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Le fasi principali della ricerca virologica. Linee guida per lo studio del materiale teorico nel corso “Virologia medica privata. Metodi di ricerca virologica indiretta

La diagnosi di infezioni intestinali acute è stabilita sulla base di dati clinici ed epidemiologici, con conferma di laboratorio obbligatoria. Senza conferma di laboratorio, la diagnosi di infezioni intestinali acute può essere effettuata solo nei casi in cui vi siano dati epidemiologici chiaramente stabiliti (nei focolai di infezione e nei focolai di malattie di gruppo decifrati in laboratorio nella maggior parte dei pazienti).

Per la diagnosi finale vengono utilizzati metodi di ricerca batteriologici, virologici e sierologici.Il metodo coprologico, così come i risultati della sigmoidoscopia (per la shigellosi), sono di secondaria importanza.

IO. Metodo batteriologico riveste la massima importanza nell'IAI causata dalla flora batterica (diarrea invasiva e secretoria). I migliori risultati si ottengono seminando le feci direttamente al letto del paziente, prima della nomina della terapia antibiotica e con la sua consegna al laboratorio batteriologico nelle prime due ore dal momento del prelievo. Per lo studio è necessario scegliere particelle contenenti impurità patologiche, ma non sangue. Il biomateriale viene seminato sui terreni selettivi di Ploskirev, Levin e altri. La frequenza dei risultati positivi (inoculazione del patogeno e sua identificazione), anche in presenza di manifestazioni cliniche tipiche di AII. Non supera il 70-80%.

II. Metodi sierologici la diagnostica, di norma, viene utilizzata in casi dubbi e con risultati negativi dell'esame batteriologico delle feci. Nei bambini dei primi mesi vita, non è informativo, ma in tutti i casi, l'aumento del titolo anticorpale di 4 volte o più è importante. Vengono eseguiti in due direzioni: la determinazione del titolo di anticorpi specifici nel siero del sangue del paziente e l'antigene nelle feci.

Per determinare il titolo di anticorpi specifici, viene solitamente utilizzato RNHA, meno spesso RPHA o RA. Come antigeni, viene prelevata una sospensione di una coltura giornaliera di batteri (RA) o un diagnostico eritrocitario. ( RPGA, RNGA). Più affidabile dovrebbe essere considerato un aumento dei titoli anticorpali nella dinamica della malattia. Anticorpi specifici nel sangue di un paziente con III compaiono nel 3°-5° giorno di malattia e aumentano fino a un massimo entro 2-3 settimane, per poi diminuire gradualmente. Nei bambini piccoli, specialmente quelli con un background premorboso alterato, gli anticorpi specifici nel sangue non vengono rilevati o hanno titoli bassi (1:50 - 1:100).

In presenza di sintomi clinici tipici e la rilevazione di un titolo diagnostico di anticorpi specifici (1:200 e superiore con il corrispondente diagnostico), o un aumento del loro titolo nella dinamica della malattia, la diagnosi clinica di infezione intestinale dovrebbe essere considerato stabilito anche in assenza di semina del patogeno dalle feci del paziente.

III. Metodi di diagnostica rapida Le infezioni intestinali si basano sul rilevamento dell'antigene patogeno (batterio o virus) dalle feci, per il quale viene utilizzato il metodo diretto degli anticorpi luminescenti (PMLA) o il metodo di immunoadsorbimento - reazione di agglomerazione del carbone (RCA). risultato preliminare può essere ottenuto in 2-3 ore, l'ultima in un giorno. La specificità del metodo è dell'82-94,6%.

IN l'anno scorso per una diagnosi rapida della diarrea, vengono utilizzati il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e l'agglutinazione al lattice (RLA).

La decodifica eziologica della diarrea virale viene effettuata utilizzando metodi virologici e batteriologici.

Il periodo ottimale per il rilevamento dei virus nelle feci è considerato da 1 a 4 giorni di malattia, sebbene l'agente patogeno spesso persista più a lungo.

Il metodo principale utilizzato è il metodo della microscopia elettronica, che consente caratteristiche morfologiche identificare un'ampia gamma di agenti virali che causano la gastroenterite.

Viene utilizzata anche la microscopia immunoelettronica (basata sulla capacità delle particelle virali in presenza di sieri omologhi o sieri convalescenti di formare aggregati di particelle di rotavirus con immunoglobuline.

Tra i metodi di sierodiagnostica, quelli tradizionali includono la reazione di neutralizzazione, l'inibizione dell'emoagglutinazione, la fissazione del complemento Un aumento da due a quattro volte degli anticorpi nei sieri accoppiati ha un valore retrospettivo per la diagnosi infezione da rotavirus. ELISA, precipitazione diffusa, agglutinazione al lattice, reazione di coagglutinazione vengono utilizzate per rilevare i rotavirus oi loro antigeni.

Nel lavoro pratico, l'IFA ha preso il posto più ampio – isolamento di antigeni di rotavirus in coprofiltri. È meglio utilizzare questi metodi in dinamica (il primo giorno di ricovero e dopo il recupero clinico).

Per escludere l'eziologia batterica dell'AII, viene eseguito anche uno studio batteriologico delle feci mediante inoculazione su terreni nutritivi.

sigmoidoscopia il metodo è usato raramente nei bambini, principalmente per determinare la causa dell'escrezione batterica prolungata e la diagnosi di forme protratte e croniche della malattia. Questo metodo di esame consente di valutare solo la natura dei cambiamenti morfologici nelle mucose. distale intestino, ma non può essere utilizzato per fare una diagnosi eziologica di infezione intestinale.

Indicazioni per l'esame strumentale (ecografia, esame a raggi X degli organi cavità addominale, FGS) con AII è la necessità di una diagnosi differenziale con malattie chirurgiche degli organi addominali (invaginazione, appendicite), malattie somatiche (gastrite, ulcera peptica, colecistopancreatite, ecc.) E disturbi funzionali del tratto gastrointestinale.

Determinazione della forma clinica di tossicosi (neurotossicosi, tossicosi con esicosi, TSS), grado (stadio), tipo di disidratazione nella diarrea infettiva nei bambini e cure di emergenza

metodi per studiare la biologia dei virus e la loro identificazione. In virologia sono ampiamente utilizzati metodi di biologia molecolare, con l'aiuto dei quali è stato possibile stabilire la struttura molecolare delle particelle virali, come penetrano nella cellula e le caratteristiche della riproduzione dei virus, la struttura primaria del virus acidi nucleici e proteine. Sono in fase di sviluppo metodi per determinare la sequenza degli elementi costitutivi degli acidi nucleici virali e degli amminoacidi proteici. Diventa possibile collegare le funzioni degli acidi nucleici e delle proteine da essi codificate con la sequenza nucleotidica e stabilire le cause dei processi intracellulari che giocano un ruolo importante nella patogenesi di un'infezione virale.

Anche i metodi di ricerca virologica sono basati su processi immunologici(interazione dell'antigene con anticorpi), proprietà biologiche del virus (capacità di emoagglutinare, emolisi, attività enzimatica), caratteristiche dell'interazione del virus con la cellula ospite (la natura dell'effetto citopatico, la formazione di inclusioni intracellulari, ecc. .).

Nella diagnosi delle infezioni virali, nella coltivazione, nell'isolamento e nell'identificazione dei virus, nonché nella preparazione dei preparati vaccinali, è ampiamente utilizzato il metodo della coltura di tessuti e cellule. Vengono utilizzate colture cellulari primarie, secondarie, continue stabili e diploidi. Le colture primarie si ottengono disperdendo il tessuto con enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi). La fonte delle cellule può essere tessuti e organi (più spesso reni) di embrioni umani e animali. Una sospensione di cellule in un mezzo nutritivo viene posta nei cosiddetti materassi, bottiglie o capsule di Petri, dove, dopo essersi attaccate alla superficie del vaso, le cellule iniziano a moltiplicarsi. Per l'infezione da virus, di solito viene utilizzato un monostrato cellulare. Il liquido nutritivo viene drenato, la sospensione virale viene introdotta in determinate diluizioni e, dopo il contatto con le cellule, viene aggiunto mezzo nutritivo fresco, solitamente senza siero.

