivo in assenza della sua espressione fenotipica (virus incorporati nel genoma, geni "silenti").

Per l'analisi del DNA, il campione viene sottoposto a denaturazione al fine di ottenere strutture a singolo filamento, con le quali reagiscono le molecole di DNA o RNAprobe. Le sonde vengono preparate utilizzando entrambi varie sezioni DNA (o RNA) isolato da una fonte naturale (ad esempio, uno o un altro microrganismo), solitamente presentato come sequenze genetiche come parte di plasmidi vettoriali o oligonucleotidi sintetizzati chimicamente. In alcuni casi, come sonda vengono utilizzate preparazioni di DNA genomico idrolizzato in frammenti, a volte preparazioni di RNA, soprattutto spesso RNA ribosomiale. Gli stessi indicatori sono usati come etichetta, come in vari tipi analisi immunochimiche: isotopi radioattivi, fluoresceine, biotopo (con ulteriore manifestazione da parte del complesso avidinenzyme), ecc.

L'ordine dell'analisi è determinato dalle proprietà della sonda disponibile

Attualmente vengono sempre più utilizzati kit commerciali contenenti tutti gli ingredienti necessari.

Nella maggior parte dei casi, la procedura di analisi può essere suddivisa nelle seguenti fasi: preparazione del campione (compresa l'estrazione e la denaturazione del DNA), fissazione del campione su un supporto (il più delle volte, un filtro a membrana polimerica), preibridazione, ibridazione stessa, lavaggio dei prodotti non legati, rilevamento. Privo di farmaco standard La sonda DNA o RNA viene preliminarmente ottenuta ed etichettata.

Per la preparazione del campione, potrebbe essere necessario "far crescere" il materiale di prova per identificare singole colonie batteriche o aumentare la concentrazione di virus in coltura cellulare. Analisi diretta di campioni di sangue, siero, urina, elementi sagomati sangue o sangue intero per la presenza di un agente infettivo. Per liberare gli acidi nucleici dalla composizione delle strutture cellulari, le cellule vengono sottoposte a lisi e, in alcuni casi, la preparazione del DNA viene purificata mediante fenolo.

La denaturazione del DNA, cioè il suo passaggio a una forma a filamento singolo, si verifica durante il trattamento con alcali. Il campione di acido nucleico viene quindi fissato su un supporto di membrana di nitrocellulosa o nylon, solitamente mediante incubazione da 10 minuti a 4 ore a 80°C sotto vuoto. Inoltre, nel processo di preibridazione, si ottiene l'inattivazione dei siti di legame liberi per ridurre l'interazione non specifica della sonda con la membrana. Il processo di ibridazione richiede da 2 a 20 ore, a seconda della concentrazione di DNA nel campione, della concentrazione della sonda utilizzata e delle sue dimensioni.

Dopo che l'ibridazione è stata completata e i prodotti non legati sono stati lavati via, viene rilevato il complesso risultante. Se la sonda contiene un'etichetta radioattiva, la membrana viene esposta alla pellicola fotografica per manifestare la reazione (autoradiografia). Per altre etichette, utilizzare le procedure appropriate.

La più promettente è la produzione di sonde non radioattive (le cosiddette fredde). Sulla stessa base è in fase di sviluppo una tecnica di ibridazione che consente di stabilire la presenza di un patogeno nelle preparazioni di sezioni, punture tissutali, particolarmente importante nell'analisi patomorfologica (ibridazione in situ).

Un passo essenziale nello sviluppo dei metodi di sondaggio genico è stato l'uso della reazione di amplificazione della polimerasi (PCR). Questo approccio consente di aumentare la concentrazione di una specifica sequenza di DNA (precedentemente nota) in un campione sintetizzandone più copie in vitro. Per effettuare la reazione si aggiungono al preparato enzimatico DNA polimerasi, un eccesso di deossinucleotidi per la sintesi e i cosiddetti primer, due tipi di oligonucleotidi di 20-25 basi corrispondenti alle sezioni terminali della sequenza di DNA di interesse. Campione di DNA in fase di studio. Uno dei primer deve essere una copia dell'inizio della regione di lettura del filamento di DNA codificante nella direzione di lettura 53, e il secondo deve essere una copia dell'estremità opposta del filamento non codificante. Quindi, ad ogni ciclo della reazione della polimerasi, il numero di copie del DNA viene raddoppiato.

