Dom » anatomija čovjeka » Glavne faze viroloških istraživanja. Smjernice za proučavanje teorijske građe u kolegiju “Privatna medicinska virologija. Neizravne virološke metode istraživanja

Glavne faze viroloških istraživanja. Smjernice za proučavanje teorijske građe u kolegiju “Privatna medicinska virologija. Neizravne virološke metode istraživanja

Dijagnoza akutnih crijevnih infekcija postavlja se na temelju kliničkih i epidemioloških podataka, uz obveznu laboratorijsku potvrdu. Bez laboratorijske potvrde dijagnoza akutnih crijevnih infekcija može se postaviti samo u slučajevima kada postoje jasno utvrđeni epidemiološki podaci (u žarištima infekcije i laboratorijski dešifriranim grupnim izbijanjem bolesti kod većine bolesnika).

Za konačnu dijagnozu koriste se bakteriološke, virološke i serološke metode istraživanja.Koprološka metoda, kao i rezultati sigmoidoskopije (za šigelozu), imaju sekundarni značaj.

ja. Bakteriološka metoda od najveće je važnosti kod AII uzrokovane bakterijskom florom (invazivna i sekretorna dijareja). Najbolji rezultati postižu se sijanjem izmeta neposredno uz krevet bolesnika, prije imenovanja antibiotske terapije i njegovom dostavom u bakteriološki laboratorij u prva dva sata od trenutka uzorkovanja. Za studiju je potrebno odabrati čestice koje sadrže patološke nečistoće, ali ne krv. Biomaterijal se sije na selektivne medije Ploskireva, Levina i drugih. Učestalost pozitivnih rezultata (inokulacija patogena i njegova identifikacija), čak iu prisutnosti tipičnih kliničkih manifestacija AII. Ne prelazi 70-80%.

II. Serološke metode dijagnostika se u pravilu koristi u sumnjivim slučajevima i s negativnim rezultatima bakteriološkog pregleda izmeta. U djece prvih mjeseci života, to je neinformativno, ali u svim slučajevima je važno povećanje titra antitijela za 4 puta ili više. Provode se u dva smjera - određivanje titra specifičnih protutijela u krvnom serumu bolesnika i antigena u stolici.

Za određivanje titra specifičnih protutijela obično se koristi RNHA, rjeđe RPHA ili RA. Kao antigeni uzimaju se suspenzija dnevne kulture bakterija (RA) ili eritrocitni dijagnostikum. ( RPGA, RNGA). Pouzdaniji treba smatrati povećanje titra antitijela u dinamici bolesti. Specifična protutijela u krvi bolesnika s AII pojavljuju se 3.-5. dana bolesti i povećavaju se do maksimuma unutar 2-3 tjedna, a zatim postupno opadaju. U male djece, osobito one s promijenjenom premorbidnom pozadinom, specifična protutijela u krvi se ne otkrivaju ili imaju niske titre (1:50 - 1:100).

U prisutnosti tipičnih kliničkih simptoma i otkrivanja dijagnostičkog titra specifičnih protutijela (1: 200) i više s odgovarajućim dijagnostikumom), ili povećanja njihovog titra u dinamici bolesti, klinička dijagnoza crijevne infekcije treba smatrati utvrđenim čak i u odsutnosti klijanja patogena iz fecesa pacijenta.

III. Metode ekspresne dijagnostike Crijevne infekcije temelje se na detekciji antigena uzročnika (bakterija ili virus) iz fecesa, za što se koristi izravna metoda luminiscentnih protutijela (PMLA) ili imunoadsorpcijska metoda - reakcija aglomeracije ugljena (RCA). preliminarni rezultat može se dobiti za 2-3 sata, a konačni za jedan dan. Specifičnost metode je 82-94,6%.

U posljednjih godina za brzu dijagnozu proljeva koriste se imunoenzimski test (ELISA) i lateks aglutinacija (RLA).

Etiološko dekodiranje virusnog proljeva provodi se virološkim i bakteriološkim metodama.

Optimalno razdoblje za otkrivanje virusa u izmetu smatra se od 1 do 4 dana bolesti, iako patogen često traje dulje.

Glavna metoda koja se koristi je metoda elektronske mikroskopije koja omogućuje morfološke značajke identificirati širok raspon virusnih uzročnika koji uzrokuju gastroenteritis.

Također se koristi imunoelektronska mikroskopija (temeljena na sposobnosti virusnih čestica u prisutnosti homolognih seruma ili rekonvalescentnih seruma da tvore agregate rotavirusnih čestica s imunoglobulinima.

Od metoda serodijagnostike tradicionalne uključuju reakciju neutralizacije, inhibiciju hemaglutinacije, fiksaciju komplementa.Dvostruko do četverostruko povećanje protutijela u uparenim serumima ima retrospektivnu vrijednost za dijagnozu. infekcija rotavirusom. Za otkrivanje rotavirusa ili njihovih antigena koriste se ELISA, difuzna precipitacija, lateks aglutinacija, reakcija koaglutinacije.

U praktičnom radu IFA je zauzela najšire mjesto – izolacija antigena rotavirusa u koprofilterima. Bolje je koristiti ove metode u dinamici (prvi dan hospitalizacije i nakon kliničkog oporavka).

Kako bi se isključila bakterijska etiologija AII, također se provodi bakteriološka studija fecesa inokulacijom na hranjivim medijima.

sigmoidoskopija metoda se rijetko koristi u djece, uglavnom za utvrđivanje uzroka produljenog izlučivanja bakterija i dijagnoze dugotrajnih i kroničnih oblika bolesti. Ova metoda ispitivanja omogućuje procjenu samo prirode morfoloških promjena u sluznici. distalni crijeva, ali se ne može koristiti za postavljanje etiološke dijagnoze crijevne infekcije.

Indikacije za instrumentalni pregled (ultrazvuk, rendgenski pregled organa trbušne šupljine, FGS) s AII je potreba za diferencijalnom dijagnozom s kirurškim bolestima trbušnih organa (invaginacija, upala slijepog crijeva), somatskim bolestima (gastritis, peptički ulkus, kolecistopankreatitis, itd.) i funkcionalnim poremećajima gastrointestinalnog trakta.

Određivanje kliničkog oblika toksikoze (neurotoksikoza, toksikoza s eksikozom, TSS), njezin stupanj (stadij), vrsta dehidracije kod infektivnog proljeva u djece i hitna pomoć

metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se naširoko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako prodiru u stanicu i značajke reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih čestica. nukleinske kiseline i bjelančevine. Razvijaju se metode za određivanje slijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje one kodiraju s nukleotidnim slijedom i utvrditi uzroke unutarstaničnih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološki procesi(interakcija antigena s protutijelima), biološka svojstva virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemoliza, enzimska aktivnost), značajke interakcije virusa sa stanicom domaćina (priroda citopatskog učinka, stvaranje intracelularnih inkluzija itd. .).