Le cellule della maggior parte delle colture primarie possono essere sottocoltivate e sono indicate come colture secondarie. Con l'ulteriore passaggio delle cellule, si forma una popolazione di cellule simili ai fibroblasti, in grado di riprodursi rapidamente, la maggior parte che conserva il set originale di cromosomi. Queste sono le cosiddette cellule diploidi. Nella coltivazione in serie di cellule si ottengono colture cellulari continue stabili. Durante i passaggi compaiono cellule omogenee in rapida divisione con un insieme eteroploide di cromosomi. Le linee cellulari stabili possono essere monostrato e sospensione. Le colture monostrato crescono sotto forma di uno strato continuo sulla superficie del vetro, le colture in sospensione crescono sotto forma di sospensioni vari vasi utilizzando i mixer. Ci sono oltre 400 linee cellulari derivate da 40 vari tipi animali (inclusi primati, uccelli, rettili, anfibi, pesci, insetti) e umani.

In artificiale mezzi nutritivi i pezzi possono essere coltivati singoli corpi e tessuti (colture di organi). Questi tipi di colture preservano la struttura dei tessuti, che è particolarmente importante per l'isolamento e il passaggio di virus che non si riproducono in colture di tessuti indifferenziati (ad esempio, coronavirus).

Negli infetti colture cellulari i virus possono essere rilevati da un cambiamento nella morfologia cellulare, dall'azione citopatica, che può essere specifica, dalla comparsa di inclusioni, dalla determinazione degli antigeni virali nella cellula e nel fluido di coltura; determinazione delle proprietà biologiche della progenie virale nel fluido di coltura e titolazione dei virus nella coltura di tessuti, embrioni di pollo o animali sensibili; rilevando singoli acidi nucleici virali nelle cellule mediante ibridazione molecolare o gruppi di acidi nucleici mediante metodo citochimico mediante microscopia a fluorescenza.

L'isolamento dei virus è un processo lungo e laborioso. Viene eseguito per determinare il tipo o la variante del virus circolante nella popolazione (ad esempio, per identificare la sierovariante del virus dell'influenza, selvaggio o ceppo vaccinale poliomielite, ecc.); nei casi in cui è necessario eseguire misure epidemiologiche urgenti; quando compaiono nuovi tipi o varianti di virus; se necessario, confermare la diagnosi preliminare; per indicare virus negli oggetti ambiente. Quando si isolano i virus, viene presa in considerazione la possibilità della loro persistenza nel corpo umano, nonché il verificarsi di un'infezione mista causata da due o più virus. Una popolazione geneticamente omogenea di un virus ottenuta da un singolo virione è chiamata clone virale e il processo per ottenerlo è chiamato clonazione.

Per isolare i virus, viene utilizzata l'infezione di animali da laboratorio suscettibili, embrioni di pollo, ma viene spesso utilizzata la coltura tissutale. La presenza del virus è solitamente determinata dalla specifica degenerazione cellulare ( effetto citopatico), la formazione di simplasti e sincizi, il rilevamento di inclusioni intracellulari, nonché un antigene specifico rilevato mediante immunofluorescenza, emoassorbimento, emoagglutinazione (nei virus emoagglutinanti), ecc. Questi segni possono essere rilevati solo dopo 2-3 passaggi del virus.

Per l'isolamento di una serie di virus, come i virus dell'influenza, vengono utilizzati embrioni di pollo, per l'isolamento di alcuni virus Coxsackie e una serie di arbovirus vengono utilizzati topi appena nati. L'identificazione dei virus isolati viene effettuata utilizzando reazioni sierologiche e altri metodi.

Quando si lavora con i virus, viene determinato il loro titolo. La titolazione dei virus viene solitamente eseguita nella coltura tissutale, determinando la massima diluizione del fluido contenente il virus, in corrispondenza della quale si verifica la degenerazione dei tessuti, si formano inclusioni e antigeni specifici del virus. Il metodo della placca può essere utilizzato per titolare un certo numero di virus. Le placche, o colonie negative di virus, sono focolai di cellule distrutte dal virus di una coltura tissutale a strato singolo sotto rivestimento di agar. Il conteggio delle colonie lo consente analisi quantitativa attività infettiva dei virus sulla base del fatto che una particella infettiva del virus forma una placca. Le placche vengono identificate colorando la coltura con coloranti vitali, solitamente rosso neutro; le placche non assorbono il colorante e quindi sono visibili come punti luminosi sullo sfondo delle cellule viventi colorate. Il titolo del virus è espresso come numero di unità formanti placca in 1 ml.

La purificazione e la concentrazione dei virus viene solitamente effettuata mediante ultracentrifugazione differenziale seguita da centrifugazione in gradienti di concentrazione o densità. Per purificare i virus vengono utilizzati metodi immunologici, cromatografia a scambio ionico, immunosorbenti, ecc.

La diagnosi di laboratorio delle infezioni virali include il rilevamento dell'agente patogeno o dei suoi componenti nel materiale clinico; isolamento del virus da questo materiale; sierodiagnosi. La scelta del metodo diagnostico di laboratorio in ogni singolo caso dipende dalla natura della malattia, dal periodo della malattia e dalle capacità del laboratorio. Diagnostica moderna infezioni virali si basa su modalità espresse che consentono di avere una risposta poche ore dopo l'assunzione del materiale clinico prime date dopo la malattia, Questi includono la microscopia elettronica e immunitaria elettronica, nonché l'immunofluorescenza, il metodo di ibridazione molecolare, la rilevazione di anticorpi della classe lgM, ecc.

La microscopia elettronica di virus colorati negativamente consente la differenziazione dei virus e la determinazione della loro concentrazione. L'uso della microscopia elettronica nella diagnosi delle infezioni virali è limitato a quei casi in cui la concentrazione di particelle virali nel materiale clinico è sufficientemente elevata (10 5 in 1 ml e superiori). Lo svantaggio del metodo è l'incapacità di distinguere tra virus appartenenti allo stesso gruppo tassonomico. Questo svantaggio viene eliminato utilizzando la microscopia elettronica immunitaria. Il metodo si basa sulla formazione di immunocomplessi quando si aggiunge siero specifico alle particelle virali, mentre si verifica la concentrazione simultanea di particelle virali, che consente di identificarle. Il metodo è utilizzato anche per rilevare gli anticorpi. Ai fini della diagnostica espressa, viene eseguito un esame al microscopio elettronico di estratti di tessuto, feci, liquido delle vescicole e segreti del rinofaringe. La microscopia elettronica è ampiamente utilizzata per studiare la morfogenesi del virus; le sue capacità sono ampliate con l'uso di anticorpi marcati.

Il metodo di ibridazione molecolare, basato sulla rilevazione di acidi nucleici specifici del virus, consente di rilevare singole copie di geni e non ha eguali in termini di sensibilità. La reazione si basa sull'ibridazione di filamenti complementari di DNA o RNA (sonde) e sulla formazione di strutture a doppio filamento. La sonda più economica è il DNA ricombinante clonato. La sonda è marcata con precursori radioattivi (solitamente fosforo radioattivo). L'uso di reazioni colorimetriche è promettente. Esistono diverse varianti di ibridazione molecolare: ibridazione puntuale, ibridazione blot, ibridazione sandwich, ibridazione in situ, ecc.

Gli anticorpi della classe lgM compaiono prima degli anticorpi di classe G (il 3-5° giorno di malattia) e scompaiono dopo alcune settimane, quindi il loro rilevamento indica un'infezione recente. Gli anticorpi della classe lgM vengono rilevati mediante immunofluorescenza o utilizzo saggio immunoenzimatico utilizzando antisieri anti-μ (sieri a catena pesante anti-lgM).