Per il legame dei primer è necessaria la denaturazione del DNA (fusione) a 94°C, seguita dal portare la miscela a 4055°C.

Per eseguire la reazione, sono stati progettati incubatori per microcampioni programmabili per alternare facilmente le variazioni di temperatura ottimali per ciascuna fase della reazione.

La reazione di amplificazione può aumentare significativamente la sensibilità dell'analisi durante il sondaggio genico, che è particolarmente importante a basse concentrazioni dell'agente infettivo.

Uno dei vantaggi significativi del sondaggio genico con amplificazione è la possibilità di studiare una quantità submicroscopica di materiale patologico.

Un'altra caratteristica del metodo, più importante per l'analisi di materiale infettivo, è la capacità di rilevare geni nascosti (silenti). I metodi relativi all'uso del sondaggio genetico saranno certamente introdotti più ampiamente nella pratica della diagnosi delle malattie infettive man mano che diventeranno più semplici ed economici.

I metodi ELISA e RIF sono per lo più qualitativi o semiquantitativi. A molto basse concentrazioni componenti, la formazione di un complesso antigene-anticorpo non può essere registrata né visivamente né con semplici mezzi strumentali. L'indicazione del complesso antigene anticorpo in tali casi può essere effettuata se uno dei componenti iniziali antigene o anticorpo presenta un marcatore che può essere facilmente rilevato in concentrazioni paragonabili alla concentrazione dell'analita da determinare.

Isotopi radioattivi (ad esempio 125I), sostanze fluorescenti ed enzimi possono essere utilizzati come etichetta.

A seconda dell'etichetta utilizzata, esistono metodi di analisi radioimmune (RIA), immunofluorescente (FIA), saggio immunoenzimatico (ELISA), ecc. l'anno scorso largo uso pratico ha ricevuto un ELISA, che è associato alla possibilità determinazioni quantitative, alta sensibilità, specificità e automazione della contabilità.

Metodi di analisi ELISA un gruppo di metodi che consentono la rilevazione di un complesso di anticorpi antigene utilizzando un substrato che viene scisso da un enzima con l'aspetto del colore.

L'essenza del metodo risiede nella combinazione dei componenti della reazione dell'antigene anticorpo con un'etichetta enzimatica misurata. L'antigene o l'anticorpo che reagisce è marcato con un enzima. Dalla trasformazione del substrato sotto l'azione dell'enzima, si può giudicare la quantità del componente di reazione antigene-anticorpo che è entrato nell'interazione. L'enzima in questo caso funge da marcatore della risposta immunitaria e permette di osservarla visivamente o strumentalmente.

Gli enzimi sono etichette molto convenienti perché le loro proprietà catalitiche consentono loro di agire come esaltatori, poiché una molecola di enzima può produrre più di 1 x 105 molecole di prodotto catalitico al minuto. È necessario scegliere un enzima che conservi a lungo la sua attività catalitica, non la perda quando si lega ad un antigene o ad un anticorpo e abbia un'elevata specificità rispetto al substrato.

I principali metodi per ottenere anticorpi o antigeni marcati con un enzima, coniugati: ingegneria chimica, immunologica e genetica. Gli enzimi sono più spesso usati per ELISA: perossidasi di rafano, fosfatasi alcalina, galattosidasi, ecc.

Per rilevare l'attività dell'enzima nel complesso antigene-anticorpo ai fini della contabilità visiva e strumentale della reazione, vengono utilizzati substrati cromogenici, le cui soluzioni, inizialmente incolori, nel processo reazione enzimatica acquisire un colore la cui intensità è proporzionale alla quantità di enzima. Pertanto, per rilevare l'attività della perossidasi di rafano in ELISA in fase solida, viene utilizzato come substrato l'acido 5aminosalicilico, che conferisce un colore marrone intenso, l'ortofenilendiammina, che forma un colore giallo-arancio. Per rilevare l'attività della fosfatasi alcalina e della ?galatosidasi, vengono utilizzati rispettivamente nitrofenilfosfati e nitrofenilgalattosidi.