U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao iu pripremi pripravaka cjepiva, široko se koristi metoda kulture tkiva i stanica. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne kulture stanica. Primarne kulture dobivaju se dispergiranjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor stanica mogu biti tkiva i organi (češće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u tzv. madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje se nakon pričvršćivanja na površinu posude stanice počinju razmnožavati. Za virusnu infekciju obično se koristi stanični monosloj. Hranjiva tekućina se ocijedi, virusna suspenzija se unosi u određenim razrjeđenjima, a nakon kontakta sa stanicama dodaje se svježa hranjiva podloga, najčešće bez seruma.

Stanice iz većine primarnih kultura mogu se potkulturirati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolaskom stanica nastaje populacija stanica sličnih fibroblastima, sposobnih za brzo razmnožavanje, većina koji zadržava izvorni set kromosoma. To su takozvane diploidne stanice. U serijskom uzgoju stanica dobivaju se stabilne kontinuirane stanične kulture. Tijekom prolaza pojavljuju se homogene stanice koje se brzo dijele s heteroploidnim skupom kromosoma. Stabilne stanične linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u razne posude pomoću miksera. Postoji preko 400 staničnih linija izvedenih od 40 razne vrsteživotinje (uključujući primate, ptice, gmazove, vodozemce, ribe, kukce) i ljude.

U umjetnim hranjive podloge komadi se mogu uzgajati pojedinačna tijela i tkiva (organske kulture). Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (primjerice, koronavirusi).

Kod zaraženih stanične kulture virusi se mogu otkriti promjenom morfologije stanice, citopatskim djelovanjem, koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u stanici i u tekućini kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tekućini kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećim embrijima ili osjetljivim životinjama; detekcijom pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u stanicama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se odredio tip ili varijanta virusa koji cirkulira u populaciji (na primjer, identificirati serovarijantu virusa influence, divlje ili soj cjepiva polio virus, itd.); u slučajevima kada je potrebno provesti hitne epidemiološke mjere; kada se pojave nove vrste ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za označavanje virusa u objektima okoliš. Pri izolaciji virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane s dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobivena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a postupak dobivanja naziva se kloniranje.

Za izolaciju virusa, infekcije osjetljivih laboratorijskih životinja, koriste se pileći embriji, ali najčešće se koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa obično se određuje specifičnom degeneracijom stanica ( citopatski učinak), stvaranje simplasta i sincicija, otkrivanje intracelularnih inkluzija, kao i specifičnog antigena otkrivenog pomoću imunofluorescencije, hemadsorpcije, hemaglutinacije (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. Ovi se znakovi mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, poput virusa influence, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa koriste se novorođeni miševi. Identifikacija izoliranih virusa provodi se pomoću serološke reakcije i druge metode.

Pri radu s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa obično se provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i antigena specifičnih za virus. Metoda plaka može se koristiti za titraciju brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa žarišta su virusom uništenih stanica jednoslojne kulture tkiva pod agarom. Brojanje kolonija dopušta kvantitativna analiza infektivna aktivnost virusa na temelju toga što jedna infektivna čestica virusa tvori jedan plak. Plakovi se identificiraju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralno crvenim; plakovi ne apsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje stvaraju plak u 1 ml.

Pročišćavanje i koncentriranje virusa obično se provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u gradijentu koncentracije ili gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, kromatografija ionske izmjene, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje uzročnika ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinom slučaju ovisi o prirodi bolesti, razdoblju bolesti i mogućnostima laboratorija. Moderna dijagnostika virusnih infekcija temelji se na ekspresnim metodama koje vam omogućuju da dobijete odgovor nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala rani datumi nakon bolesti, To uključuje elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije, detekciju antitijela klase lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućuje diferencijaciju virusa i određivanje njihove koncentracije. Primjena elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve gdje je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj skupini. Taj se nedostatak uklanja primjenom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se temelji na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda specifični serum, a istovremeno dolazi do koncentracije virusnih čestica, što omogućuje njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U svrhu ekspresne dijagnostike provodi se elektronsko mikroskopsko ispitivanje ekstrakata tkiva, izmeta, tekućine iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija naširoko se koristi za proučavanje morfogeneze virusa, a njezine se mogućnosti proširuju korištenjem obilježenih protutijela.

Metoda molekularne hibridizacije, koja se temelji na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućuje detekciju pojedinačnih kopija gena i nema ravne u pogledu osjetljivosti. Reakcija se temelji na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNA ili RNA (sondi) i stvaranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Primjena kolorimetrijskih reakcija obećava. Postoji nekoliko varijanti molekularne hibridizacije: točkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dan bolesti) i nestaju nakon nekoliko tjedana, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Protutijela klase lgM otkrivaju se imunofluorescencijom ili uporabom enzimski imunološki test pomoću anti-μ antiseruma (anti-lgM seruma teškog lanca).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanje) : reakcije vezanja komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, neizravna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove se tehnike stalno usavršavaju. Ove se metode koriste za identifikaciju virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se odredio porast protutijela u drugom serumu u usporedbi s prvim (prvi serum uzima se u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 tjedna). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja protutijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela klase lgM ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela klase lgC traju nekoliko godina, a ponekad i cijeli život.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i protutijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina koristi se imunobloting. Metoda kombinira frakcioniranje proteina pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu s naknadnim imunološkim ispitivanjem proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za kemijskom čistoćom antigena i omogućuje identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimskog imunološkog testa posljedica prisutnosti protutijela na stanični antigeni, koji su prisutni kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija protutijela u serumima pacijenata na unutarnje i vanjske virusne antigene omogućuje određivanje stadija bolesti, au analizi populacije - varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i protutijela na njih. Pri analizi populacija metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. velika vrijednost Metoda se sastoji u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNA, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