I metodi sierologici in virologia si basano sulle reazioni immunologiche classiche (vedi. Metodi immunologici ricerca) : reazioni di fissazione del complemento, inibizione dell'emoagglutinazione, neutralizzazione biologica, immunodiffusione, emoagglutinazione indiretta, emolisi radiale, immunofluorescenza, saggio immunoenzimatico, saggio radioimmunologico. Sono stati sviluppati micrometodi per molte reazioni e le loro tecniche vengono continuamente migliorate. Questi metodi vengono utilizzati per identificare i virus utilizzando un set di sieri noti e per la sierodiagnosi al fine di determinare l'aumento degli anticorpi nel secondo siero rispetto al primo (il primo siero viene prelevato nei primi giorni dopo la malattia, il secondo - dopo 2-3 settimane). Il valore diagnostico non è inferiore a un aumento quadruplo degli anticorpi nel secondo siero. Se il rilevamento di anticorpi della classe lgM indica un'infezione recente, gli anticorpi della classe lgC persistono per diversi anni e talvolta per tutta la vita.

Per identificare i singoli antigeni di virus e anticorpi contro di essi in miscele complesse senza previa purificazione proteica, viene utilizzato l'immunoblotting. Il metodo combina il frazionamento delle proteine utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide con il successivo dosaggio immunologico delle proteine mediante dosaggio immunoenzimatico. La separazione delle proteine riduce i requisiti per la purezza chimica dell'antigene e rende possibile l'identificazione di singole coppie antigene-anticorpo. Questo compito è rilevante, ad esempio, nella sierodiagnosi dell'infezione da HIV, in cui le reazioni di immunodosaggio enzimatico false positive sono dovute alla presenza di anticorpi contro antigeni cellulari, che sono presenti a causa di un'insufficiente purificazione delle proteine virali. L'identificazione di anticorpi nei sieri dei pazienti contro antigeni virali interni ed esterni consente di determinare lo stadio della malattia e, nell'analisi delle popolazioni, la variabilità delle proteine virali. L'immunoblotting nell'infezione da HIV viene utilizzato come test di conferma per rilevare singoli antigeni virali e anticorpi contro di essi. Quando si analizzano le popolazioni, il metodo viene utilizzato per determinare la variabilità delle proteine virali. grande valore Il metodo consiste nella possibilità di analizzare antigeni sintetizzati con la tecnologia del DNA ricombinante, stabilendone la dimensione e la presenza di determinanti antigenici.

20) Fondamentale componente strutturale virioni(particelle virali complete) è un nucleocapside, cioè la guaina proteica (capside) che racchiude il genoma virale (DNA o RNA). Il nucleocapside della maggior parte delle famiglie di virus è circondato da un involucro di lipoproteine. Tra l'involucro e il nucleocapside in alcuni virus (orto-, paramixo-, rhabdo-, filo- e retrovirus) è presente una proteina della matrice non glicosilata, che conferisce ulteriore rigidità ai virioni. I virus della maggior parte delle famiglie hanno un involucro che svolge un ruolo importante nell'infettività. I virioni acquisiscono lo strato esterno dell'involucro quando il nucleocapside penetra nella membrana cellulare gemmando. Le proteine dell'involucro sono codificate dal virus e i lipidi sono presi in prestito dalla membrana cellulare. Le glicoproteine solitamente sotto forma di dimeri e trimeri formano peplomeri (sporgenze) sulla superficie dei virioni (orto-, paramixovirus, rhabdo-, filo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirus). Le proteine di fusione glicosilate sono associate ai peplomeri e svolgono un ruolo chiave nell'ingresso del virus nella cellula. I capsidi e gli involucri dei virioni sono formati da molte copie di uno o più tipi di subunità proteiche come risultato di un processo di autoassemblaggio. Interazione nel sistema proteina-proteina a causa di debole legami chimici, porta all'unione di capsidi simmetrici. Le differenze nei virus nella forma e nelle dimensioni dei virioni dipendono dalla forma, dalle dimensioni e dal numero delle subunità proteiche strutturali e dalla natura dell'interazione tra di esse. Il capside è costituito da molte subunità morfologicamente espresse (capsomeri) assemblate da polipeptidi virali in un modo rigorosamente definito, secondo principi geometrici relativamente semplici. Le subunità proteiche, che si connettono tra loro, formano capsidi di due tipi di simmetria: isometrica ed elicoidale. La struttura del nucleocapside dei virus con involucro è simile alla struttura del nucleocapside dei virus senza involucro. Sulla superficie dell'involucro dei virus si distinguono le strutture glicoproteiche morfologicamente espresse - i peplomeri. La composizione della membrana del supercapside comprende lipidi (fino al 20-35%) e carboidrati (fino al 7-8%), che sono di origine cellulare. Consiste in un doppio strato di lipidi cellulari e proteine specifiche del virus situate all'esterno e all'interno del biostrato lipidico. Lo strato esterno del guscio del supercapside è rappresentato da peplomeri (sporgenze) di uno o più tipi, costituiti da una o più molecole di glicoproteine. Il nucleocapside dei virus avvolti è spesso indicato come il nucleo. parte centrale Un virione contenente un acido nucleico è chiamato nucleoide. I capsomeri (peplometri) sono costituiti da unità strutturali costituita da una o più catene polipeptidiche omologhe o eterologhe (subunità proteiche). classificazione dei virus I capsidi isometrici non sono sfere, ma poliedri regolari (icosaedri). Le loro dimensioni lineari sono identiche lungo gli assi di simmetria. Secondo Kaspar e Klug (1962), i capsomeri nei capsidi sono disposti secondo la simmetria icosaedrica. Tali capsidi sono costituiti da subunità identiche che formano un icosaedro. Hanno 12 vertici (angoli), 30 facce e 20 superfici sotto forma di triangoli isosceli. Secondo questa regola, il capside del poliovirus e del virus dell'afta epizootica è formato da 60 unità strutturali proteiche, ciascuna delle quali è costituita da quattro catene polipeptidiche. L'icosaedro risolve in modo ottimale il problema dell'impacchettamento di subunità ripetute in una rigida struttura compatta con un volume minimo. Solo alcune configurazioni di subunità strutturali possono formare le superfici, i vertici e le facce dell'icosaedro virale. Ad esempio, le subunità strutturali dell'adenovirus formano capsomeri esagonali (esoni) su superfici e facce e capsomeri pentagonali (peptoni) in cima. In alcuni virus, entrambi i tipi di capsomeri sono formati dagli stessi polipeptidi, in altri da polipeptidi diversi. Poiché le subunità strutturali di diversi virus differiscono l'una dall'altra, alcuni virus sembrano essere più esagonali, altri più sferici. Tutti i virus vertebrati contenenti DNA conosciuti, ad eccezione dei virus del vaiolo, così come molti virus contenenti RNA (7 famiglie) hanno un tipo di simmetria del capside cubico. I reovirus, a differenza di altri virus dei vertebrati, hanno un doppio capside (esterno e interno), ciascuno costituito da unità morfologiche. I virus con un tipo di simmetria elicoidale hanno la forma di una struttura filamentosa cilindrica, il loro RNA genomico ha la forma di una spirale e si trova all'interno del capside. Tutti i virus animali a simmetria elicoidale sono circondati da un involucro lipoproteico. I nucleocapsidi elicoidali sono caratterizzati da lunghezza, diametro, passo dell'elica e numero di capsomeri per giro dell'elica. Quindi, nel virus Sendai (paramyxovirus), il nucleocapside è un'elica lunga circa 1 μm, con un diametro di 20 nm e un passo dell'elica di 5 nm. Il capside è costituito da circa 2400 unità strutturali, ciascuna delle quali è una proteina con un peso molecolare di 60 kD. Ci sono 11-13 subunità per giro dell'elica. Nei virus con un tipo elicoidale di simmetria nucleocapsidica, il ripiegamento delle molecole proteiche in un'elica garantisce la massima interazione tra l'acido nucleico e le subunità proteiche. Nei virus icosaedrici, l'acido nucleico è avvolto all'interno dei virioni e interagisce con uno o più polipeptidi situati all'interno del capside.