Il risultato della reazione nella formazione di un prodotto colorato viene determinato visivamente o utilizzando uno spettrofotometro che misura l'assorbimento della luce con una certa lunghezza d'onda.

Ci sono molte opzioni per mettere in scena ELISA. Esistono varianti omogenee ed eterogenee.

In base al metodo di impostazione, si distinguono metodi ELISA competitivi e non competitivi. Se nella prima fase sono presenti nel sistema solo il composto analizzato ei suoi corrispondenti centri di legame (antigene e anticorpi specifici), allora il metodo è non competitivo. Se il composto analizzato (antigene) e il suo analogo (antigene marcato con enzima) sono presenti al primo stadio e competono tra loro per legarsi ai centri di legame specifici (anticorpi) presenti nella carenza, allora il metodo è competitivo. In questo caso, più l'antigene studiato contiene la soluzione, il meno quantità antigeni marcati leganti.

METODO CON ANTICORPI FLUORESCENTI (MFA) o REAZIONI DI IMMUNOFLUORESCENZA (RIF)

Il metodo immunofluorescente è il metodo di scelta per la rapida rilevazione e identificazione di un microrganismo sconosciuto nel materiale di prova.

Ag + AT + elettrolita = complesso luminoso UV

Siero microbico marcato con fluorocromo

Il colorante isotiocianato di fluoresceina è spesso utilizzato FITC

In questo studio viene utilizzato un microscopio a fluorescenza.

Messa in scena RIF

30 µl di una soluzione di anticorpi marcati con FITC vengono applicati allo striscio.

Mettere il bicchiere in camera umida e incubare a temperatura ambiente per 20-25 minuti, oppure in termostato a 37°C per 15 minuti.

Sciacquare il bicchiere in acqua corrente per 2 minuti, sciacquare con acqua distillata e asciugare all'aria.

Una goccia di liquido di montaggio viene applicata allo striscio essiccato, lo striscio viene coperto con un vetrino coprioggetto e sottoposto a microscopio utilizzando un microscopio a fluorescenza o un attacco fluorescente a un microscopio ottico convenzionale.

in microbiologia

"Reazione di agglutinazione e suoi tipi (RA)"

Piano:

1. Introduzione……………………………………………………………………………………..3

2. RA su vetro…………………………………………………………………………….4

3. Provetta PA……………………………………………………………………………….5

4. Letteratura utilizzata……………………………………………………………………..7

1. Introduzione.

L'interazione dell'antigene microbico e degli anticorpi è strettamente specifica ed è diretta nel corpo animale a neutralizzare l'agente patogeno e le sue tossine. L'interazione di antigene e anticorpi in vitro in determinate condizioni è accompagnata da fenomeni visibili (agglutinazione, precipitazione, lisi immunitaria), che consente l'utilizzo di reazioni AG-AT, dette sierologiche (dal latino siero-siero), a fini pratici. Le biofabbriche producono antigeni e sieri immuni (anticorpi) di una direzione specifica nota (diagnostica). Con l'aiuto di tali sieri nelle reazioni sierologiche, è possibile identificare un microrganismo sconosciuto o, utilizzando un antigene noto, rilevare anticorpi nel corpo sintetizzati in risposta all'introduzione di un agente patogeno, e quindi fare una diagnosi (diagnosi sierologica) . Inoltre, le reazioni sierologiche possono essere utilizzate per valutare l'intensità della risposta immunitaria dopo la vaccinazione o una malattia infettiva.

Le reazioni di agglutinazione, come l'agglutinazione indiretta e Coombs, si basano sull'interazione in vitro degli antigeni corpuscolari con gli anticorpi e sulla capacità dei complessi risultanti di precipitare. Come antigeni corpuscolari, vengono utilizzate cellule batteriche o antigeni solubili estratti da microrganismi e adsorbiti su corpuscoli di portatori: eritrociti, particelle di lattice, ecc.