20) Osnovno strukturna komponenta virioni(potpune virusne čestice) je nukleokapsida, tj. proteinski omotač (kapsid) koji okružuje virusni genom (DNA ili RNA). Nukleokapsida većine obitelji virusa okružena je lipoproteinskom ovojnicom. Između ovojnice i nukleokapsida kod nekih virusa (orto-, paramikso-, rabdo-, filo- i retrovirusi) nalazi se neglikozilirani matrični protein, koji virionima daje dodatnu krutost. Virusi većine obitelji imaju ovojnicu koja igra važnu ulogu u infektivnosti. Virioni dobivaju vanjski sloj ovojnice kada nukleokapsida pupanjem prodre kroz staničnu membranu. Proteine ovojnice kodira virus, a lipide posuđuje iz stanične membrane. Glikoproteini obično u obliku dimera i trimera tvore peplomere (izbočine) na površini viriona (orto-, paramiksovirusi, rhabdo-, filo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirusi). Glikozilirani fuzijski proteini povezani su s peplomerima i igraju ključnu ulogu u ulasku virusa u stanicu. Kapside i ovojnice viriona formiraju mnoge kopije jedne ili više vrsta proteinskih podjedinica kao rezultat procesa samosastavljanja. Interakcija u sustavu protein-protein zbog slabe kemijske veze, dovodi do spajanja simetričnih kapsida. Razlike kod virusa u obliku i veličini viriona ovise o obliku, veličini i broju strukturnih proteinskih podjedinica i prirodi međudjelovanja među njima. Kapsida se sastoji od mnogih morfološki izraženih podjedinica (kapsomera) sastavljenih od virusnih polipeptida na strogo definiran način, u skladu s relativno jednostavnim geometrijskim principima. Proteinske podjedinice, povezujući se jedna s drugom, tvore kapside dvije vrste simetrije: izometrične i spiralne. Građa nukleokapsida virusa s ovojnicom slična je građi nukleokapsida virusa bez ovojnice. Na površini ovojnice virusa razlikuju se morfološki izražene glikoproteinske strukture - peplomeri. Sastav superkapsidne membrane uključuje lipide (do 20-35%) i ugljikohidrate (do 7-8%), koji su staničnog podrijetla. Sastoji se od dvostrukog sloja staničnih lipida i proteina specifičnih za virus koji se nalaze izvan i unutar lipidnog biosloja. Vanjski sloj superkapsidne ljuske predstavljen je peplomerima (izbočinama) jednog ili više tipova, koji se sastoje od jedne ili više molekula glikoproteina. Nukleokapsida virusa s ovojnicom često se naziva jezgrom. središnji dio Virion koji sadrži nukleinsku kiselinu naziva se nukleoid. Kapsomeri (peplometri) se sastoje od strukturne jedinice građena od jednog ili više homolognih ili heterolognih polipeptidnih lanaca (proteinskih podjedinica). klasifikacija virusa Izometrične kapside nisu kugle, već pravilni poliedri (ikozaedri). Njihove linearne dimenzije su identične duž osi simetrije. Prema Kasparu i Klugu (1962.), kapsomeri u kapsidama raspoređeni su prema ikosaedarskoj simetriji. Takve kapside sastoje se od identičnih podjedinica koje tvore ikosaedar. Imaju 12 vrhova (kutova), 30 ploha i 20 ploha u obliku jednakokračnih trokuta. U skladu s tim pravilom, kapsid poliovirusa i virusa slinavke i šapa sastoji se od 60 proteinskih strukturnih jedinica, od kojih se svaka sastoji od četiri polipeptidna lanca. Ikosaedar optimalno rješava problem pakiranja ponavljajućih podjedinica u strogu kompaktnu strukturu s minimalnim volumenom. Samo neke konfiguracije strukturnih podjedinica mogu tvoriti površine, vrhove i lica virusnog ikosaedra. Na primjer, strukturne podjedinice adenovirusa tvore heksagonalne kapsomere (heksone) na površinama i licima, te peterokutne kapsomere (peptone) na vrhovima. Kod nekih virusa obje vrste kapsomera formiraju isti polipeptidi, kod drugih različiti polipeptidi. Budući da se strukturne podjedinice različitih virusa međusobno razlikuju, neki virusi izgledaju više heksagonalni, drugi sferičniji. Svi poznati virusi kralježnjaka koji sadrže DNA, s izuzetkom virusa velikih boginja, kao i mnogi virusi koji sadrže RNA (7 obitelji) imaju tip simetrije kubične kapside. Reovirusi, za razliku od drugih virusa kralježnjaka, imaju dvostruku kapsidu (vanjsku i unutarnju), od kojih se svaka sastoji od morfoloških jedinica. Virusi sa spiralnim tipom simetrije imaju oblik cilindrične filamentozne strukture, njihova genomska RNA ima oblik spirale i nalazi se unutar kapside. Svi životinjski virusi spiralne simetrije okruženi su lipoproteinskom ovojnicom. Spiralne nukleokapside karakteriziraju duljina, promjer, korak spirale i broj kapsomera po zavoju spirale. Dakle, u virusu Sendai (paramiksovirus), nukleokapsida je spirala duga oko 1 μm, promjera 20 nm i koraka spirale od 5 nm. Kapsida se sastoji od približno 2400 strukturnih jedinica, od kojih je svaka protein molekulske mase 60 kD. Postoji 11-13 podjedinica po zavoju spirale. U virusima sa spiralnim tipom nukleokapsidne simetrije, savijanje proteinskih molekula u spiralu osigurava maksimalnu interakciju između nukleinske kiseline i proteinskih podjedinica. U ikosaedarskim virusima, nukleinska kiselina je umotana unutar viriona i stupa u interakciju s jednim ili više polipeptida koji se nalaze unutar kapside.

Antireceptori (receptori) Virusni- proteini površinskih viriona, na primjer, hemaglutinin, koji se komplementarno vežu na odgovarajući receptor osjetljive stanice.

21) Imunološke metode u virološkim istraživanjima.

Serološki testovi razlikuju se po sposobnosti otkrivanja pojedinih klasa protutijela. Test aglutinacije, na primjer, dobar je za otkrivanje IgM protutijela, ali je manje osjetljiv za otkrivanje IgG protutijela. Testovi vezanja komplementa i hemolize, koji zahtijevaju komplement, ne otkrivaju antitijela koja se ne vežu na komplement, kao što su IgA antitijela i IgE antitijela. U reakciji neutralizacije virusa sudjeluju samo protutijela usmjerena protiv antigenskih determinanti površine viriona povezanih s patogenošću. Osjetljivost I. m. i. nadmašuje sve druge metode za proučavanje antigena i antitijela, posebno radioimunotest i enzimski imunotest omogućuju hvatanje prisutnosti proteina u količinama mjerenim u nanogramima, pa čak i u pikogramima. Uz pomoć I. m. i. odrediti skupinu i provjeriti sigurnost krvi (hepatitis B i HIV infekcija). Kod transplantacije tkiva i tijela I. m. omogućuju određivanje kompatibilnosti tkiva i testiranje metoda za suzbijanje nekompatibilnosti. U sudskoj medicini Castellanijeva reakcija koristi se za utvrđivanje specifičnosti vrste proteina, a reakcija aglutinacije za određivanje krvne grupe.