Antirecettori (recettori) virali- proteine del virione di superficie, ad esempio l'emoagglutinina, che si legano in modo complementare al corrispondente recettore di una cellula suscettibile.

21) Metodi immunologici nella ricerca virologica.

I test sierologici variano nella loro capacità di rilevare singole classi di anticorpi. Il test di agglutinazione, ad esempio, è efficace nel rilevare gli anticorpi IgM, ma è meno sensibile nel rilevare gli anticorpi IgG. I test di fissazione del complemento e di emolisi, che richiedono il complemento, non rilevano gli anticorpi che non si legano al complemento, come gli anticorpi IgA e gli anticorpi IgE. Solo gli anticorpi diretti contro i determinanti antigenici della superficie del virione associati alla patogenicità partecipano alla reazione di neutralizzazione del virus. Sensibilità I. m. e. supera tutti gli altri metodi per lo studio di antigeni e anticorpi, in particolare il radioimmunodosaggio e l'immunodosaggio enzimatico consentono di catturare la presenza di proteine in quantità misurabili in nanogrammi e persino in picogrammi. Con l'aiuto di I. m. e. determinare il gruppo e verificare la sicurezza del sangue (epatite B e infezione da HIV). All'atto del trapianto di tessuti e corpi E. m. consentire la determinazione della compatibilità dei tessuti e il test dei metodi di soppressione dell'incompatibilità. In medicina legale, la reazione di Castellani viene utilizzata per determinare la specie specificità di una proteina e la reazione di agglutinazione per determinare il gruppo sanguigno.

I metodi immunologici sono ampiamente utilizzati in diagnostica di laboratorio malattie infettive. L'eziologia della malattia viene stabilita anche sulla base dell'aumento degli anticorpi contro il patogeno nel siero del sangue del convalescente rispetto al campione prelevato nei primi giorni della malattia. Basato su I. m. e. studiare l'immunità della popolazione in relazione alle infezioni di massa, come l'influenza, e valutare anche l'efficacia delle vaccinazioni preventive.

A seconda del loro meccanismo e del resoconto dei risultati I. m. può essere suddiviso in reazioni basate sul fenomeno dell'agglutinazione; reazioni basate sul fenomeno delle precipitazioni; reazioni che coinvolgono il complemento; reazione di neutralizzazione; reazioni con metodi chimici e fisici.

Reazioni basate sul fenomeno dell'agglutinazione. L'agglutinazione è l'incollaggio di cellule o singole particelle - portatori di un antigene con l'aiuto del siero immunitario a questo antigene.

Il test di agglutinazione batterica che utilizza un siero antibatterico appropriato è uno dei test sierologici più semplici. Una sospensione di batteri viene aggiunta a varie diluizioni del siero del sangue testato e dopo un certo tempo di contatto a t ° 37 ° viene registrato a quale diluizione massima si verifica l'agglutinazione del siero del sangue. La reazione di agglutinazione dei batteri viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive: brucellosi, tularemia, febbre tifoide e febbre paratifoide, dissenteria bacillare e tifo.

La reazione di emoagglutinazione passiva o indiretta (RPGA, RNGA). Utilizza eritrociti o materiali sintetici neutri (ad esempio particelle di lattice), sulla cui superficie vengono adsorbiti antigeni (batterici, virali, tissutali) o anticorpi. La loro agglutinazione si verifica quando vengono aggiunti i sieri o gli antigeni appropriati.

Il test di emoagglutinazione passiva viene utilizzato per diagnosticare malattie causate da batteri ( tifo e paratifo, dissenteria, brucellosi, peste, colera, ecc.), protozoi (malaria) e virus (influenza, infezioni da adenovirus, Epatite virale B, morbillo, encefalite da zecche, Crimea febbre emorragica ecc.), nonché per determinare alcuni ormoni, identificare ipersensibilità malato a medicinali e ormoni come la penicillina e l'insulina.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione (HITA) si basa sul fenomeno di prevenzione (inibizione) del siero immunitario dell'emoagglutinazione degli eritrociti da parte dei virus e viene utilizzato per rilevare e titolare gli anticorpi antivirali. Serve come metodo principale di sierodiagnosi di influenza, morbillo, rosolia, parotite, encefalite da zecche e altre infezioni virali, i cui agenti causali hanno proprietà emoagglutinanti. ad esempio, per la sierodiagnosi dell'encefalite da zecche, nei pozzetti del pannello vengono versate diluizioni doppie del siero del paziente in una soluzione tampone di borato alcalino. Quindi si aggiunge una certa quantità, solitamente 8 AU (unità agglutinanti), di antigene dell'encefalite trasmessa da zecche e, dopo 18 ore di esposizione a t°4°, si introduce una sospensione di eritrociti d'oca preparata in una soluzione tampone fosfato acida. Se nel siero del sangue del paziente sono presenti anticorpi contro il virus dell'encefalite trasmessa da zecche, l'antigene viene neutralizzato e non si verifica l'agglutinazione eritrocitaria.

Reazioni basate sul fenomeno della precipitazione. La precipitazione si verifica a seguito dell'interazione di anticorpi con antigeni solubili. L'esempio più semplice di una reazione di precipitazione è la formazione di una banda di precipitazione opaca in una provetta al confine della stratificazione dell'antigene su un anticorpo. Sono ampiamente utilizzati vari tipi di reazioni di precipitazione in agar semiliquido o gel di agarosio (metodo della doppia immunodiffusione Ouchterlon, metodo dell'immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi), che sono sia qualitativi che quantitativi. Come risultato della libera diffusione nel gel di antigeni e anticorpi nella zona del loro rapporto ottimale, si formano complessi specifici: bande di precipitazione, che vengono rilevate visivamente o mediante colorazione. Una caratteristica del metodo è che ogni coppia antigene-anticorpo forma una singola banda di precipitazione e la reazione non dipende dalla presenza di altri antigeni e anticorpi nel sistema in esame.

Le reazioni che coinvolgono il complemento, che viene utilizzato come siero di cavia fresco, si basano sulla capacità del sottocomponente del complemento Clq e quindi di altri componenti del complemento di attaccarsi agli immunocomplessi.

La reazione di fissazione del complemento (CFR) consente la titolazione di antigeni o anticorpi in base al grado di fissazione del complemento da parte del complesso antigene-anticorpo. Questa reazione si compone di due fasi: l'interazione dell'antigene con il siero del sangue in esame (sistema di test) e l'interazione del siero emolitico con gli eritrociti di ariete (sistema indicatore). A reazione positiva nel sistema in esame si verifica la fissazione del complemento e quindi, quando si aggiungono eritrociti sensibilizzati con anticorpi, non si osserva emolisi. La reazione viene utilizzata per la sierodiagnosi della sifilide (reazione di Wassermann), delle infezioni virali e batteriche.

La reazione di neutralizzazione si basa sulla capacità degli anticorpi di neutralizzare determinate funzioni specifiche di antigeni macromolecolari o solubili, come l'attività enzimatica, le tossine batteriche e la patogenicità dei virus. La reazione di neutralizzazione delle tossine può essere valutata dall'effetto biologico, ad esempio, i sieri antitetanici e antibotulinici sono titolati. Una miscela di tossina e antisiero somministrata agli animali non ne causa la morte. Varie varianti della reazione di neutralizzazione sono utilizzate in virologia. Quando i virus vengono miscelati con un antisiero appropriato e questa miscela viene somministrata ad animali o colture cellulari, la patogenicità dei virus viene neutralizzata e gli animali non si ammalano e le cellule delle colture non subiscono distruzione.