I determinanti antigenici degli antigeni corpuscolari interagiscono specificamente con anticorpi omologhi (fase specifica, invisibile della reazione), e quindi i complessi antigene-anticorpo formano conglomerati grandi, visibili ad occhio nudo che precipitano - agglutinano (fase non specifica, visibile della reazione) . Nelle forme non flagellate di microbi (Brucella), si formano agglutinanti granulari, in flagelli (Escherichia, Salmonella) - cotone di grandi dimensioni, che si depositano sul fondo della provetta sotto forma di un ombrello capovolto e si rompono facilmente quando vengono agitati . Antigeni e anticorpi interagiscono solo in presenza di un elettrolita (in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,8%). L'andamento della reazione è influenzato dalla concentrazione salina nell'elettrolita, dal numero di cellule microbiche in sospensione, dalla concentrazione sierica, dal pH, dalla temperatura e da altri fattori.

Reazione di agglutinazione (ra).

Distinguere l'agglutinazione specifica, lo sciame si basa sull'interazione dell'antigene Insieme a anticorpo omologo , contenuto nel corpo dell'animale, Krom è stato introdotto questo antigene (immunoagglutinazione); non specifico (chimico), derivante da variazioni del pH dell'ambiente, concentrazione di elettroliti; spontaneo, to-ruyu si osserva quando i batteri (che sono nella forma R) sono sospesi in soluzione salina e quando riscaldati, il che è associato a un cambiamento nello stato colloidale della cellula batterica. Antigene , coinvolto nell'AR è chiamato agglutinogeno, l'anticorpo è chiamato agglutinina, il precipitato risultante è chiamato agglutinato. Nella formazione dell'agglutinato conta il rapporto quantitativo tra antigene e anticorpi (fenomeno ottimale). Con un eccesso o una carenza di anticorpi, A.

La reazione di agglutinazione (RA) è una delle prime reazioni immunologiche utilizzate nella pratica microbiologica. Per la prima volta (1895) F. Vidal utilizzò l'AR per la diagnosi della febbre tifoide. Successivamente (1897), A. Wright usò la stessa reazione per diagnosticare la brucellosi negli esseri umani. RA ha anche trovato applicazione nella diagnosi di pullorosi di polli, leptospirosi, aborto infettivo di fattrici, nonché per la tipizzazione di colture sconosciute di microbi secondo il noto siero agglutinante. RA è altamente sensibile; può rilevare 0,01 µg di azoto proteico anticorpale in 1 ml.

Sono state sviluppate diverse varianti della reazione di agglutinazione, che differiscono nell'implementazione metodologica e nello scopo dello studio.

2. Ra su vetro.

In questa variante di RA, possono essere testati sia il siero che l'antigene, ma questa variante è più spesso utilizzata per l'identificazione di microrganismi.

1. Per identificare il microrganismo (m/o), una goccia di siero agglutinante noto, come salmoneliosi, e una goccia di soluzione fisiologica (controllo) vengono applicate separatamente su un vetrino sgrassato. Quindi, utilizzando un'ansa batteriologica, la massa batterica della coltura studiata viene prelevata dalla colonia in una capsula di Petri o dalla superficie dell'MPA inclinata in una provetta e sospesa separatamente in siero immunitario e soluzione fisiologica fino ad ottenere una sospensione omogenea . Il risultato viene preso in considerazione dopo 2 ... 4 minuti.

Contabilizzazione dei risultati: non dovrebbero esserci cambiamenti nel campione di controllo. Con una corrispondenza specifica della coltura batterica al siero immunitario, compaiono scaglie di agglutinato (risultato positivo), in assenza del fenomeno di agglutinazione, si conclude che la coltura batterica studiata non corrisponde al siero immunitario.

2. La rilevazione di anticorpi nel siero del sangue studiato sarà presa in considerazione utilizzando l'esempio del test del rosa bengala utilizzato nella sierodiagnosi della brucellosi. 0,3 ml del siero di sangue animale studiato e 0,03 ml di antigene di brucella (cellule di brucella colorate con rosa Bengala) vengono applicati su un vetrino. I componenti vengono accuratamente miscelati agitando il bicchiere e il risultato viene preso in considerazione dopo 4 minuti.

Risultati contabili: con una reazione positiva compaiono scaglie rosa di agglutinato. Una reazione sierologica di questo tipo è classificata come qualitativa, poiché può essere utilizzata per rilevare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue dell'animale, ma è impossibile valutarne il contenuto quantitativo.