Imunološke metode se široko koriste u laboratorijska dijagnostika zarazne bolesti. Etiologija bolesti također se utvrđuje na temelju porasta protutijela na uzročnika u krvnom serumu rekonvalescenta u usporedbi s uzorkom uzetim u prvim danima bolesti. Na temelju I. m. i. proučavati imunitet stanovništva u odnosu na masovne infekcije, poput gripe, te također procijeniti učinkovitost preventivnih cijepljenja.

Ovisno o njihovom mehanizmu i prikazu rezultata I. m. i. mogu se podijeliti na reakcije koje se temelje na fenomenu aglutinacije; reakcije temeljene na fenomenu taloženja; reakcije koje uključuju komplement; reakcija neutralizacije; reakcije pomoću kemijskih i fizikalnih metoda.

Reakcije temeljene na fenomenu aglutinacije. Aglutinacija je lijepljenje stanica ili pojedinih čestica - nositelja antigena uz pomoć imunološkog seruma na ovaj antigen.

Bakterijski test aglutinacije s odgovarajućim antibakterijskim serumom jedan je od najjednostavnijih seroloških testova. Različitim razrjeđenjima ispitivanog krvnog seruma dodaje se suspenzija bakterija i nakon određenog kontaktnog vremena na t°37° bilježi se pri kojem najvećem razrjeđenju krvnog seruma dolazi do aglutinacije. Reakcija aglutinacije bakterija koristi se za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti: bruceloze, tularemije, trbušnog i paratifusnog tifusa, bacilarne dizenterije i tifusa.

Reakcija pasivne ili neizravne hemaglutinacije (RPGA, RNGA). Koristi eritrocite ili neutralne sintetske materijale (primjerice, čestice lateksa), na čijoj su površini adsorbirani antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni.

Test pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama ( trbušni tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoe (malarija) i virusi (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, encefalitis koji prenose krpelji, krimski hemoragijska groznica itd.), kao i za određivanje nekih hormona, identificirati preosjetljivost bolestan do lijekovi te hormoni poput penicilina i inzulina.

Test inhibicije hemaglutinacije (HITA) temelji se na fenomenu prevencije (inhibicije) imunološkog seruma hemaglutinacije eritrocita virusima, a koristi se za dokazivanje i titraciju antivirusnih protutijela. Služi kao glavna metoda serodijagnostike gripe, ospica, rubeole, zaušnjaci, krpeljni encefalitis i druge virusne infekcije, čiji uzročnici imaju hemaglutinirajuća svojstva. na primjer, za serodijagnozu encefalitisa koji prenose krpelji, dvostruka razrjeđenja bolesnikova seruma u otopini alkalnog boratnog pufera ulijevaju se u jažice ploče. Zatim se dodaje određena količina, obično 8 AU (aglutinirajućih jedinica), antigena krpeljnog encefalitisa, a nakon 18 sati izlaganja na t ° 4 °, uvodi se suspenzija guščjih eritrocita pripremljena u otopini kiselog fosfatnog pufera. Ako u krvnom serumu bolesnika postoje protutijela na virus krpeljnog encefalitisa, tada se antigen neutralizira i ne dolazi do aglutinacije eritrocita.

Reakcije temeljene na fenomenu taloženja. Taloženje nastaje kao rezultat interakcije protutijela s topivim antigenima. Najjednostavniji primjer reakcije taloženja je stvaranje neprozirne precipitacijske trake u epruveti na granici slojeva antigena na antitijelu. Široko se koriste različite vrste reakcija taloženja u polutekućem agaru ili agaroznom gelu (Ouchterlonova dvostruka imunodifuzijska metoda, radijalna imunodifuzijska metoda, imunoelektroforeza), koje su i kvalitativne i kvantitativne. Kao rezultat slobodne difuzije u gelu antigena i antitijela u zoni njihovog optimalnog omjera, nastaju specifični kompleksi - precipitacijske trake, koje se otkrivaju vizualno ili bojenjem. Značajka metode je da svaki par antigen-antitijelo formira individualnu precipitacijsku traku, a reakcija ne ovisi o prisutnosti drugih antigena i antitijela u sustavu koji se proučava.

Reakcije koje uključuju komplement, koji se koristi kao svježi serum zamorca, temelje se na sposobnosti podkomponente komplementa Clq, a zatim i drugih komponenata komplementa da se vežu za imunološke komplekse.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) omogućuje titraciju antigena ili protutijela prema stupnju fiksacije komplementa kompleksom antigen-antitijelo. Ova reakcija sastoji se od dvije faze: interakcije antigena s ispitivanim krvnim serumom (testni sustav) i interakcije hemolitičkog seruma s eritrocitima ovna (indikatorski sustav). Na pozitivna reakcija u sustavu koji se proučava dolazi do fiksacije komplementa, a zatim, kada se dodaju eritrociti osjetljivi na antitijela, hemoliza se ne opaža. Reakcija se koristi za serodijagnostiku sifilisa (Wassermannova reakcija), virusnih i bakterijskih infekcija.

Reakcija neutralizacije temelji se na sposobnosti protutijela da neutraliziraju određene specifične funkcije makromolekularnih ili topivih antigena, kao što su aktivnost enzima, bakterijski toksini i patogenost virusa. Reakcija neutralizacije toksina može se procijeniti biološkim učinkom, npr. titriraju se antitetanusni i antibotulinum serumi. Mješavina toksina i antiseruma primijenjena na životinje ne uzrokuje njihovu smrt. U virologiji se koriste različite varijante reakcije neutralizacije. Kada se virusi pomiješaju s odgovarajućim antiserumom i ta smjesa se primijeni na životinje ili stanične kulture, patogenost virusa se neutralizira i životinje se ne razboljevaju, a stanice kultura se ne uništavaju.

Reakcije pomoću kemijskih i fizikalnih oznaka. Imunofluorescencija se sastoji u upotrebi antitijela obilježenih fluorokromom, točnije imunoglobulinske frakcije IgG antitijela. Antitijelo obilježeno fluorokromom tvori kompleks antigen-antitijelo s antigenom, koji postaje dostupan za promatranje pod mikroskopom u UV zrakama koje pobuđuju luminiscenciju fluorokroma. Reakcija izravne imunofluorescencije koristi se za proučavanje staničnih antigena, otkrivanje virusa u zaraženim stanicama i otkrivanje bakterija i rikecija u razmazima.

Šire se koristi metoda neizravne imunofluorescencije. temelji se na detekciji kompleksa antigen-antitijelo pomoću luminiscentnih seruma anti-lgG antitijela i koristi se za detekciju ne samo antigena, već i za titraciju antitijela.