Reazioni mediante etichette chimiche e fisiche. L'immunofluorescenza consiste nell'utilizzo di anticorpi marcati con fluorocromo, più precisamente, la frazione immunoglobulinica degli anticorpi IgG. Un anticorpo marcato con un fluorocromo forma un complesso antigene-anticorpo con l'antigene, che diventa disponibile per l'osservazione al microscopio ai raggi UV che eccitano la luminescenza del fluorocromo. La reazione di immunofluorescenza diretta viene utilizzata per studiare gli antigeni cellulari, rilevare virus nelle cellule infette e rilevare batteri e rickettsia negli strisci.

Il metodo dell'immunofluorescenza indiretta è più ampiamente utilizzato. si basa sul rilevamento di un complesso antigene-anticorpo utilizzando un siero anticorpale anti-lgG luminescente e viene utilizzato per rilevare non solo gli antigeni, ma anche la titolazione degli anticorpi.

I metodi immunoenzimatici, o immunologici enzimatici, si basano sull'uso di anticorpi coniugati con enzimi, principalmente perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina. Come l'immunofluorescenza, il dosaggio immunoenzimatico viene utilizzato per rilevare gli antigeni nelle cellule o per titolare gli anticorpi sulle cellule contenenti antigeni.

Il metodo radioimmunologico si basa sull'uso di una marcatura radioisotopica di antigeni o anticorpi. È il metodo più sensibile per determinare antigeni e anticorpi, viene utilizzato per determinare ormoni, sostanze medicinali e antibiotici, per la diagnosi di malattie batteriche, virali, rickettsie, protozoiche, lo studio delle proteine del sangue, gli antigeni tissutali.

L'immunoblotting viene utilizzato per rilevare anticorpi contro singoli antigeni o "riconoscere" antigeni da sieri noti. Il metodo consiste in 3 fasi: separazione di macromolecole biologiche (ad esempio un virus) in singole proteine mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide; trasferire le proteine separate dal gel su un supporto solido (blot) applicando una lastra di gel di poliacrilammide su carta attivata o nitrocellulosa (electroblotting); rilevazione delle proteine desiderate sul substrato mediante dosaggio immunoenzimatico diretto o indiretto. Come metodo diagnostico, l'immunoblotting viene utilizzato per l'infezione da HIV. Il valore diagnostico è il rilevamento di anticorpi contro una delle proteine del guscio esterno del virus.

22) Tipi di virus a simmetria (cubici, elicoidali, misti). Interazione di proteine e acidi nucleici nella confezione dei genomi virali.

A seconda dell'interazione del capside con l'acido nucleico, le particelle virali possono essere suddivise in diversi tipi di simmetria:

1). Tipo di simmetria cubica.

I capsidi cubici sono icosideri con circa 20 superfici triangolari e 12 vertici. Formano una struttura che ricorda una formazione sferica, ma in realtà è un poliedro. In alcuni casi, speciali formazioni lipoproteiche chiamate punte sono attaccate ai vertici di tali poliedri icosaedrici. Il ruolo di questi picchi è presumibilmente ridotto all'interazione di virioni o particelle virali con le corrispondenti aree di cellule ospiti ad essi sensibili. Con la simmetria cubica, l'acido nucleico virale è imballato strettamente (arrotolato in una palla) e le molecole proteiche lo circondano, formando un poliedro (icosaedro). Un icosaedro è un poliedro con venti facce triangolari che ha simmetria cubica e una forma approssimativamente sferica. I virus icosaedrici includono virus herpes simplex, reovirus, ecc.

2). Tipo di simmetria a spirale. I capsidi a spirale sono in qualche modo più semplici. Quelli. I capsomeri che compongono il capside coprono l'elica NK e formano anche un guscio proteico abbastanza stabile di questi virus. E quando si usano microscopi elettronici ad alta risoluzione e metodi di preparazione appropriati, si possono vedere strutture a spirale sui virus. Con la simmetria elicoidale del capside, l'acido nucleico virale forma una figura elicoidale (o elicoidale), vuota all'interno, e anche le subunità proteiche (capsomeri) sono impilate attorno ad esso a spirale (capside tubolare). Un esempio di virus con una simmetria elicoidale del capside è il virus del mosaico del tabacco, che è a forma di bastoncino, e la sua lunghezza è di 300 nm con un diametro di 15 nm. La composizione di una particella virale include una molecola di RNA di circa 6000 nucleotidi. Il capside è costituito da 2000 subunità proteiche identiche disposte a spirale.

3). Misto o tipo complesso simmetria. Di norma, questo tipo di simmetria si trova principalmente tra i virus batterici. E gli esempi classici sono quei fagi, E. coli o fagi temperati. Si tratta di formazioni complesse che hanno una testa con contenuto nucleico interno, vari tipi di appendici, un processo di coda, vari gradi complessità del dispositivo. E ogni componente di tali particelle è dotato di una funzione specifica che si realizza nel processo di interazione tra il virus e la cellula. In altre parole, un tipo complesso di simmetria è una combinazione di simmetria cubica, la testa è un poliedro icosiderico e le formazioni a forma di bastoncino sono i processi della coda. Sebbene tra i virus batterici ci siano anche virioni organizzati in modo abbastanza semplice, che sono nucleocapsidi primitivi, di forma sferica o cubica. I virus batterici sono più complessi dei virus delle piante e degli animali.

24) Interazione di un fago con una cellula. Fagi virulenti e temperati.

Adsorbimento.

L'interazione inizia con l'attaccamento di particelle virali alla superficie cellulare. Il processo diventa possibile in presenza di opportuni recettori sulla superficie della cellula e di anti-recettori sulla superficie della particella virale.

I virus utilizzano recettori cellulari progettati per trasportare sostanze essenziali: particelle nutritive, ormoni, fattori di crescita, ecc.

Recettori: proteine, componente glucidica di proteine e lipidi, lipidi. Recettori specifici determinano l'ulteriore destino della particella virale (trasporto, consegna ad aree del citoplasma o del nucleo). Il virus può attaccarsi a recettori non specifici e persino penetrare nella cellula. Tuttavia, questo processo non causa infezione.

Inizialmente, si forma un singolo legame tra l'antirecettore e il recettore. Questo legame è fragile e può rompersi. Per la formazione dell'adsorbimento irreversibile è necessario l'attaccamento multivalente. Il legame stabile si verifica a causa del libero movimento delle molecole del recettore nella membrana. Durante l'interazione del virus con la cellula si osserva un aumento della fluidità dei lipidi e la formazione di campi recettoriali nell'area di interazione tra il virus e la cellula. I recettori di un certo numero di virus possono essere presenti solo in un insieme limitato di cellule ospiti. Ciò determina la sensibilità dell'organismo a questo virus. Pertanto, il DNA e l'RNA virali hanno la capacità di infettare una gamma più ampia di cellule ospiti.

Gli antirecettori possono essere trovati in organelli virali unici: strutture di crescita nei batteriofagi T, fibre negli adenovirus, punte sulla superficie delle membrane virali, corona nei coronavirus.

Penetrazione.

2 meccanismi: endocitosi del recettore e fusione della membrana.

Endocitosi del recettore:

Il solito meccanismo per l'ingresso di nutrienti e sostanze regolatrici nella cellula. Si verifica in aree specializzate - dove ci sono fosse speciali ricoperte di clatrina, recettori specifici si trovano sul fondo della fossa. Le fosse forniscono una rapida invaginazione e la formazione di vacuoli ricoperti di clatrina (non passano più di 10 minuti dal momento dell'adsorbimento, in un minuto possono formarsi fino a 2000 vacuoli). I vacuoli si fondono con vacuoli citoplasmatici più grandi per formare recettoriosomi (che non contengono più clatrina), che a loro volta si fondono con i lisosomi.

Fusione delle membrane virali e cellulari:

Nei virus avvolti, la fusione è dovuta a interazioni puntuali proteina virale con i lipidi della membrana cellulare, a seguito della quale l'involucro della lipoproteina virale si integra con la membrana cellulare. Nei virus senza involucro, una delle proteine di superficie interagisce anche con i lipidi. membrane cellulari e il componente interno passa attraverso la membrana (nei paramixovirus - proteina F, negli ortomixovirus - subunità emoagglutinante HA2). La conformazione delle proteine di superficie è influenzata dal pH.

Striscia.

In questo processo, l'attività infettiva scompare, appare spesso la sensibilità alle nucleasi e sorge la resistenza agli anticorpi. Il prodotto finale della svestizione sono gli acidi nucleici legati a una proteina virale interna. La fase di svestizione limita anche la possibilità di infezione (i virus non sono in grado di spogliarsi in ogni cellula). La svestizione avviene in aree specializzate della cellula: lisosomi, apparato di Golgi e spazio perinucleare.

La svestizione avviene a seguito di una serie di reazioni. Ad esempio, nei picornavirus, la svestizione procede con la formazione di particelle subvirali intermedie con dimensioni da 156 a 12S. Negli adenovirus nel citoplasma e nei pori nucleari e ha almeno 3 stadi:

Formazione di particelle subvirali con una densità maggiore rispetto ai virioni;

La formazione di nuclei in cui mancano 3 proteine virali;

Formazione di un complesso DNA-proteina in cui il DNA è legato covalentemente a una proteina terminale.

Caratterizzazione di fagi virulenti e temperati.

Quando un batterio viene infettato da un fago, si verifica una cosiddetta infezione litica, cioè un'infezione che culmina nella lisi della cellula ospite, ma questa è caratteristica solo dei cosiddetti fagi virulenti, la cui interazione con la cellula porta alla morte cellulare e alla formazione di una progenie fagica.

In questo caso si distinguono le seguenti fasi in base alle interazioni del fago con la cellula: miscelazione del fago con la coltura cellulare (la molteplicità di infezione è di 1 fago per 10 cellule), e la concentrazione deve essere sufficientemente elevata in modo che il i fagi possono contattare le cellule. Per evitare la reinfezione - dopo l'infezione per un massimo di 5 minuti, quando i fagi vengono adsorbiti - questa miscela di cellule con fago viene diluita. Si distingue un periodo di latenza durante il quale la quantità di fago non aumenta, quindi molto breve periodo uscita, quando il numero di particelle fagiche aumenta bruscamente, quando la cellula si lisa e la progenie fagica viene rilasciata, e quindi il numero di fagi rimane allo stesso livello, perché non si verifica la reinfezione. Sulla base di questa curva si possono distinguere queste fasi: il periodo vegetativo di "crescita" (periodo di latenza), il periodo di uscita e calcolare la resa fagica per 1 cellula infetta. Durante il periodo di latenza, nei batteri non si trova nulla che assomigli a particelle fagiche e non è possibile isolare il principio infettivo da tali cellule nel periodo di latenza. Solo le particelle fagiche mature possono infettare i batteri. Pertanto, i fagi virulenti causano sempre la morte dei batteri e producono infezione, che si rivela nella produzione di nuove particelle virali in grado di infettare le cellule successive e altre cellule sensibili.

Contrariamente a quelli virulenti, l'infezione da fagi temperati non porta alla lisi delle cellule batteriche, ma si realizza la formazione di uno stato speciale di coesistenza di un fago con una cellula batterica. Questa coesistenza si esprime nel fatto che un certo inizio del fago è presente nella cellula batterica senza condizioni sfavorevoli per essa e si conserva di generazione in generazione. In certi stadi di tale coesistenza, il fago viene attivato nella cellula ed entra nello stato del ciclo litico di sviluppo, provocando la lisi cellulare e il rilascio della progenie fagica. Tali fagi sono chiamati fagi lisogenici o temperati, e lo stato di esistenza moderata con il fago è la lisogenia, ei batteri che contengono un fago così latente sono chiamati batteri lisogenici. Il termine batteri lisogenici deriva dal fatto che una volta furono scoperte colture in cui appariva spontaneamente un fago, e questo batteriofago iniziò a essere considerato come contaminazione della coltura, cioè un virus batterico entra nella coltura, e tali colture furono chiamate lisogeniche, cioè generano lisi .

Metodi di ricerca virologica- metodi per lo studio della biologia dei virus e la loro identificazione. In virologia sono ampiamente utilizzati metodi di biologia molecolare, con l'aiuto dei quali è stato possibile stabilire la struttura molecolare delle particelle virali, come penetrano nella cellula e le caratteristiche della riproduzione dei virus, la struttura primaria degli acidi nucleici virali e proteine. Sono in fase di sviluppo metodi per determinare la sequenza degli elementi costitutivi degli acidi nucleici virali e degli amminoacidi proteici. Diventa possibile collegare le funzioni degli acidi nucleici e delle proteine che codificano con la sequenza nucleotidica e stabilire le cause dei processi intracellulari che svolgono un ruolo importante nell'infezione da e-virus.

I metodi di ricerca virologica si basano anche su processi immunologici (interazione dell'antigene con anticorpi), proprietà biologiche del virus (capacità di emoagglutinare, emolisi, attività enzimatica), caratteristiche dell'interazione del virus con la cellula ospite (la natura del citopatico effetto, la formazione di inclusioni intracellulari, ecc.).

Le cellule della maggior parte delle colture primarie possono essere sottocoltivate e sono indicate come colture secondarie. Con l'ulteriore passaggio delle cellule, si forma una popolazione di cellule simili ai fibroblasti, in grado di riprodursi rapidamente, la maggior parte delle quali conserva il set originale di cromosomi. Queste sono le cosiddette cellule diploidi. Nella coltivazione in serie di cellule si ottengono colture cellulari continue stabili. Durante i passaggi compaiono cellule omogenee in rapida divisione con un insieme eteroploide di cromosomi. Le linee cellulari stabili possono essere monostrato e sospensione. Le colture monostrato crescono sotto forma di uno strato continuo sulla superficie del vetro, le colture in sospensione crescono sotto forma di sospensioni in vari recipienti mediante agitatori. Esistono oltre 400 linee cellulari derivate da 40 diverse specie animali (inclusi primati, uccelli, rettili, anfibi, pesci, insetti) e umani.

Pezzi di singoli organi e tessuti (colture di organi) possono essere coltivati in mezzi nutritivi artificiali. Questi tipi di colture preservano la struttura dei tessuti, che è particolarmente importante per l'isolamento e il passaggio di virus che non si riproducono in colture di tessuti indifferenziati (ad esempio, coronavirus).

Nelle colture cellulari infette, i virus possono essere rilevati da un cambiamento nella morfologia cellulare, dall'azione citopatica, che può essere specifica, dalla comparsa di inclusioni, determinando gli antigeni virali nella cellula e nel fluido di coltura; determinazione delle proprietà biologiche della progenie virale nel fluido di coltura e titolazione dei virus nella coltura di tessuti, embrioni di pollo o animali sensibili; rilevando singoli acidi nucleici virali nelle cellule mediante ibridazione molecolare o gruppi di acidi nucleici mediante metodo citochimico mediante microscopia a fluorescenza.

L'isolamento dei virus è un processo lungo e laborioso. Viene effettuato per determinare il tipo o la variante del virus circolante nella popolazione (ad esempio, per identificare la sierovariante del virus a, il ceppo selvaggio o vaccinale del virus a, ecc.); nei casi in cui è necessario eseguire misure epidemiologiche urgenti; quando compaiono nuovi tipi o varianti di virus; se necessario, confermare la diagnosi preliminare; per l'indicazione di virus in oggetti ambientali. Quando si isolano i virus, viene presa in considerazione la possibilità della loro persistenza nel corpo umano, nonché il verificarsi di un'infezione mista causata da due o più virus. Una popolazione geneticamente omogenea di un virus ottenuta da un singolo virione è chiamata clone virale e il processo per ottenerlo è chiamato clonazione.

la formazione di simplasti e sincizi, la rilevazione di inclusioni intracellulari, nonché un antigene specifico rilevato mediante immunofluorescenza, emoassorbimento, emoagglutinazione (nei virus emoagglutinanti), ecc. Questi segni possono essere rilevati solo dopo 2-3 passaggi del virus.