Imunoenzimske ili enzimske imunološke metode temelje se na upotrebi protutijela konjugiranih s enzimima, uglavnom peroksidazom hrena ili alkalnom fosfatazom. Poput imunofluorescencije, enzimski imunotest se koristi za otkrivanje antigena u stanicama ili za titraciju antitijela na stanicama koje sadrže antigen.

Radioimunološka metoda temelji se na korištenju radioizotopne oznake antigena ili protutijela. Najosjetljivija je metoda za određivanje antigena i antitijela, koristi se za određivanje hormona, ljekovite tvari i antibiotici, za dijagnostiku bakterijskih, virusnih, rikecijskih, protozoalnih bolesti, proučavanje krvnih proteina, tkivnih antigena.

Imunobloting se koristi za otkrivanje protutijela na pojedinačne antigene ili "prepoznavanje" antigena iz poznatih seruma. Metoda se sastoji od 3 faze: razdvajanje bioloških makromolekula (na primjer virusa) u pojedinačne proteine pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu; prijenos odvojenih proteina iz gela na čvrstu podlogu (blot) nanošenjem ploče poliakrilamidnog gela na aktivirani papir ili nitrocelulozu (elektroblot); detekcija željenih proteina na supstratu izravnim ili neizravnim enzimskim imunotestom. Kao dijagnostička metoda, imunobloting se koristi za HIV infekciju. Dijagnostička vrijednost je otkrivanje protutijela na jedan od proteina vanjske ljuske virusa.

22) Tipovi simetrije virusa (kubični, spiralni, mješoviti). Interakcija proteina i nukleinskih kiselina u pakiranju virusnih genoma.

Ovisno o interakciji kapside s nukleinskom kiselinom, čestice virusa mogu se podijeliti u nekoliko tipova simetrije:

1). Tip kubične simetrije.

Kubične kapside su ikosideri s otprilike 20 trokutastih ploha i 12 vrhova. Oni tvore strukturu nalik sfernoj formaciji, ali zapravo je to poliedar. U nekim slučajevima, posebne lipoproteinske formacije koje se nazivaju šiljci pričvršćene su na vrhove takvih ikosaedarskih poliedara. Uloga ovih šiljaka vjerojatno se svodi na interakciju viriona ili virusnih čestica s odgovarajućim područjima stanica domaćina koja su na njih osjetljiva. S kubičnom simetrijom, virusna nukleinska kiselina je zbijeno upakirana (umotana u kuglu), a proteinske molekule je okružuju, tvoreći poliedar (ikosaedar). Ikosaedar je poliedar s dvadeset trokutastih stranica koji ima kubičnu simetriju i približno sferni oblik. Ikozaedarski virusi uključuju herpes simplex virus, reoviruse itd.

2). Tip spiralne simetrije. Spiralne kapside su nešto jednostavnije. Oni. Kapsomeri koji čine kapsidu prekrivaju spiralni NK i također tvore prilično stabilnu proteinsku ovojnicu ovih virusa. A kada se koriste elektronski mikroskopi visoke rezolucije i odgovarajuće metode pripreme, mogu se vidjeti spiralne strukture na virusima. Uz spiralnu simetriju kapside, virusna nukleinska kiselina tvori spiralnu (ili spiralnu) figuru, šuplju iznutra, a proteinske podjedinice (kapsomere) također su naslagane oko nje u spiralu (tubularna kapsida). Primjer virusa sa spiralnom simetrijom kapside je virus duhanskog mozaika, koji je štapićastog oblika, duljine mu je 300 nm s promjerom od 15 nm. Sastav virusne čestice uključuje jednu molekulu RNK veličine oko 6000 nukleotida. Kapsida se sastoji od 2000 identičnih proteinskih podjedinica raspoređenih u spiralu.

3). Mješoviti ili složeni tip simetrija. U pravilu, ova vrsta simetrije nalazi se uglavnom među bakterijskim virusima. A klasični primjeri su ti fagi, E. coli ili umjereni fagi. To su složene formacije koje imaju glavu s unutarnjim nukleinskim sadržajem, razne vrste dodataka, repni proces, različitim stupnjevima složenost uređaja. I svaka komponenta takvih čestica obdarena je specifičnom funkcijom koja se ostvaruje u procesu interakcije između virusa i stanice. Drugim riječima, složena vrsta simetrije je kombinacija kubične simetrije, glava je ikosider poliedra, a štapićaste formacije su repni izrastci. Iako među bakterijskim virusima postoje i prilično jednostavno organizirani virioni, koji su primitivni nukleokapsidi, sferičnog ili kubičnog oblika. Bakterijski virusi su složeniji od biljnih i životinjskih virusa.

24) Interakcija faga sa stanicom. Virulentni i umjereni fagi.

Adsorpcija.

Interakcija počinje pričvršćivanjem virusnih čestica na površinu stanice. Proces postaje moguć u prisutnosti odgovarajućih receptora na površini stanice i antireceptora na površini virusne čestice.

Virusi koriste stanične receptore dizajnirane za prijenos bitnih tvari: hranjivih čestica, hormona, faktora rasta itd.

Receptori: proteini, ugljikohidratna komponenta proteina i lipida, lipidi. Specifični receptori određuju daljnju sudbinu virusne čestice (transport, isporuka u područja citoplazme ili jezgre). Virus se može vezati za nespecifične receptore i čak prodrijeti u stanicu. Međutim, ovaj proces ne uzrokuje infekciju.

U početku se stvara jednostruka veza između antireceptora i receptora. Ova veza je krhka i može puknuti. Za nastanak ireverzibilne adsorpcije potrebno je viševalentno pričvršćivanje. Do stabilnog vezanja dolazi zbog slobodnog kretanja receptorskih molekula u membrani. Tijekom interakcije virusa sa stanicom uočava se povećanje fluidnosti lipida i stvaranje receptorskih polja u području interakcije između virusa i stanice. Receptori brojnih virusa mogu biti prisutni samo u ograničenom skupu stanica domaćina. To određuje osjetljivost organizma na ovaj virus. Dakle, virusna DNA i RNA imaju sposobnost zaraziti širi raspon stanica domaćina.

Antireceptori se mogu pronaći u jedinstvenim virusnim organelama: izrasline u T-bakteriofagima, vlakna u adenovirusa, šiljci na površini virusnih membrana, korona u koronavirusa.

Prodiranje.

2 mehanizma - endocitoza receptora i fuzija membrane.

Receptorska endocitoza:

Uobičajeni mehanizam ulaska hranjivih i regulatornih tvari u stanicu. Javlja se u specijaliziranim područjima - gdje postoje posebne jame prekrivene klatrinom, specifični receptori nalaze se na dnu jame. Jame omogućuju brzu invaginaciju i stvaranje vakuola prekrivenih klatrinom (od trenutka adsorpcije ne prođe više od 10 minuta, u jednoj minuti može se formirati do 2000 vakuola). Vakuole se stapaju s većim citoplazmatskim vakuolama da bi formirale receptorosome (koji više ne sadrže klatrin), koji se zatim stapaju s lizosomima.

Fuzija virusnih i staničnih membrana:

Kod virusa s ovojnicom, fuzija je posljedica točkaste interakcije virusni protein s lipidima stanične membrane, uslijed čega se lipoproteinska ovojnica virusa integrira u staničnu membranu. Kod virusa bez ovojnice jedan od površinskih proteina također stupa u interakciju s lipidima. stanične membrane a unutarnja komponenta prolazi kroz membranu (kod paramiksovirusa – F-protein, kod ortomiksovirusa – HA2 hemaglutinirajuća podjedinica). Na konformaciju površinskih proteina utječe pH.

Traka.

U tom procesu nestaje infektivna aktivnost, često se javlja osjetljivost na nukleaze i javlja se rezistencija na antitijela. Krajnji produkt svlačenja su nukleinske kiseline vezane za unutarnji virusni protein. Stadij svlačenja također ograničava mogućnost infekcije (virusi se ne mogu svući u svakoj stanici). Svlačenje se događa u specijaliziranim područjima stanice: lizosomima, Golgijevom aparatu i perinuklearnom prostoru.

Svlačenje se odvija kao rezultat niza reakcija. Na primjer, u pikornavirusima, svlačenje se odvija stvaranjem srednjih subviralnih čestica veličine od 156 do 12S. Kod adenovirusa u citoplazmi i jezgrinim porama ima najmanje 3 stadija:

Stvaranje subviralnih čestica veće gustoće od viriona;

Stvaranje jezgri u kojima nedostaju 3 virusna proteina;

Stvaranje kompleksa DNA-protein u kojem je DNA kovalentno povezana s terminalnim proteinom.

Karakterizacija virulentnih i umjerenih faga.

Kada je bakterija zaražena fagom, dolazi do tzv. litičke infekcije, tj. infekcije koja kulminira lizom stanice domaćina, ali to je karakteristično samo za takozvane virulentne fage, čija interakcija sa stanicom dovodi do stanične smrti i stvaranja fagnog potomstva.

U tom slučaju razlikuju se sljedeći stupnjevi prema interakcijama faga sa stanicom: miješanje faga sa staničnom kulturom (mnoštvo infekcije je 1 fag na 10 stanica), a koncentracija mora biti dovoljno visoka da se fagi mogu kontaktirati stanice. Kako bi se izbjegla ponovna infekcija - nakon infekcije maksimalno 5 minuta, kada se fagi adsorbiraju - ova smjesa stanica s fagom se razrjeđuje. Razlikuje se latentno razdoblje tijekom kojeg se količina faga ne povećava, a zatim vrlo kratak period izlaz, kada broj čestica faga naglo poraste, kada stanica lizira i potomstvo faga se oslobodi, a tada broj faga ostaje na istoj razini, jer ne dolazi do ponovne infekcije. Na temelju ove krivulje mogu se razlikovati ove faze: vegetativno razdoblje "rasta" (latentno razdoblje), izlazno razdoblje i izračunati prinos faga po 1 zaraženoj stanici. Tijekom latentnog razdoblja u bakterijama se ne može naći ništa što bi podsjećalo na čestice faga, te nije moguće izolirati infektivni princip iz takvih stanica u latentnom razdoblju. Samo zrele čestice faga mogu zaraziti bakterije. Dakle, virulentni fagi uvijek uzrokuju smrt bakterija i proizvode infekciju, koja se očituje u proizvodnji novih virusnih čestica sposobnih zaraziti sljedeće i druge osjetljive stanice.

Za razliku od virulentnih, infekcija umjerenim fagima ne dovodi do lize bakterijskih stanica, već se ostvaruje stvaranje posebnog stanja koegzistencije faga s bakterijskom stanicom. Ova koegzistencija se izražava u činjenici da je određeni početak faga prisutan u bakterijskoj stanici bez ikakvih nepovoljnih uvjeta za to i čuva se iz generacije u generaciju. U određenim fazama takvog suživota fag se aktivira u stanici i ulazi u stanje litičkog ciklusa razvoja, uzrokujući lizu stanice i oslobađanje fagnog potomstva. Takvi se fagi nazivaju lizogeni ili umjereni fagi, a stanje umjerenog postojanja s fagom je lizogenija, a bakterije koje sadrže takav latentni fag nazivaju se lizogene bakterije. Naziv lizogene bakterije proizašao je iz činjenice da su jednom otkrivene kulture u kojima se spontano pojavio fag, pa se taj bakteriofag počeo smatrati kontaminacijom kulture, odnosno ulazak bakterijskog virusa u kulturu, te su takve kulture nazvane lizogenim, odnosno generiraju lizu .

Virološke metode istraživanja- metode proučavanja biologije virusa i njihove identifikacije. U virologiji se naširoko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako prodiru u stanicu i značajke reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina. i bjelančevine. Razvijaju se metode za određivanje slijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje one kodiraju s nukleotidnim slijedom i utvrditi uzroke unutarstaničnih procesa koji igraju važnu ulogu u infekciji e-virusom.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s protutijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemoliza, enzimska aktivnost), značajkama interakcije virusa sa stanicom domaćina (priroda citopatije). učinak, stvaranje intracelularnih inkluzija, itd.) .

Stanice iz većine primarnih kultura mogu se potkulturirati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolaskom stanica nastaje populacija stanica sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava izvorni set kromosoma. To su takozvane diploidne stanice. U serijskom uzgoju stanica dobivaju se stabilne kontinuirane stanične kulture. Tijekom prolaza pojavljuju se homogene stanice koje se brzo dijele s heteroploidnim skupom kromosoma. Stabilne stanične linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u raznim posudama pomoću mješalica. Postoji više od 400 staničnih linija izvedenih iz 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmazove, vodozemce, ribe, kukce) i ljudi.

Dijelovi pojedinih organa i tkiva (organske kulture) mogu se uzgajati u umjetnim hranjivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (primjerice, koronavirusi).

U zaraženim kulturama stanica viruse je moguće otkriti promjenom morfologije stanice, citopatskim djelovanjem, koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u stanici i u tekućini kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tekućini kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećim embrijima ili osjetljivim životinjama; detekcijom pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u stanicama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među stanovništvom (na primjer, identificirati serovarijantu virusa a, divlji ili cjepni soj virusa a, itd.); u slučajevima kada je potrebno provesti hitne epidemiološke mjere; kada se pojave nove vrste ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoliša. Pri izolaciji virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane s dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobivena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a postupak dobivanja naziva se kloniranje.

stvaranje simplasta i sincicija, otkrivanje intracelularnih inkluzija, kao i specifičnog antigena detektiranog imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. Ovi se znakovi mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, primjerice virusa a, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa - novorođeni miševi. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim testovima i drugim metodama.