Per l'isolamento di un certo numero di virus, ad esempio virus a, vengono utilizzati embrioni di pollo, per l'isolamento di alcuni virus Coxsackie e un certo numero di arbovirus - topi appena nati. L'identificazione dei virus isolati viene effettuata utilizzando test sierologici e altri metodi.

Quando si lavora con i virus, viene determinato il loro titolo. La titolazione dei virus viene solitamente eseguita nella coltura tissutale, determinando la massima diluizione del fluido contenente il virus, in corrispondenza della quale si verifica la degenerazione dei tessuti, si formano inclusioni e antigeni specifici del virus. Il metodo della placca può essere utilizzato per titolare un certo numero di virus. Le placche, o colonie negative di virus, sono focolai di cellule distrutte dal virus di una coltura tissutale a strato singolo sotto rivestimento di agar. Il conteggio delle colonie consente un'analisi quantitativa dell'attività infettiva dei virus sulla base del fatto che una particella virale infettiva forma una placca. Le placche vengono identificate colorando la coltura con coloranti vitali, solitamente rosso neutro; le placche non assorbono il colorante e quindi sono visibili come punti luminosi sullo sfondo delle cellule viventi colorate. Il titolo del virus è espresso come numero di unità formanti placca in 1 ml.

La diagnosi di laboratorio delle infezioni virali include il rilevamento dell'agente patogeno o dei suoi componenti nel materiale clinico; isolamento del virus da questo materiale; sierodiagnosi. La scelta del metodo diagnostico di laboratorio in ogni singolo caso dipende dalla natura della malattia, dal periodo della malattia e dalle capacità del laboratorio. La diagnosi moderna delle infezioni virali si basa su metodi espressi che consentono di ottenere una risposta poche ore dopo l'assunzione di materiale clinico nelle prime fasi dopo la malattia, tra cui la microscopia elettronica e immunoelettronica,

nonché immunofluorescenza, metodo di ibridazione molecolare, rilevamento di anticorpi di classe lgM, ecc.

Gli anticorpi della classe lgM compaiono prima degli anticorpi di classe G (il 3-5° giorno di malattia) e scompaiono dopo alcune settimane, quindi il loro rilevamento indica un'infezione recente. Gli anticorpi della classe IgM vengono rilevati mediante immunofluorescenza o immunodosaggio enzimatico utilizzando antisieri anti-m (sieri a catena pesante anti-IgM).

I metodi sierologici in virologia si basano sulle reazioni immunologiche classiche (vedi. Metodi di ricerca immunologica ): reazioni di fissazione del complemento

inibizione dell'emoagglutinazione, neutralizzazione biologica, immunodiffusione, emoagglutinazione indiretta, emolisi radiale, immunofluorescenza, saggio immunoenzimatico, saggio radioimmunologico. Sono stati sviluppati micrometodi per molte reazioni e le loro tecniche vengono continuamente migliorate. Questi metodi vengono utilizzati per identificare i virus utilizzando un set di sieri noti e per la sierodiagnosi al fine di determinare l'aumento degli anticorpi nel secondo siero rispetto al primo (il primo siero viene prelevato nei primi giorni dopo la malattia, il secondo - dopo 2-3 settimane). Il valore diagnostico non è inferiore a un aumento quadruplo degli anticorpi nel secondo siero. Se il rilevamento di anticorpi della classe lgM indica un'infezione recente, gli anticorpi della classe lgC persistono per diversi anni e talvolta per tutta la vita.

Per identificare i singoli antigeni di virus e anticorpi contro di essi in miscele complesse senza previa purificazione proteica, viene utilizzato l'immunoblotting. Il metodo combina il frazionamento delle proteine utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide con il successivo dosaggio immunologico delle proteine mediante dosaggio immunoenzimatico. La separazione delle proteine riduce i requisiti per la purezza chimica dell'antigene e rende possibile l'identificazione di singole coppie antigene-anticorpo. Questo compito è rilevante, ad esempio, nella sierodiagnosi dell'infezione da HIV, dove le reazioni di immunodosaggio enzimatico falso positivo sono dovute alla presenza di anticorpi contro antigeni cellulari, che sono presenti a causa di un'insufficiente purificazione delle proteine virali. L'identificazione di anticorpi nei sieri dei pazienti contro antigeni virali interni ed esterni consente di determinare lo stadio della malattia e, nell'analisi delle popolazioni, la variabilità delle proteine virali. L'immunoblotting nell'infezione da HIV viene utilizzato come test di conferma per rilevare singoli antigeni virali e anticorpi contro di essi. Quando si analizzano le popolazioni, il metodo viene utilizzato per determinare la variabilità delle proteine virali. Il grande valore del metodo risiede nella possibilità di analizzare gli antigeni sintetizzati utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante, stabilendone la dimensione e la presenza di determinanti antigenici.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. Virologia, M., 1986; Virologia, Metodi, ed. B. Meikhi, trad. dall'inglese, M., 1988; Manuale di metodi di ricerca microbiologici e virologici, ed. MO Birger, M., 1982.

Gli studi virologici sono studi progettati per isolare i virus e studiarne le proprietà, nonché per stabilire la relazione eziologica dei virus con determinate malattie.

Il materiale per lo studio viene prelevato in base alla posizione dei virus predominanti nel corpo del paziente e ai modi in cui vengono isolati durante ambiente esterno. Il materiale viene raccolto in un piatto sterile, consegnato al laboratorio il più rapidamente possibile e conservato fino a quando lo studio non è congelato o in ghiaccio. Prima dell'uso, il materiale di isolamento del virus viene elaborato (e) per sopprimere la microflora estranea e sottoposto alla rimozione di particelle di grandi dimensioni.

L'isolamento dei virus viene effettuato infettando animali da laboratorio, embrioni di pollo, colture di tessuti con materiale contenente virus. La scelta del metodo di isolamento dipende dal presunto agente eziologico della malattia. Pertanto, le colture tissutali (vedi) vengono utilizzate quando si lavora con virus che non sono patogeni per gli animali da laboratorio o quando vengono rilevati nella coltura tissutale prima di quando gli animali sono infetti. Gli embrioni di pollo sono infettati per isolare agenti patogeni, parotiti infettive (nelle cavità amniotiche e allantoiche), (in sacco vitellino), vaiolo (sulla membrana corioallantoidea).

Tra gli animali da laboratorio, i topi bianchi sono più spesso utilizzati per l'isolamento del virus, seguiti da conigli, ratti, porcellini d'India, scimmie. Per gli arbovirus, l'introduzione più efficace di materiale contenente virus nella testa o, per i virus pneumotropici, sulla mucosa vie respiratorie, per i virus del vaiolo, sulla cornea scarificata.

L'isolamento dei virus è più efficace nel periodo acuto della malattia. Un punto essenziale per stabilire la natura virale della malattia sono i risultati studi sierologici sieri prelevati ripetutamente dallo stesso paziente all'inizio della malattia e durante la convalescenza. La rilevazione di anticorpi contro virus isolati nel secondo siero in un titolo 4 o più volte maggiore rispetto al primo indica la relazione eziologica dei virus con questa malattia.

Presto e metodo veloce il rilevamento di antigeni virali è un metodo di anticorpi fluorescenti basato sulla fissazione specifica di anticorpi marcati con fluorocromo sulla superficie dell'antigene. L'antigene è facilmente rivelato alla microscopia luminescente (vedi) grazie alla brillante fluorescenza degli anticorpi adsorbiti sull'antigene. Utilizzando il metodo degli anticorpi fluorescenti, vengono esaminati gli strisci prelevati dai pazienti, le sezioni istologiche dei tessuti interessati, i preparati dalla coltura tissutale. Si applica anche al rilevamento di corpi elementari (virioni) (vedi). Degli altri metodi morfologici, vengono utilizzati quelli che rilevano inclusioni virali intracellulari in sezioni di organi e tessuti colpiti. Il rilevamento di inclusioni indica un'infezione e in alcuni casi contribuisce alla diagnosi. malattia virale. Vengono utilizzati vari metodi per rilevare gli anticorpi virali nel sangue dei pazienti e per studiare la struttura antigenica dei virus. La reazione di neutralizzazione è utilizzata in quasi tutte le infezioni virali. Si basa sulla capacità degli anticorpi immunitari di neutralizzare le proprietà infettive dei virus quando la miscela viene introdotta nel corpo di animali sensibili o nella coltura tissutale. Per determinare l'indice di neutralizzazione, una dose costante di siero viene miscelata con varie diluizioni di virus e per determinare il titolo anticorpale: varie diluizioni siero con una dose costante di virus. Il controllo è l'infezione di animali (o colture di tessuti) con una miscela di virus con siero normale o con salino. La reazione di neutralizzazione è impostata non solo per rilevare gli anticorpi, ma anche per determinare il tipo e il tipo di virus.

La reazione di fissazione del complemento [ad esempio, la reazione Borde - Zhangu (vedi)] viene utilizzata per rilevare sia gli antigeni virali che gli anticorpi. Nel primo caso, il siero immunitario noto interagisce con il materiale in cui si presume la presenza di antigeni: siero sanguigno, tamponi nasofaringei, estratti di tessuto dell'organismo infetto. Nel secondo caso, un antigene noto (diagnosticum) e il siero del paziente o del convalescente.

RSK è utilizzato per diagnosticare malattie causate da influenza, vaiolo, adenovirus e arbovirus.

Metodo virologico comprende due fasi principali: l'isolamento dei virus e la loro identificazione. I materiali possono essere sangue, altri fluidi biologici e patologici, biopsie di organi e tessuti.

L'esame del sangue virologico viene spesso eseguito per diagnosticare le infezioni da arbovirus. Nella saliva possono essere rilevati virus della rabbia, della parotite e dell'herpes simplex. I tamponi nasofaringei vengono utilizzati per isolare i patogeni dell'influenza e di altre infezioni virali respiratorie acute, il morbillo. Nei lavaggi dalla congiuntiva si trovano gli adenovirus. Vari entero-, adeno-, reo- e rotavirus sono isolati dalle feci.

Colture cellulari, embrioni di pollo e talvolta animali da laboratorio vengono utilizzati per isolare i virus. La maggior parte dei virus patogeni si distingue per la presenza di specificità tissutale e di tipo ", ad esempio, il poliovirus si riproduce solo nelle cellule dei primati, pertanto viene utilizzata un'appropriata coltura tissutale per isolare un virus specifico. Per isolare un patogeno sconosciuto, è consigliabile contemporaneamente infettare 3-4 colture cellulari, supponendo che una di esse possa essere sensibile. La presenza del virus nelle colture infette è determinata dallo sviluppo di una specifica degenerazione cellulare, cioè effetto citopatogeno, rilevamento di inclusioni intracellulari, nonché sulla base di la rilevazione di un antigene specifico mediante immunofluorescenza, reazioni di emoassorbimento e emoagglutinazione positive. Gli embrioni di uccelli con i loro tessuti scarsamente differenziati sono adatti per la coltura di moltissimi virus. Molto spesso vengono utilizzati embrioni di pollo. Quando si moltiplicano negli embrioni, i virus possono causare la loro morte ( arbovirus), la comparsa di cambiamenti nella membrana corion-allantoidea (poxvirus) o nel corpo dell'embrione, accumulati cioè nei fluidi embrionali delle emoagglutinine (virus dell'influenza, parotite) e dell'antigene virale che fissa il complemento.

I virus vengono identificati utilizzando metodi immunologici: inibizione dell'emoagglutinazione, fissazione del complemento, neutralizzazione, precipitazione del gel, immunofluorescenza.

3.4 Metodo biologico

metodo biologico consiste nell'infettare animali da laboratorio con vario materiale (clinico, di laboratorio) per indicare l'agente patogeno, nonché per determinare determinate proprietà dei microrganismi che ne caratterizzano la patogenicità (tossigenicità, tossicità, virulenza). Topi bianchi, ratti bianchi, cavie, conigli, ecc. Sono usati come animali da laboratorio.

La riproduzione della malattia in un animale è una prova assoluta della patogenicità del microrganismo isolato (nel caso di rabbia, tetano, ecc.). Pertanto, un test biologico sugli animali è un metodo diagnostico prezioso e affidabile, soprattutto per quelle infezioni i cui agenti patogeni si trovano in basse concentrazioni nei mezzi biologici studiati del corpo umano e crescono male o lentamente su mezzi artificiali.

3.5 Metodo immunologico

Metodo immunologico(sierologico) include studi sul siero del sangue, nonché altri substrati biologici per la rilevazione di anticorpi e antigeni specifici. La sierodiagnosi classica si basa sulla determinazione degli anticorpi contro un agente patogeno identificato o sospetto. Un risultato positivo della reazione indica la presenza nel siero del sangue del test di anticorpi contro gli antigeni dell'agente patogeno, un risultato negativo indica l'assenza di tali. La rilevazione di anticorpi contro l'agente eziologico di una serie di malattie infettive nel siero del sangue in esame non è sufficiente per fare una diagnosi, poiché può riflettere la presenza di immunità post-infettiva o post-vaccinale, quindi sangue "accoppiato" si esaminano i sieri, il primo prelevato nei primi giorni di malattia, il secondo prelevato ad intervalli di 7-10 giorni. In questo caso viene valutata la dinamica dell'aumento del livello di anticorpi.

Un aumento diagnosticamente significativo del titolo anticorpale nel siero del sangue studiato è almeno 4 volte rispetto al livello iniziale. Questo fenomeno è chiamato sieroconversione. Nelle malattie infettive rare, così come nell'epatite virale, nell'infezione da HIV e in alcune altre, la presenza di anticorpi indica che il paziente è infetto ed è di valore diagnostico.

Oltre a determinare il titolo anticorpale, gli studi sierologici possono determinare l'isotipo degli anticorpi. È noto che al primo incontro del corpo umano con un agente patogeno nel periodo acuto della malattia, viene rilevato un aumento più rapido degli anticorpi appartenenti alle IgM, il cui livello, raggiungendo un valore massimo, poi diminuisce. Nelle fasi successive della malattia aumenta il numero di anticorpi IgG, che persistono più a lungo e si determinano nel periodo di convalescenza. Al reincontro con l'agente patogeno, a causa della memoria immunologica, le reazioni di immunità umorale si manifestano con una produzione più rapida di anticorpi IgG e gli anticorpi di classe M vengono prodotti in piccole quantità. Il rilevamento di anticorpi IgM indica la presenza di una corrente processo infettivo e la presenza di anticorpi IgG - sull'infezione passata o sull'immunità post-vaccinazione.

Date le caratteristiche della risposta immunitaria primaria e secondaria, l'analisi del rapporto tra anticorpi IgM e IgG consente in alcuni casi di differenziare lo stadio del processo infettivo (l'altezza della malattia, la convalescenza, la ricaduta). Ad esempio, nel caso dell'epatite virale A (HA), un metodo diagnostico affidabile è la determinazione degli anticorpi IgM anti-HAV nel siero del sangue. Il loro rilevamento indica un'infezione da HAV in corso o recente.

Test sierologici per rilevare gli anticorpi in malattie infettiveè più metodo accessibile diagnosi di laboratorio rispetto all'isolamento del patogeno. A volte una reazione sierologica positiva è l'unica prova dell'incontro e dell'interazione dell'organismo con l'agente eziologico della corrispondente malattia infettiva. Inoltre, un certo numero di malattie con un quadro clinico simile (ad esempio rickettsiosi, infezioni da enterovirus) possono essere differenziate solo sierologicamente, il che riflette l'importanza dei metodi sierologici nella diagnosi delle malattie infettive.

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