Pri radu s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa obično se provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i antigena specifičnih za virus. Metoda plaka može se koristiti za titraciju brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa žarišta su virusom uništenih stanica jednoslojne kulture tkiva pod agarom. Brojanje kolonija omogućuje kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na temelju činjenice da jedna čestica zaraznog virusa tvori jedan plak. Plakovi se identificiraju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralno crvenim; plakovi ne apsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje stvaraju plak u 1 ml.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje uzročnika ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinom slučaju ovisi o prirodi bolesti, razdoblju bolesti i mogućnostima laboratorija. Suvremena dijagnoza virusnih infekcija temelji se na ekspresnim metodama koje vam omogućuju da dobijete odgovor nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim fazama nakon bolesti. To uključuje elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju,

kao i imunofluorescencija, metoda molekularne hibridizacije, detekcija antitijela klase lgM itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dan bolesti) i nestaju nakon nekoliko tjedana, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Protutijela klase IgM otkrivaju se imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom pomoću anti-m antiseruma (anti-IgM seruma teškog lanca).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanja ): reakcije vezanja komplementa

inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, neizravna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove se tehnike stalno usavršavaju. Ove se metode koriste za identifikaciju virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se odredio porast protutijela u drugom serumu u usporedbi s prvim (prvi serum uzima se u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 tjedna). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja protutijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela klase lgM ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela klase lgC traju nekoliko godina, a ponekad i cijeli život.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i protutijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina koristi se imunobloting. Metoda kombinira frakcioniranje proteina pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu s naknadnim imunološkim ispitivanjem proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za kemijskom čistoćom antigena i omogućuje identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimskog imunološkog testa posljedica prisutnosti antitijela na stanične antigene, koji su prisutni kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija protutijela u serumima pacijenata na unutarnje i vanjske virusne antigene omogućuje određivanje stadija bolesti, au analizi populacije - varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i protutijela na njih. Pri analizi populacija metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode leži u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNA, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

Bibliografija: Bukrinskaja A.G. Virologija, M., 1986; Virologija, Metode, ur. B. Meikhi, prev. s engleskog, M., 1988.; Priručnik mikrobioloških i viroloških istraživačkih metoda, ur. M.O. Birger, M., 1982.

Virološke studije su studije namijenjene izolaciji virusa i proučavanju njihovih svojstava, kao i utvrđivanju etiološke povezanosti virusa s određenim bolestima.

Materijal za studiju uzima se ovisno o lokaciji dominantnih virusa u tijelu pacijenta i načinima na koje su izolirani tijekom vanjsko okruženje. Materijal se skuplja u sterilnu posudu, dostavlja u laboratorij što je prije moguće i čuva dok se studija ne zamrzne ili na ledu. Prije upotrebe, materijal za izolaciju virusa se obrađuje (i) radi suzbijanja strane mikroflore i podvrgava uklanjanju velikih čestica.

Izolacija virusa provodi se inficiranjem laboratorijskih životinja, pilećih embrija, kulture tkiva materijalom koji sadrži virus. Izbor metode izolacije ovisi o navodnom uzročniku bolesti. Dakle, kulture tkiva (vidi) koriste se pri radu s virusima koji nisu patogeni za laboratorijske životinje ili kada se otkriju u kulturi tkiva ranije nego kada su životinje zaražene. Inficiraju se pileći embriji kako bi se izolirali uzročnici, infektivni parotitis (u amnionskoj i alantoisnoj šupljini), (u žumanjčana vrećica), velike boginje (na horioalantoičkoj membrani).

Od laboratorijskih životinja za izolaciju virusa najčešće se koriste bijeli miševi, zatim zečevi, štakori, zamorci, majmuni. Za arboviruse, najučinkovitije unošenje materijala koji sadrži virus u glavu ili, za pneumotropne viruse - na sluznicu dišni put, za viruse malih boginja, na skarificiranoj rožnici.

Izolacija virusa najučinkovitija je u akutnom razdoblju bolesti. Bitna točka u utvrđivanju virusne prirode bolesti su rezultati serološke studije seruma koji su uzeti više puta od istog bolesnika na početku bolesti i tijekom rekonvalescencije. Otkrivanje protutijela na izolirane viruse u drugom serumu u titru 4 ili više puta većem nego u prvom ukazuje na etiološku povezanost virusa s ovom bolešću.

Rano i brza metoda detekcija virusnih antigena je metoda fluorescentnih antitijela koja se temelji na specifičnoj fiksaciji antitijela obilježenih fluorokromom na površini antigena. Antigen se lako otkriva luminiscentnom mikroskopijom (vidi) zahvaljujući svijetloj fluorescenciji antitijela adsorbiranih na antigen. Metodom fluorescentnih antitijela ispituju se brisevi uzeti od pacijenata, histološki isječci zahvaćenih tkiva, preparati iz kulture tkiva. Također se primjenjuje na otkrivanje elementarnih tijela (viriona) (vidi). Od ostalih morfoloških metoda koriste se one koje otkrivaju intracelularne virusne inkluzije u dijelovima zahvaćenih organa i tkiva. Otkrivanje inkluzija ukazuje na infekciju iu nekim slučajevima pridonosi dijagnozi. virusna bolest. Koriste se različite metode za otkrivanje virusnih protutijela u krvi bolesnika i proučavanje antigene strukture virusa. Reakcija neutralizacije koristi se kod gotovo svih virusnih infekcija. Temelji se na sposobnosti imunoloških protutijela da neutraliziraju zarazna svojstva virusa kada se smjesa unese u tijelo osjetljivih životinja ili u kulturu tkiva. Za određivanje indeksa neutralizacije konstantna doza seruma se miješa s različitim razrjeđenjima virusa, a za određivanje titra antitijela - razna razrjeđenja serum s konstantnom dozom virusa. Kontrola je infekcija životinja (ili kultura tkiva) mješavinom virusa s normalnim serumom ili sa fiziološka otopina. Reakcija neutralizacije postavlja se ne samo za otkrivanje protutijela, već i za određivanje vrste i vrste virusa.

Reakcija fiksacije komplementa [na primjer, Borde-Zhangu reakcija (vidi)] koristi se za otkrivanje i virusnih antigena i protutijela. U prvom slučaju poznati imunološki serum stupa u interakciju s materijalom u kojem se pretpostavlja prisutnost antigena: krvni serum, nazofaringealni brisevi, ekstrakti tkiva zaraženog organizma. U drugom slučaju poznati antigen (diagnosticum) i serum bolesnika ili rekonvalescenta.

RSK se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih gripom, boginjama, adenovirusima i arbovirusima.

Virološka metoda uključuje dvije glavne faze: izolaciju virusa i njihovu identifikaciju. Materijali mogu biti krv, druge biološke i patološke tekućine, biopsije organa i tkiva.

Virološko testiranje krvi često se provodi za dijagnosticiranje arbovirusnih infekcija. U slini se mogu otkriti virusi bjesnoće, zaušnjaka i herpes simplex virusa. Nazofaringealni brisevi koriste se za izolaciju uzročnika gripe i drugih akutnih respiratornih virusnih infekcija, ospica. U ispiranjima s konjunktive nalaze se adenovirusi. Razni entero-, adeno-, reo- i rotavirusi izolirani su iz fecesa.

Za izolaciju virusa koriste se stanične kulture, pileći embriji, a ponekad i laboratorijske životinje. Većina patogenih virusa razlikuje se po prisutnosti tkivne i tipske specifičnosti, "na primjer, poliovirus se razmnožava samo u stanicama primata, stoga se za izolaciju specifičnog virusa koristi odgovarajuća kultura tkiva. Za izolaciju nepoznatog patogena, preporučljivo je istovremeno inficirati 3-4 stanične kulture, pod pretpostavkom da jedna od njih može biti osjetljiva. Prisutnost virusa u zaraženim kulturama određena je razvojem specifične stanične degeneracije, tj. citopatogenim učinkom, otkrivanjem intracelularnih inkluzija, kao i na temelju detekcija specifičnog antigena imunofluorescencijom, pozitivnom reakcijom hemadsorpcije i hemaglutinacije. Embriji ptica sa svojim slabo diferenciranim tkivima pogodni su za uzgoj velikog broja virusa. Najčešće se koriste pileći embriji. Kod razmnožavanja u embrijima virusi mogu uzrokovati njihovu smrt ( arbovirusi), pojava promjena na korion-alantoisnoj membrani (poksvirusi) ili u tijelu embrija, akumulirane tj. u embrionalnim tekućinama hemaglutinina (virusi gripe, zaušnjaka) i virusnog antigena koji fiksira komplement.

Virusi se identificiraju imunološkim metodama: inhibicija hemaglutinacije, fiksacija komplementa, neutralizacija, precipitacija u gelu, imunofluorescencija.

3.4 Biološka metoda

biološka metoda sastoji se u inficiranju laboratorijskih životinja različitim materijalom (kliničkim, laboratorijskim) radi indikacije patogena, kao i radi utvrđivanja određenih svojstava mikroorganizama koja karakteriziraju njihovu patogenost (toksogenost, toksičnost, virulencija). Kao laboratorijske životinje koriste se bijeli miševi, bijeli štakori, zamorci, kunići itd.

Razmnožavanje bolesti kod životinje apsolutni je dokaz patogenosti izoliranog mikroorganizma (u slučaju bjesnoće, tetanusa i sl.). Stoga je biološki test na životinjama vrijedna i pouzdana dijagnostička metoda, posebice za one infekcije čiji se uzročnici nalaze u niskim koncentracijama u proučavanim biološkim podlogama ljudskog organizma, a na umjetnim podlogama rastu slabo ili usporeno.

3.5 Imunološka metoda

Imunološka metoda(serološki) obuhvaća istraživanja krvnog seruma, kao i drugih bioloških supstrata za dokazivanje specifičnih protutijela i antigena. Klasična serodijagnostika temelji se na određivanju protutijela na identificiranog ili sumnjivog uzročnika. Pozitivan rezultat reakcije ukazuje na prisutnost antitijela na antigene patogena u testnom krvnom serumu, negativan rezultat ukazuje na odsutnost istih. Otkrivanje protutijela na uzročnika niza zaraznih bolesti u krvnom serumu koji se proučava nije dovoljno za postavljanje dijagnoze, jer može odražavati prisutnost postinfektivnog ili post-cijepljenja imuniteta, dakle, "uparena" krv ispituju se serumi, prvi uzeti u prvim danima bolesti, a drugi u razmaku od 7-10 dana. U ovom slučaju procjenjuje se dinamika povećanja razine antitijela.

Dijagnostički značajno povećanje titra antitijela u ispitivanom krvnom serumu je najmanje 4 puta u odnosu na početnu razinu. Taj se fenomen naziva serokonverzija. Kod rijetkih zaraznih bolesti, kao i kod virusnih hepatitisa, HIV infekcije i nekih drugih, prisutnost antitijela ukazuje da je pacijent zaražen i ima dijagnostičku vrijednost.

Osim određivanja titra protutijela, serološkim studijama može se odrediti izotip protutijela. Poznato je da se pri prvom susretu ljudskog tijela s patogenom u akutnom razdoblju bolesti otkriva brži porast protutijela koja pripadaju IgM, čija se razina, dosegnuvši maksimalnu vrijednost, zatim smanjuje. U kasnijim stadijima bolesti povećava se broj IgG protutijela koja dulje perzistiraju i određuju se u razdoblju rekonvalescencije. Pri ponovnom susretu s uzročnikom, zbog imunološke memorije, reakcije humoralne imunosti očituju se bržim stvaranjem protutijela IgG, a protutijela klase M stvaraju se u malim količinama. Otkrivanje IgM protutijela ukazuje na prisutnost struje infektivni proces, i prisutnost IgG protutijela - o prošloj infekciji ili post-cijepljenom imunitetu.

S obzirom na karakteristike primarnog i sekundarnog imunološkog odgovora, analiza omjera IgM- i IgG-antitijela omogućuje u nekim slučajevima razlikovanje stadija infektivnog procesa (visina bolesti, oporavak, recidiv). Primjerice, u slučaju virusnog hepatitisa A (HA) pouzdana dijagnostička metoda je određivanje anti-HAV IgM protutijela u krvnom serumu. Njihovo otkrivanje ukazuje na trenutnu ili nedavnu HAV infekciju.

Serološko testiranje za otkrivanje antitijela u zarazne bolesti je više pristupačna metoda laboratorijska dijagnostika nego izolacija uzročnika. Ponekad je pozitivna serološka reakcija jedini dokaz susreta i interakcije organizma s uzročnikom odgovarajuće zarazne bolesti. Osim toga, niz bolesti sa sličnom kliničkom slikom (primjerice, rikecioze, enterovirusne infekcije) mogu se razlikovati samo serološki, što odražava važnost seroloških metoda u dijagnostici zaraznih bolesti.

Udio: