Serodijagnostika virusnih infekcija, korištene reakcije. Metode mikrobiološke dijagnostike virusnih bolesti. Metode izolacije i identifikacije virusa. Serološki testovi koji se koriste za dijagnosticiranje virusnih bolesti Koriste se serološki testovi
HIV infekcija
HIV infekcija je bolest uzrokovana virusom humane imunodeficijencije (HIV), dugo vrijeme perzistiraju u limfocitima, makrofagima, ćelijama nervnog tkiva, što rezultira polako progresivnim oštećenjem imunološkog sistema i nervni sistem organizma, manifestira se sekundarnim infekcijama, tumorima, subakutnim encefalitisom i drugim patološkim promjenama.
Patogeni - virusi humane imunodeficijencije t-tog i 2. tipa - HIV-1, HIV-2 (HIV-I, HIV-2, virusi humane imunodeficijencije, tipovi I, 11) - pripadaju porodici retrovirusa, podfamiliji spori virusi. Virioni su sferne čestice prečnika 100-140 nm. Virusna čestica ima vanjsku fosfolipidnu ljusku, koja uključuje glikoproteine (strukturne proteine) određene molekularne težine, mjerene u kilodaltonima. Kod HIV-1, to su gp 160, gp 120, gp 41. Unutrašnji omotač virusa koji pokriva jezgro je takođe predstavljen proteinima sa poznatom molekulskom težinom - p 17, p 24, p 55 (HIV-2 sadrži gp 140, str. 105, str. 36, str. 16, str. 25, str. 55).
HIV genom sadrži RNK i enzim reverznu transkriptazu (revertazu). Da bi se genom retrovirusa povezao sa genomom ćelije domaćina, DNK se prvo sintetizira na virusnoj RNK šabloni pomoću reverzetaze. DNK provirusa se zatim integriše u genom ćelije domaćina. HIV ima izraženu antigensku varijabilnost, koja je znatno veća od virusa gripa.
U ljudskom tijelu, glavna meta HIV-a su T-limfociti koji se nose na površini najveći broj CD4 receptori. Nakon što HIV uđe u ćeliju uz pomoć reversetaze, virus sintetizira DNK na osnovu obrasca svoje RNK, koja je integrirana u genetski aparat ćelije domaćina (T-limfociti) i tamo ostaje doživotno u stanju provirusa. . Osim T-limfocita-pomagača, zahvaćeni su makrofagi, B-limfociti. neuroglijalnih stanica, crijevne sluznice i nekih drugih stanica. Razlog za smanjenje broja T-limfocita (CD4 stanica) nije samo direktan citopatski učinak virusa, već i njihova fuzija sa neinficiranim stanicama. Uz poraz T-limfocita kod pacijenata sa HIV infekcijom, bilježi se poliklonska aktivacija B-limfocita s povećanjem sinteze imunoglobulina svih klasa, posebno IgG i IgA, te kasnijim iscrpljivanjem ovog odjeljka. imunološki sistem. Disregulacija imuni procesi manifestuje se i povećanjem nivoa alfa-interferona, beta-2-mikroglobulina a i smanjenjem nivoa interleukina-2. Kao rezultat disfunkcije imunog sistema, posebno sa smanjenjem broja T-limfocita (CD4) na 400 ili manje ćelija po 1 μl krvi, nastaju uslovi za nekontrolisanu replikaciju HIV-a sa značajnim povećanjem broja viriona. u različitim okruženjima tela. Kao rezultat poraza mnogih dijelova imunološkog sistema, osoba zaražena HIV-om postaje bespomoćna protiv patogena raznih infekcija. U foajeu sve veće imunosupresije razvijaju se teške progresivne bolesti koje se ne javljaju kod osobe s normalno funkcionirajućim imunološkim sistemom. SZO je ove bolesti definisala kao AIDS marker (indikator).
Prva grupa - bolesti koje su svojstvene samo teškoj imunodeficijenciji (nivo CD4 ispod 200). Klinička dijagnoza se postavlja u odsustvu anti-HIV antitela ili HIV antigena.
Druga grupa - bolesti koje se razvijaju i u pozadini teška imunodeficijencija, au nekim slučajevima i bez njega. Stoga je u takvim slučajevima neophodna laboratorijska potvrda dijagnoze.
2. Serološke reakcije koristi se za dijagnosticiranje virusnih infekcija.
Serološke metode, odnosno metode za proučavanje antitijela i antigena primjenom reakcija antigen-antitijelo utvrđenih u krvnom serumu i drugim tekućinama, kao i tjelesnim tkivima. Otkrivanje antitijela protiv antigena patogena u krvnom serumu pacijenta omogućava dijagnosticiranje bolesti. Serološke studije se takođe koriste za identifikaciju mikrobnih antigena, različitih biološki aktivnih supstanci, krvnih grupa, tkivnih i tumorskih antigena, imunih kompleksa, ćelijskih receptora itd. Kada se mikrob izoluje od pacijenta, patogen se identifikuje proučavanjem. antigena svojstva korištenjem imunoloških dijagnostičkih seruma, odnosno krvnih seruma hiperimuniziranih životinja koji sadrže specifična antitijela. To je takozvana serološka identifikacija mikroorganizama. Osobine interakcije antitijela s antigenom su osnova dijagnostičkih reakcija u laboratorijima. In vitro reakcija između antigena i antitijela sastoji se od specifične i nespecifične faze. Brzo specifično vezivanje se javlja u specifičnoj fazi aktivni centar antitela sa determinantom antigena. Zatim dolazi nespecifična faza – sporija, koja se manifestuje vidljivim fizičkim pojavama, kao što je stvaranje ljuskica (fenomen aglutinacije) ili precipitata u vidu zamućenja. Ova faza zahteva određene uslove (elektroliti, optimalni pH medijuma). Vezivanje determinante antigena (epitopa) za aktivno mjesto Fab fragmenta antitijela je posljedica van der Waalsovih sila, vodoničnih veza i hidrofobnih interakcija. Snaga i količina antigena vezanog antitijelima zavise od afiniteta, avidnosti antitijela i njihove valencije.
3. Uzročnici malarije. malarija - antroponotski infekciona zaraza, uzrokovane nekoliko vrsta protozoa iz roda Plasmodium, koje prenose komarci (Anopheles), praćene groznicom, anemijom, povećanjem jetre i slezene. Uzročnici malarije pripadaju protozoama, tipu Apicomplexa, klasi Sporozoa i vrsti Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.
Epidemiologija. Izvor infekcije je zaražena osoba; nosilac je ženka komarca iz roda Anopheles. Glavni mehanizam prijenosa je prenosiv, ubodom zaražene ženke komarca.
Liječenje i prevencija. Antimalarijski lijekovi imaju različite efekte na aseksualne, seksualne faze plazmodija. Glavni lijekovi protiv malarije uključuju kinin, hlorokin, kinakrin, primakin, kvinocid, bigumal, hloridin itd. Preventivne radnje usmjerena na izvor uzročnika (liječenje bolesnika sa malarijom i prenosiocima) i uništavanje nosilaca uzročnika - komaraca. Razvijaju se metode vakcinacije zasnovane na antigenima dobijenim genetskim inženjeringom.
1. Klasifikacija antibiotika prema hemijskoj strukturi, mehanizmu, spektru i vrsti djelovanja.Prema kem. struct. Klasa 1 - B-laktam - penicilin, cefalosporin. 2 klasa - makrolidi - eritromicin, azitromicin. Klasa 3 - aminoglikozidi - streptomicin, kanamicin. Klasa 4 - tetraciklini - oksitetraciklin, doksiciklin. 5 ćelija - polipeptidi - polimiksin. 6 ćelija - polienistatin 7kl-anzamicin-rifampicin .
2. U zavisnosti od mehanizma delovanja razlikuje se pet grupa antibiotika: 1.gr antibiotika koji remete sintezu ćelijskog zida - β-laktama. 2.gr antibiotici koji remete molekularnu organizaciju i sintezu ćelijske membrane- polimiksini, polieni 3.gr antibiotici koji remete sintezu proteina - aminoglikozidi, tetraciklini, makrolidi, hloramfenikol 4.gr antibiotici - inhibitori sinteze nukleinske kiseline- kinoloni remete sintezu DNK, rifampicin - sintezu RNK 5.gr antibiotika koji inhibiraju sintezu purina i aminokiselina - sulfonamida.Po spektru djelovanja antibiotici su pet grupa, u zavisnosti od toga na koje mikroorganizme djeluju. Svaka od ovih grupa uključuje dvije podgrupe: antibiotike širokog i uskog spektra. Antibakterijski antibiotici čine najveću grupu lijekova.
a) antibiotici širok raspon djelovanje utječe na predstavnike sve tri divizije bakterija - aminoglikozide, tetracikline, itd.
b) Antibiotici uskog spektra su efikasni protiv malog spektra bakterija - fly-miksini djeluju na gracilikute, vankomicin djeluje na gram-pozitivne bakterije.
2gr - lijekovi protiv tuberkuloze, protiv lepre, antisifilitički lijekovi.
3. Antifungalni antibiotici.
a) Amfotericin B ima širok spektar delovanja, efikasan kod kandidijaze, blastomikoze, aspergiloze; u isto vrijeme
b) antibiotik uskog spektra - nistatin, koji djeluje na gljivice roda Candida, je
4. Antiprotozoalni i antivirusni antibiotici imaju mali broj lijekova.
5. Antitumorski antibiotici – lijekovi koji imaju citotoksično djelovanje. Većina ih se koristi u mnogim vrstama tumora – mitomicin C. Djelovanje antibiotika na mikroorganizme povezano je s njihovom sposobnošću da potisnu određene biohemijske reakcije koje se dešavaju u mikrobnoj ćeliji.
2. Teorije imuniteta.1. Teorija imuniteta Mečnikov - fagocitoza igra odlučujuću ulogu u antibakterijskom imunitetu. I. I. Mechnikov je prvi koji je upalu smatrao zaštitnim, a ne destruktivnim fenomenom. Naučnik je odbrambene ćelije koje djeluju na ovaj način nazvao "ćelije koje proždiru". Njegove mlade francuske kolege su predložile korištenje grčkih korijena istog značenja. II Mečnikov je prihvatio ovu opciju i pojavio se termin "fagocit". 2. Teorija imuniteta Ehrlich je jedna od prvih teorija stvaranja antitela, prema kojoj ćelije imaju receptore specifične za antigen koji se oslobađaju kao antitela pod dejstvom antigena. Ehrlich je antimikrobne supstance krvi nazvao "antitijelo". P. Ehrlich je shvatio da i prije kontakta sa određenim mikrobom tijelo već ima antitijela u obliku koji je nazvao "bočnim lancima" - to su limfocitni receptori za antigene. Zatim se Ehrlich „primjenio” na farmakologiju: u svojoj teoriji kemoterapije pretpostavio je postojanje receptora u tijelu za lekovite supstance. Godine 1908. nagrađen je P. Erlich nobelova nagrada za humoralnu teoriju imuniteta. 3. Bezredkina teorija imuniteta- teorija koja objašnjava zaštitu organizma od niza zaraznih bolesti pojavom specifičnog lokalnog ćelijskog imuniteta na patogene. 4. Instruktivne teorije imunitet - opšti naziv teorija stvaranja antitijela, prema kojima vodeću ulogu u imunološkom odgovoru ima antigen, koji je direktno uključen kao matrica u formiranje specifične konfiguracije antideterminante ili djeluje kao faktor koji usmjereno mijenja biosintezu imunoglobulina plazma ćelijama.
3. Uzročnik botulizma. rod Clostridium vrsta Clostridium botulinum izaziva botulizam - intoksikaciju hranom, koju karakteriše oštećenje centralnog nervnog sistema. Bolest nastaje kao rezultat konzumiranja hrane koja sadrži toksine C. Botulinum - gram-pozitivne šipke sa zaobljenim krajevima. Oblikovan je kao teniski reket. Nemojte formirati kapsulu. Mobilni. obavezni anaerobi. Prema antigenskim svojstvima se dijele na 7 serovara. Botulinski egzotoksin - najmoćniji od svih bioloških otrova - ima neurotoksični učinak (smrtonosna doza za ljude je oko 0,3 mikrograma). Mikrobiološka dijagnostika. Detekcija i identifikacija botulinum toksina u ispitivanom materijalu pomoću reakcije reverzne indirektne hemaglutinacije (RONHA), reakcije neutralizacije toksina antitoksinom (antitoksični serum) na laboratorijskim životinjama. Bakteriološka metoda za detekciju patogena u ispitivanom materijalu. specifična profilaksa. Botulinski toksoidi A, B, E su dio seksanatoksina, koji se koristi prema indikacijama. Za hitnu pasivnu profilaksu moguća je upotreba anti-botulinum antitoksičnih seruma. Tretman. Koriste se antitoksični anti-botulinum heterologni serumi i homologni imunoglobulini.
uzgoj. Na krvnom agaru formira male prozirne kolonije okružene zonom hemolize. otpor. Spore C. botulinum imaju vrlo visoku otpornost na visoke temperature.
Epidemiologija. Iz tla ulazi bacil botulina prehrambeni proizvodi gdje se umnožava i oslobađa egzotoksin. Put prenošenja infekcije je hrana. Najčešće je konzervirana hrana (pečurke, povrće, meso, riba) faktor prenošenja infekcije. Bolest se ne prenosi sa osobe na osobu. Patogeneza. Botulinski toksin se unosi hranom probavni trakt. Otporan na djelovanje probavnih enzima, toksin se apsorbira kroz crijevni zid u krvotok i uzrokuje dugotrajnu toksemiju. Toksin se veže za nervne ćelije i blokira prenos impulsa kroz njih neuromuskularne sinapse. Kao rezultat toga, razvija se paraliza mišića larinksa, ždrijela, respiratornih mišića, što dovodi do poremećaja gutanja i disanja, uočavaju se promjene u organima vida. kliničku sliku. Period inkubacije traje od 6-24 sata do 2-6 dana. Što je period inkubacije kraći, bolest je teža. Obično bolest počinje akutno, ali tjelesna temperatura ostaje normalna. Moguće su različite varijante botulizma - s prevladavanjem simptoma oštećenja probavnog trakta, smetnje vida ili respiratorne funkcije. U prvom slučaju bolest počinje pojavom suvih usta, mučnine, povraćanja i proljeva. U drugom, prve manifestacije bolesti povezane su s oštećenjem vida (pacijent se žali na "maglu" pred očima i dvostruki vid). Kao rezultat paralize mišića larinksa, pojavljuje se promuklost, a zatim glas nestaje. Pacijenti mogu umrijeti od respiratorne paralize. Bolest se može pogoršati akutna pneumonija, toksični miokarditis, sepsa. Smrtnost od botulizma je 15-30%. Imunitet. nije formirana. Antitijela koja se stvaraju tokom bolesti usmjerena su protiv specifičnog serovara.
1.Metode za određivanje osjetljivosti bakterija na antibiotike. 1) Metoda agar difuzije. Proučavani mikrob se inokulira na agar hranjivu podlogu, a zatim se dodaju antibiotici. preparati se unose ili u posebne jažice u agaru, ili se diskovi sa antibioticima polažu na površinu sjemena („metoda diska“). Rezultati se bilježe za jedan dan prisustvom ili odsustvom mikrobnog rasta oko rupica (diskova). 2) Metode određivanja. minimalni nivo antibiotika, koji omogućava in vitro sprečavanje vidljivog rasta mikroba u hranljivom mediju ili ga potpuno steriliše. A) Određivanje osjetljivosti bakterija na antibiotike metodom diska. Proučavana bakterijska kultura se inokulira travnjakom na hranljivom agaru ili AGV medijumu u Petrijevoj posudi B) AGV medijum: suva hranljiva riblja čorba, agar-agar, disupstituisani natrijum fosfat. C) Papirni diskovi koji sadrže određene doze različitih antibiotika stavljaju se na zasijanu površinu pincetom na istoj udaljenosti jedan od drugog. Kulture se inkubiraju na 37°C do sljedećeg dana. Prema promjeru zona inhibicije rasta ispitivane bakterijske kulture, procjenjuje se njena osjetljivost na antibiotike.
D) Određivanje osetljivosti bakterija na antibiotike metodom serijskih razblaženja. odrediti minimalnu koncentraciju antibiotika koja inhibira rast proučavane bakterijske kulture.
E) Evaluacija rezultata određivanja osjetljivosti mikroorganizama na antibiotike vrši se prema posebno pripremljenoj tabeli, koja sadrži granične vrijednosti prečnika zona inhibicije rasta za rezistentne, srednje rezistentne i osjetljive sojeve, tj. kao i MIC vrijednosti antibiotika za rezistentne i osjetljive sojeve. 3) Određivanje antibiotika u krvi, urinu i drugim tečnostima ljudskog organizma. Dva reda epruveta se stavljaju u stalak. U jednom se pripremaju razblaženja referentnog antibiotika, au drugom test tečnost. Zatim se u svaku epruvetu dodaje suspenzija test bakterija pripremljena u Hiss mediju sa glukozom. Prilikom određivanja penicilina, tetraciklina, eritromicina u tečnosti za ispitivanje, kao test bakterija se koristi standardni soj S. aureus, a za određivanje streptomicina E. coli. Nakon inkubacije inokulacija na 37 °C u trajanju od 18-20 sati, bilježe se rezultati eksperimenta zamućenja podloge i njenog bojenja indikatorom zbog razgradnje glukoze od strane test bakterija. Koncentracija antibiotika se određuje množenjem najvećeg razrjeđenja testne tekućine koja inhibira rast test bakterija s minimalnom koncentracijom referentnog antibiotika koji inhibira rast istih test bakterija. Na primjer, ako je maksimalno razrjeđenje ispitne tekućine koja inhibira rast test bakterija 1:1024, a minimalna koncentracija referentnog antibiotika koji inhibira rast iste test bakterije 0,313 µg/ml, tada je proizvod 1024-0,313=320 µg/ml je koncentracija antibiotika u 1 ml.
4) Određivanje sposobnosti S. aureus da proizvodi beta-laktamazu. U tikvicu sa 0,5 ml dnevne bujonske kulture standardnog soja stafilokoka osjetljivog na penicilin dodati 20 ml rastopljenog i ohlađenog na 45 °C hranjivog agara, promiješati i sipati u Petrijevu posudu. Nakon što se agar stvrdne, disk koji sadrži penicilin stavlja se u sredinu posude na površinu podloge. Ispitivane kulture su posijane po poluprečniku diska sa petljom. Inokulacije se inkubiraju na 37 °C do sljedećeg dana, nakon čega se bilježe rezultati eksperimenta. Sposobnost proučavane bakterije da proizvede beta-laktamazu procjenjuje se prisustvom rasta standardnog soja stafilokoka oko jedne ili druge proučavane kulture (oko diska).
2. Poremećaji imunog sistema: primarne i sekundarne imunodeficijencije.Imunodeficijencije su poremećaji normalnog imunološkog statusa uzrokovani defektom u jednom ili više mehanizama imunološkog odgovora Primarne ili kongenitalne imunodeficijencije Poremećaji imunološkog sistema mogu utjecati na oba glavna specifične veze u funkcionisanju imunog sistema, kao i faktori koji određuju nespecifičnu rezistenciju. Moguće su kombinovane i selektivne varijante imunoloških poremećaja. U zavisnosti od stepena i prirode poremećaja, razlikuju se humoralne, ćelijske i kombinovane imunodeficijencije.
Uzroci: udvostručavanje hromozoma, tačkaste mutacije, defekt enzima metabolizma nukleinskih kiselina, genetski uvjetovani poremećaji membrane, oštećenje genoma u embrionalnom periodu itd. Primarne imunodeficijencije se javljaju u ranim fazama postnatalnog perioda i nasljeđuju se autosomno recesivno. Manifestacije- insuficijencija fagocitoze, sistem komplementa, humoralni imunitet (B-sistem), ćelijski imunitet (T-sistem). Sekundarne ili stečene imunodeficijencije Sekundarne imunodeficijencije, za razliku od primarnih, razvijaju se kod osoba s normalno funkcionirajućim imunološkim sistemom od rođenja. Nastaju pod uticajem okoline na nivou fenotipa i uzrokovane su narušavanjem funkcije imunog sistema kao posledica raznih bolesti ili štetnih efekata na organizam. Pogađaju se T- i B-sistemi imuniteta, faktori nespecifične rezistencije, moguće su i njihove kombinacije. Sekundarne imunodeficijencije su mnogo češće od primarnih. Sekundarne imunodeficijencije podložne su imunokorekciji,
Sekundarne imunodeficijencije mogu biti:
nakon infekcija (posebno virusnih) i invazija (protozoa i helmintiaze);
sa opekotinama;
sa uremijom; sa tumorima;
s metaboličkim poremećajima i iscrpljenošću;
s disbiozom;
at teške povrede, opsežne hirurške operacije, posebno izvedene u opštoj anesteziji; kada su ozračeni, djelovanje hemikalija;
sa starenjem,
lijekovi povezani s uzimanjem lijekova.
Prema kliničkim Protok se razlikuje: 1) kompenzirani, - povećana osjetljivost tijela na infektivne agense. 2) subkompenzirana - hroniizacija infektivnih procesa.
3) dekompenzirane - generalizirane infekcije uzrokovane oportunističkim mikrobima (OPM) i malignim neoplazmama.
3. Uzročnik amebijaze. Taksonomija. Karakteristično. Mikrobiološka dijagnostika. specifičan tretman. Amebijaza je zarazna bolest koju uzrokuje Entamoeba histolytica, praćena ulceroznim lezijama debelog crijeva; moguće stvaranje apscesa u različitim organima; teče hronično. Protozoe, tip Sarcomastidophora, podtip Sarcodina.
Morfologija i uzgoj. Patogen postoji u dvije faze razvoja: vegetativnom i cističnom. Vegetativni stadijum ima nekoliko oblika (tkivni, veliki vegetativni, luminalni i predcistični). Cista (stadij mirovanja) ima ovalni oblik, formira se od vegetativnih oblika u crijevu. Infekcija nastaje kada ciste patogena uđu u crijevo, gdje formiraju crijevne vegetativne oblike.
otpor. Izvan tijela, tkivni i luminalni oblici patogena brzo (nakon 30 minuta) umiru. Ciste su stabilne u okolini, zadržavaju se u fecesu i vodi na temperaturi od 20ºS mjesec dana. U namirnicama, na povrću i voću, ciste traju nekoliko dana.
Mehanizam prijenosa - fekalno-ali-oralno. Do infekcije dolazi kada se ciste unesu hranom, posebno povrćem i voćem, rjeđe vodom, putem kućnih potrepština. Muhe i žohari doprinose širenju cista.
Patogeneza i klinička slika. Ciste koje su ušle u crijeva i oblici ameba koje formira lumen mogu živjeti u njemu bez izazivanja bolesti. Sa smanjenjem otpornosti tijela, amebe prodiru u crijevni zid i razmnožavaju se. U razvoju crijevna amebijaza. Neki predstavnici crijevne mikroflore doprinose ovom procesu. Gornje debelo crijevo je zahvaćeno stvaranjem čira, ponekad i rektum. Postoji česta rijetka stolica. U fecesu se nalaze gnojni elementi i sluz. Može doći do perforacije crevnog zida s razvojem gnojnog peritonitisa. Amebe sa protokom krvi mogu ući u jetru, pluća, mozak - razvija se ekstraintestinalna amebijaza. Možda pojava amebijaze kože, koja se razvija kao rezultat sekundarnog procesa. Na koži perianalne regije, perineuma i zadnjice nastaju erozije i bezbolni čirevi. Imunitet. Kod amebijaze imunitet je nestabilan. Liječenje i prevencija. U liječenju se koriste sljedeći lijekovi: djelovanje na amebe koje se nalaze u lumenu crijeva (derivati oksihinolina - kiniofon, enteroseptol, meksaform, intestopan, kao i jedinjenja arsena - aminarson, osarsol i dr.); djelovanje na tkivne oblike ameba (preparati emetina); djelujući na prozirne oblike amebe i amebe smještene u crijevnom zidu (tetraciklini); djeluju na amebe na bilo kojoj njihovoj lokalizaciji (derivati imidazola - metronidazol). Prevencija amebijaza je povezana s identifikacijom i liječenjem cističnih ekskretora i nosača amebe.
Mikrobiološka dijagnostika. Glavna metoda je mikroskopski pregled izmeta pacijenta, kao i sadržaja apscesa unutrašnjih organa. Razmazi se boje Lugolovom otopinom ili hematoksilinom kako bi se identificirale ciste i trofozoiti. Serološka metoda: RIGA, ELISA, RSK, itd. Najveći titar antitela detektovan je kod ekstraintestinalne amebijaze.
| " |
Laboratorijska dijagnostika
UDK-078
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija
N.N. Nosik, V.M. Stahanov
Institut za virusologiju. DI. Ivanovski RAMS, Moskva
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija
N.N. Nosik, V.M. Stachanova
Uvod
Proširenje mogućnosti u liječenju i prevenciji virusnih bolesti primjenom antivirusnih lijekova, imunomodulatora i vakcina različitih mehanizama djelovanja zahtijeva brzu i tačnu laboratorijsku dijagnostiku. Uska specifičnost nekih antivirusnih lijekova također zahtijeva brzu i visoko specifičnu dijagnozu infektivnog agensa. Postojala je potreba za kvantitativnim metodama za detekciju virusa za praćenje antivirusne terapije. Pored utvrđivanja etiologije bolesti, u organizaciji protivepidemijskih mjera važna je i laboratorijska dijagnostika.
Rana dijagnoza prvih slučajeva epidemijskih infekcija omogućava pravovremeno provođenje protuepidemijskih mjera – karantena, hospitalizacija, vakcinacija itd. Realizacija programa suzbijanja zaraznih bolesti, poput malih boginja, pokazala je da je u njihovoj implementaciji značajna uloga povećava se laboratorijska dijagnostika. Bitnu ulogu igra laboratorijska dijagnostika u službi krvi i akušerska praksa kao što je identifikacija zaraženih donatora virus humane imunodeficijencije(HIV), virus hepatitisa B (HBV), dijagnoza infekcije rubeolom i citomegalovirusom kod trudnica.
Dijagnostičke metode
Postoje tri glavna pristupa laboratorijskoj dijagnostici virusnih infekcija (Tabela 1, Tabela 2):
1) neposredno ispitivanje materijala na prisustvo virusnog antigena ili nukleinskih kiselina;
2) izolaciju i identifikaciju virusa iz kliničkog materijala;
3) serološka dijagnoza, zasnovana na utvrđivanju značajnog porasta virusnih antitela u toku bolesti.
Uz svaki odabrani pristup virusnoj dijagnostici, jedan od najvažnijih faktora je kvaliteta test materijala. Tako, na primjer, za direktnu analizu uzorka ili za izolaciju virusa, testni materijal se mora dobiti na samom početku bolesti, kada se uzročnik još relativno izlučuje. velike količine i još nije vezan antitelima, a volumen uzorka bi trebao biti dovoljan za direktnu analizu. Također je važno odabrati materijal u skladu s navodnom bolešću, odnosno materijal u kojem je, na osnovu patogeneze infekcije, vjerovatnoća prisustva virusa najveća.
Važnu ulogu u uspješnoj dijagnostici igra okruženje u kojem se materijal uzima, kako se transportuje i kako se skladišti. Dakle, nazofaringealni ili rektalni brisevi, sadržaj vezikula se stavlja u podlogu koja sadrži protein koji sprečava brz gubitak infektivnosti virusa (ako je planirana izolacija), ili u odgovarajući pufer (ako se planira rad sa nukleinskim kiselinama). ).
Direktne metode dijagnosticiranja kliničkog materijala
Direktne metode su metode koje omogućavaju otkrivanje virusa, virusnog antigena ili virusa nukleinska kiselina(NC) direktno u kliničkom materijalu, odnosno najbrži su (2-24 sata). Međutim, zbog niza karakteristika patogena, direktne metode imaju svoja ograničenja (mogućnost dobivanja lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata). Stoga često zahtijevaju potvrdu indirektnim metodama.
Elektronska mikroskopija (EM). Koristeći ovu metodu, možete otkriti stvarni virus. Za uspješnu detekciju virusa njegova koncentracija u uzorku treba biti približno 1·10 6 čestica po 1 ml. No, budući da je koncentracija patogena, u pravilu, u materijalu od pacijenata beznačajna, potraga za virusom je teška i zahtijeva njegovu preliminarnu precipitaciju pomoću centrifugiranja velikom brzinom nakon čega slijedi negativno bojenje. Osim toga, EM ne dozvoljava tipizaciju virusa, jer mnogi od njih nemaju morfološke razlike unutar porodice. Na primjer, virusi herpes simpleksa, citomegalovirusa ili herpes zoster virusa se morfološki gotovo ne razlikuju.
Jedna od varijanti EM koja se koristi u dijagnostičke svrhe je imunološka elektronska mikroskopija(IEM), u kojem se koriste specifična antitijela na viruse. Kao rezultat interakcije antitijela s virusima nastaju kompleksi koji se nakon negativnog bojenja lakše otkrivaju.
IEM je nešto osjetljiviji od EM i koristi se kada se virus ne može uzgajati. in vitro, na primjer, kada se traže uzročnici virusnog hepatitisa.
Reakcija imunofluorescencije (RIF). Metoda se zasniva na upotrebi antitijela vezanih za boju, kao što je fluorescein izotiocijanat. RIF se široko koristi za otkrivanje virusnih antigena u materijalu pacijenata i za brzu dijagnozu.
U praksi se koriste dvije varijante RIF-a: ravno i indirektno. U prvom slučaju koriste se bojom označena antitijela na viruse, koja se primjenjuju na inficirane stanice (bris, ćelijska kultura). Dakle, reakcija se odvija u jednom koraku. Nepogodnost metode je potreba za velikim skupom konjugiranih specifičnih seruma za mnoge viruse.
U indirektnoj varijanti RIF-a, na ispitivani materijal se nanosi specifični serum čija se antitela vezuju za virusni antigen prisutan u materijalu, a zatim se serum protiv vrste nanosi slojevima na gama globuline životinje u kojoj pripremljen je specifični imuni serum, na primjer, anti-zečji, anti-konjski itd. Prednost Indirektna varijanta RIF-a sastoji se u potrebi za samo jednom vrstom označenog antitijela.
RIF metoda se široko koristi za brzo dešifriranje etiologije akutnih respiratornih virusnih infekcija u analizi mrlja-otisaka sa sluznice gornjeg respiratornog trakta. Uspješno korištenje RIF-a za direktnu detekciju virusa u kliničkom materijalu moguće je samo ako sadrži dovoljno veliki broj inficiranih stanica i neznatnu kontaminaciju mikroorganizmima koji mogu proizvesti nespecifičnu luminiscenciju.
Enzimski imunotest (ELISA). Metode enzimskog imunoeseja za određivanje virusnih antigena su u principu slične RIF-u, ali se zasnivaju na obeležavanju antitela enzimima, a ne bojama. Najviše se koriste peroksidaza rena i alkalna fosfataza, a koriste se i β-galaktozidaza i β-laktamaze. Obilježena antitijela se vezuju za antigen, a takav kompleks se otkriva dodavanjem supstrata za enzim na koji su antitijela konjugirana. Konačni proizvod reakcije može biti u obliku netopivog taloga, a zatim se brojanje vrši pomoću konvencionalnog svjetlosnog mikroskopa, ili u obliku rastvorljivog proizvoda, koji je obično obojen (ili može fluorescirati ili luminescirati) i snimljeno instrumentalno.
Budući da se rastvorljivi antigeni mogu mjeriti ELISA-om, nema potrebe za intaktnim stanicama u uzorku i stoga se mogu koristiti različite vrste kliničkog materijala.
Još jedna važna prednost ELISA metode je sposobnost kvantifikacije antigena, što joj omogućava da se koristi za procjenu klinički tok bolest i efikasnost hemoterapije. ELISA, kao i RIF, može se koristiti u direktnom i indirektnom obliku.
Najveću distribuciju našla je čvrsta faza ELISA, koja daje rastvorljivi obojeni proizvod reakcije. ELISA se može koristiti kako za određivanje antigena (tada se antitela nanose na čvrstu fazu - dno bunara polistirenske ploče), tako i za određivanje antitela (tada se antigeni primenjuju na čvrstu fazu).
Radioimunotest (RIA) . Metoda se zasniva na obeležavanju antitela radioizotopima, čime se obezbeđuje visoka osetljivost u određivanju virusnog antigena. Metoda je postala široko rasprostranjena 1980-ih, posebno za određivanje markera HBV-a i drugih nekulturnih virusa. Nedostaci metode uključuju potrebu za radom s radioaktivnim tvarima i korištenje skupe opreme (gama brojači).
Molekularne metode. U početku se visoko specifična metoda NA hibridizacije smatrala klasičnom metodom za otkrivanje virusnog genoma, ali sada se izolacija virusnih genoma pomoću lančana reakcija polimeraze(PCR).
Molekularna hibridizacija nukleinskih kiselina. Metoda se zasniva na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNK ili RNK sa formiranjem dvolančanih struktura i njihovom detekcijom pomoću oznake. U tu svrhu koriste se posebne DNK ili RNK sonde, označene izotopom (32 P) ili biotinom, koje detektuju komplementarne niti DNK ili RNK. Postoji nekoliko varijanti metode: - tačkasta hibridizacija - izolovani i denaturisani NA se nanosi na filtere, a zatim se dodaje obeležena sonda; indikacija rezultata - autoradiografija upotrebom 32 R ili bojenje - avidin-biotinom; - blot hibridizacija - metoda za izolaciju fragmenata NA isječenih restrikcijskim endonukleazama iz ukupne DNK i prenesenih u nitrocelulozne filtere i testiranih označenim sondama; koristi se kao potvrdni test za HIV infekciju; – hibridizacija in situ– omogućava određivanje NK u inficiranim ćelijama.
PCR zasnovan na principu prirodne replikacije DNK. Suština metode sastoji se u ponovljenom ponavljanju ciklusa sinteze (amplifikacije) DNK sekvence specifične za virus pomoću termostabilne Taq DNK polimeraze i dva specifična prajmera, tzv.
Svaki ciklus se sastoji od tri faze sa različitim temperaturnim uslovima. U svakom ciklusu, broj kopija sintetizovane regije se udvostručuje. Novosintetizovani fragmenti DNK služe kao šablon za sintezu novih lanaca u sledećem ciklusu amplifikacije, što omogućava da se akumulira dovoljan broj kopija odabranog DNK regiona u 25-35 ciklusa za njegovo određivanje, obično pomoću agaroznog gela. elektroforeza.
Metoda je vrlo specifična i vrlo osjetljiva. Omogućava vam da otkrijete više kopija virusne DNK u materijalu za testiranje. AT poslednjih godina PCR se sve više koristi za dijagnostiku i praćenje virusnih infekcija (virusa hepatitisa, herpesa, citomegalovirusa, papiloma itd.).
Razvijena je varijanta kvantitativnog PCR-a koja omogućava određivanje broja kopija amplificiranog mjesta DNK. Tehnika je složena, skupa i još uvijek nije dovoljno unificirana za rutinsku upotrebu.
citološke metode trenutno imaju ograničenu dijagnostičku vrijednost, ali bi se i dalje trebali koristiti kod brojnih infekcija. Pregledaju se obdukcijski materijali, biopsije, brisevi, koji se nakon odgovarajuće obrade boje i analiziraju pod mikroskopom. Kod infekcije citomegalovirusom, na primjer, u dijelovima tkiva ili u urinu, nalaze se karakteristične divovske stanice - "sovino oko", s bjesnilom - inkluzije u citoplazmi stanica (Babes-Negri tijela). U nekim slučajevima, na primjer, u diferencijalnoj dijagnozi kroničnog hepatitisa, važna je procjena stanja jetrenog tkiva.
Sadržaj predmeta "Metode otkrivanja virusa. Metode dijagnostike mikoza (gljivičnih bolesti). Metode otkrivanja protozoa.":Serološke metode za dijagnosticiranje virusnih infekcija. Inhibicija hemaglutinacije. Inhibicija citopatskog efekta interferencijom virusa. Direktna imunofluorescencija. Imunoelektronska mikroskopija.
Sa većinom virusne infekcije razvijati imunološke reakcije primijenjen na dijagnostika. Ćelijski odgovori se obično procjenjuju testovima citotoksičnosti limfocita protiv infektivnih agenasa ili ciljnih stanica koje su njima inficirane, ili sposobnosti limfocita da odgovore na različite antigene i mitogene. U radu praktičnih laboratorija rijetko se utvrđuje ozbiljnost ćelijskih reakcija. Metode za identifikaciju antivirusnih AT postale su sve raširenije.
RN se zasniva na supresija citopatogenog efekta nakon miješanja virusa sa specifičnim AT. Nepoznati virus se miješa sa poznatim komercijalnim antiserumima i, nakon odgovarajuće inkubacije, unosi u monosloj ćelije. Odsustvo smrti ćelije ukazuje na neslaganje između infektivnog agensa i poznatih antitela.
Inhibicija hemaglutinacije
RTGA se koristi za identifikaciju virusa sposoban da aglutinira različite eritrocite. Da bi se to postiglo, medij kulture koji sadrži patogen se pomiješa s poznatim komercijalnim antiserumom i uvede u ćelijsku kulturu. Nakon inkubacije utvrđuje se sposobnost kulture hemaglutinacije i, u nedostatku iste, zaključuje se o nepodudarnosti virusa sa antiserumom.
Inhibicija citopatskog efekta interferencijom virusa
Reakcija inhibicije citopatskog efekta zbog interferencije virusa koristi se za identifikaciju patogena koji interferira s poznatim citopatogenim virusom u kulturi osjetljivih stanica. Da bi se to postiglo, komercijalni serum (na primjer, virus rubeole ako se sumnja) unosi se u medij kulture koji sadrži virus koji se proučava, inkubira i inficira drugu kulturu; nakon 1-2 dana u njega se unosi poznati citopatogeni virus (na primjer, bilo koji ECHO virus). U prisustvu citopatogenog efekta, zaključuje se da je prva kultura bila inficirana virusom koji odgovara primijenjenom AT.
Direktna imunofluorescencija
Među ostalim testovima, najčešće korišteni direktna reakcija imunofluorescencije(najbrži, najosjetljiviji i ponovljivi). Na primjer, identifikacija CMV-a po njegovom citopatogenom dejstvu zahtijeva najmanje 2-3 sedmice, a kada se koriste obilježena monoklonska antitijela, identifikacija je moguća nakon 24 sata.pregledajte pomoću fluorescentne mikroskopije (omogućava vam da otkrijete prisustvo fluorescencije inficiranih ćelija) .
Imunoelektronska mikroskopija
Imunoelektronska mikroskopija(slično prethodnoj metodi) omogućava identifikaciju različite vrste virusi otkriveni elektronskom mikroskopijom (na primjer, razne vrste herpesvirusa), što se ne može učiniti na osnovu morfoloških karakteristika. Obilježeni antiserumi se koriste umjesto antiseruma za identifikaciju. Različiti putevi AT, ali složenost i visoka cijena metode ograničavaju njenu primjenu.
ZA DIJAGNOSTIKU virusne bolesti primijeniti sledećim metodama:
1) Viroskopski.
2) Imunoelektronska mikroskopija.
3) Virološki.
4) Serološki.
5) Imunofluorescentna.
6) Biološki.
7) Upotreba DNK (RNA) sondi.
8) Lančana reakcija polimeraze.
Reprodukcija (reprodukcija) virusa u ćelijskoj kulturi ocjenjuje se citopatskim efektom (CPE), koji se može otkriti mikroskopski i karakterizira morfološke promjenećelije.
Priroda CPD virusa koristi se i za njihovu detekciju (indikaciju) i za probnu identifikaciju, odnosno određivanje njihove vrste.
Metode otkrivanja virusa:
1) Reakcija hemadsorpcije - zasnovana na sposobnosti površine ćelija u kojima se razmnožavaju da adsorbuje eritrocite - reakcija hemadsorpcije. Da bi se stavio u kulturu ćelija inficiranih virusima, dodaje se suspenzija eritrocita, a nakon nekog vremena kontakta ćelije se ispiru izotoničnom otopinom natrijum hlorida. Prilijepljeni eritrociti ostaju na površini ćelija zahvaćenih virusom.
2) Reakcija hemaglutinacije (RG). Koristi se za otkrivanje virusa u tečnosti kulture ćelijske kulture ili korionalantoskoj ili amnionskoj tečnosti pilećeg embriona.
Serološke metode se mogu koristiti za otkrivanje specifičnih antitijela i virusnih antigena u test materijalu. U te svrhe mogu se koristiti sve poznate serološke reakcije:
1) Reakcija vezivanja komplementa.
2) Reakcija pasivne hemaglutinacije i njene varijante (PHAg, PHAt).
3) Reakcija inhibicije hemaglutinacije.
4) Reakcija hemaglutinacije imunološke adhezije (kompleks antigen + antitelo u prisustvu komplementa se adsorbuje na eritrocite).
5) Reakcije taloženja gela.
6) Reakcije neutralizacije virusa.
7) Radioimuna metoda.
8) Metode enzimski imunotest.
Sve gore navedene metode popularniji Koriste se ELISA metode koje se odlikuju visokom specifičnošću i jednostavnošću upotrebe.
7. Reakcija hemaglutinacije, njen mehanizam u virusima gripa. Reakcija inhibicije hemaglutinacije, njena praktična primjena.
Reakcija hemaglutinacije (RG). Koristi se za otkrivanje virusa u tečnosti kulture ćelijske kulture ili korionalantoskoj ili amnionskoj tečnosti pilećeg embriona.
8. Osobine antivirusnog imuniteta. Uloga fagocitoze i humoralnih faktora u imunitetu. Interferoni, karakteristike glavnih svojstava, klasifikacija. Osobine djelovanja interferona na viruse .
Svi imuni sistemi su uključeni u zaštitu organizma od virusa, ali antivirusni imunitet ima značajne specifičnosti. One su određene činjenicom da, prije svega, na prodor virusa u tijelo ne reagiraju sistemi komplementa i makrofaga, već sistemi interferona i T-ćelija ubica. Još jedna karakteristika formiranja imuniteta je zbog činjenice da virusi imaju slab antigenski učinak na B-limfocite, a za njihovu aktivaciju, proliferaciju i diferencijaciju sudjeluju T-pomagači i, shodno tome, predstavljanje prerađenog virusnog antigena. (peptidni fragmenti) uz učešće molekula MHC klase II. Stoga, uloga makrofaga i drugih ćelija koje predstavljaju antigen nije toliko u samoj fagocitozi, već u procesuiranju i prezentaciji antigena.
Sistem interferona, koji potiskuju intracelularnu reprodukciju virusa, prije svega reagira na prodor virusa. Osim toga, a- i b-inhibitori u krvnom serumu imaju antivirusno djelovanje. Alfa-inhibitor - termostabilan supstrat, dio je a-globulina, sprječava adsorpciju virusa na ćeliju, uništava ga neuraminidaza orto- i paramiksovirusa. Beta-inhibitor - termolabilni mukopeptid, dio je b-globulina, inhibira umnožavanje orto- i paramiksovirusa.
Međutim, interferoni i inhibitori nisu bili dovoljni za zaštitu od virusa, pa je priroda stvorila još jedan, vrlo moćan odbrambeni mehanizam na nivou tijela od virusa. Predstavljeno je prvenstveno T-citotoksični limfociti i druge ćelije ubice. Ove ćelije prepoznaju sve strane antigene, uključujući i virusne, predstavljene molekulima MHC klase I. biološki značaj T-ćelije ubice i sastoji se u otkrivanju i uništavanju bilo koje stanice inficirane stranim antigenima.
Interferon je porodica glikoproteina koje sintetišu ćelije imunog sistema i vezivno tkivo. U zavisnosti od toga koje ćelije sintetišu interferon, postoje tri tipa: ?, ? i?-interferoni.
Alfa-interferon proizvode leukociti i naziva se leukocit; beta-interferon se naziva fibroblastnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - ćelije vezivnog tkiva, a gama-interferon se naziva imunim, jer ga proizvode aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodni ubice, odnosno imune ćelije.
Proizvodnja interferona se naglo povećava kada se inficira virusima, osim antivirusnog djelovanja, interferon ima i antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (razmnožavanje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodni ubice, reguliše stvaranje antitijela. B ćelijama, aktivirajući ekspresiju glavnog kompleksa histokompatibilnosti.
Mehanizam djelovanja. Interferon ne djeluje direktno na virus izvan ćelije, već se vezuje za posebne ćelijske receptore i utiče na proces reprodukcije virusa unutar ćelije u fazi sinteze proteina.
Privatna virusologija
1. Virusi koji uzrokuju akutne respiratorne infekcije (ARI). Klasifikacija. opšte karakteristike ortomiksovirusi. Struktura viriona gripe. Karakteristike njegovog genoma i implementacija informacija sadržanih u njemu. Replikacija virionske RNK.
1. Virusi - uzročnici akutnih respiratornih infekcija. klasifikacija.
Uzročnici ARI su sljedeći virusi:
1. Virusi gripe A, B, C (Orthomyxoviridae)
2. Paramiksovirusi (Paramyxoviridae) - ova porodica uključuje tri roda: paramiksovirus - virusi humane parainfluence (HPV) tipovi 1, 2, 3, 4, Newcastle bolest, ptičja parainfluenca i zaušnjaci; Pneumovirus - respiratorni sincicijski virus (RS-virus); Morbilivirus je virus malih boginja.
3. Respiratorni koronavirusi (Coronaviridae).
4. Respiratorni reovirusi (Reoviridae).
5. Picornavirusi (Picornaviridae).
Virus gripa A
Virion ima sferni oblik i prečnik od 80-120 nm. Genom virusa je predstavljen jednolančanom fragmentiranom (8 fragmenata) negativnom RNK sa ukupnim MW od 5 MD. Tip simetrije nukleokapsida je spiralni. Virion Ima superkapsid (membranu) koji sadrži dva glikoproteina - hemaglutinin i neuraminidazu, koji strše iznad membrane u obliku raznih šiljaka.
Virusi su uzročnici akutnih respiratornih bolesti. Osobine manifestacije bolesti uzrokovanih virusima gripe, parainfluence, rinovirusima, respiratornim sincicijskim virusom i adenovirusima. Laboratorijske metode njihova dijagnoza.
Virion ima sferni oblik i prečnik od 80-120 nm. Genom virusa je predstavljen jednolančanom fragmentiranom (8 fragmenata) negativnom RNK sa ukupnim MW od 5 MD. Tip simetrije nukleokapsida je spiralni. Virion ima superkapsid (membranu) koji sadrži dva glikoproteina - hemaglutinin i neuraminidazu, koji strše iznad membrane u obliku raznih šiljaka.
U virusima influence A ljudi, sisara i ptica pronađeno je 13 tipova hemaglutinina koji se razlikuju po antigenu, kojima je dodijeljena kontinuirana numeracija (od H1 do H13).
Neuraminidaza (N) je tetramer sa MW 200-250 kD, svaki monomer ima MW 50-60 kD.
Virus gripa A ima 10 različitih varijanti neuraminidaze
Laboratorijska dijagnostika. Materijal za studiju je iscjedak iz nazofarinksa, koji se dobiva ispiranjem ili korištenjem štapića od pamučne gaze i krvi. Koriste se sljedeće dijagnostičke metode:
1. Virološki - infekcija pilećih embriona, kultura ćelija bubrega zelenih majmuna (Vero) i pasa (MDSC). Ćelijske kulture su posebno efikasne za izolaciju A (H3N2) i B virusa.
2. Serološki - detekcija specifičnih antitela i povećanje njihovog titra (u parnim serumima) korišćenjem RTGA, RSK, enzimskog imunoeseja.
3. Kao ubrzana dijagnoza koristi se imunofluorescentna metoda koja omogućava brzo otkrivanje virusnog antigena u brisevima-otiscima sa nazalne sluznice ili u brisevima iz nazofarinksa pacijenata.
4. Za detekciju i identifikaciju virusa (virusni antigeni), predložene su metode RNA sonde i PCR.
Specifična profilaksa
1) živi od atenuiranog virusa; 2) ubijen cijeli virion; 3) subvirion vakcina (od podeljenih viriona); 4) podjedinična vakcina koja sadrži samo hemaglutinin i neuraminidazu.
Virusi gripe (ortomiksovirusi). Opće karakteristike. Superkapsidni proteini, njihove funkcije, značaj varijabilnosti (pomaka i drifta) za epidemiologiju gripe. Metode laboratorijska dijagnostika. Vakcine koje se koriste za prevenciju gripe.
Akutna zarazna bolest, sa temperaturom, oštećenjem jetre. Antroponoza.
Taksonomija, morfologija, antigenska struktura: Familija Picornaviridae, rod Hepatovirus. Tipska vrsta ima jedan serotip. To je virus koji sadrži RNK, jednostavno organiziran, ima jedan virus specifičan antigen.
Uzgoj: Virus se uzgaja u ćelijskim kulturama. Reprodukcijski ciklus je duži nego kod enterovirusa, citopatski učinak nije izražen.
Otpornost: Otporan na toplotu; inaktivira se kuhanjem 5 min. relativno stabilan u spoljašnje okruženje(voda).
Epidemiologija. Izvor su pacijenti. Mehanizam infekcije je fekalno-oralni. Virusi se na početku izlučuju fecesom kliničke manifestacije. Pojavom žutice smanjuje se intenzitet izolacije virusa. Virusi se prenose vodom, hranom, rukama.
Uglavnom su oboljela djeca uzrasta od 4 do 15 godina.
Mikrobiološka dijagnostika. Materijal za ispitivanje su serum i feces. Dijagnoza se uglavnom zasniva na određivanju IgM u krvi pomoću ELISA, RIA i imunološke elektronske mikroskopije. Iste metode mogu otkriti virusni antigen u fecesu. Virološko testiranje se ne provodi.
3. Virološka dijagnoza gripe. Izolacija virusa, određivanje njegovog tipa. Serološke metode za dijagnosticiranje gripa: RSK, RTGA. Ubrzana dijagnostička metoda koja koristi fluorescentna antitijela.
Mikrobiološka dijagnostika. Dijagnoza "influenca" zasniva se na (1) izolaciji i identifikaciji virusa, (2) određivanju virusnih antigena u ćelijama pacijenta, (3) potrazi za antitijelima specifičnim za virus u serumu pacijenta. Prilikom odabira materijala za istraživanje važno je dobiti ćelije zahvaćene virusom, jer se u njima događa replikacija virusa. Materijal za istraživanje - nazofaringealni iscjedak. Da bi se odredila antitijela, ispituju se upareni krvni serumi pacijenta.
Ekspresna dijagnostika. Virusni antigeni se detektuju u test materijalu pomoću RIF-a (direktne i indirektne opcije) i ELISA. Genom virusa može se otkriti u materijalu pomoću PCR-a.
Virološka metoda. Optimalni laboratorijski model za uzgoj sojeva je pileći embrion. Indikacija virusa se vrši u zavisnosti od laboratorijskog modela (smrti, kliničkim i patomorfološkim promenama, CPP, formiranjem "plakova", "uzorak boje", RHA i hemadsorpcijom). Virusi se identificiraju po njihovoj antigenskoj strukturi. Koriste se RSK, RTGA, ELISA, RBN (reakcija biološke neutralizacije) virusa itd. Obično se tip virusa gripa određuje u RSK, a podtip u RTGA.
Serološka metoda. Dijagnoza se postavlja četvorostrukim povećanjem titra antitela u parnim serumima pacijenta, dobijenim u intervalima od 10 dana. Primijeniti RTGA, RSK, ELISA, RBN viruse.
Adenovirusi, karakteristike svojstava, sastav grupe. Adenovirusi patogeni za ljude. Karakteristike patogeneze adenovirusne infekcije, metode uzgoja adenovirusa. Dijagnoza adenovirusnih bolesti.
Porodica Adenoviridae podijeljena je u dva roda: Mastadenovirus - adenovirusi sisara, uključuje ljudske adenoviruse (41 serovarijante), majmune (24 serovarijante), kao i velike goveda, konji, ovce, svinje, psi, miševi, vodozemci; i Aviadenovirus - ptičji adenovirusi (9 serotipova).
Adenovirusima nedostaje superkapsid. Virion ima oblik ikosaedra - kubičnog tipa simetrije, njegov promjer je 70-90 nm. Kapsida se sastoji od 252 kapsomera prečnika 7-9 nm.
Virion sadrži najmanje 7 antigena. Period inkubacije je 6-9 dana. Virus se replicira unutra epitelne ćelije gornji respiratorni trakt, sluzokože očiju. Može prodrijeti u pluća, utjecati na bronhije i alveole, uzrokovati tešku upalu pluća; karakteristično biološko svojstvo adenovirusa je tropizam za limfoidno tkivo.
Adenovirusne bolesti se mogu okarakterisati kao febrilne sa kataralna upala sluzokože respiratornog trakta i očiju, praćeno povećanjem submukoznog limfoidnog tkiva i regionalnih limfnih čvorova.
Laboratorijska dijagnostika. 1. Detekcija virusnih antigena u zahvaćenim ćelijama pomoću imunofluorescencije ili IFM metoda. 2. Izolacija virusa. Materijal za studiju je iscjedak iz nazofarinksa i konjunktive, krv, izmet (virus se može izolirati ne samo na početku bolesti, već i na 7-14. dan). Za izolaciju virusa koriste se primarne tripsinizirane ćelijske kulture (uključujući i diploidne) ljudskog embrija koje su osjetljive na sve serovarijante adenovirusa. Virusi se otkrivaju po njihovom citopatskom efektu i CSC, budući da svi dijele zajednički antigen za fiksiranje komplementa. Identifikacija se provodi tip-specifičnim antigenima korištenjem RTGA i pH u ćelijskoj kulturi. 3. Detekcija povećanja titra antitela u parnim serumima pacijenta koji koristi RSC. Određivanje porasta titra tip-specifičnih antitijela provodi se sa referentnim serosojevima adenovirusa u RTGA ili RN u ćelijskoj kulturi.
5. Coxsackie i ECHO virusi. Karakterizacija njihovih svojstava. Sastav grupa. Metode mikrobiološka dijagnostika bolesti uzrokovane virusima Coxsackie i ECHO.
Coxsackie su najkardiotropniji od svih enterovirusa. Kod 20-40% pacijenata mlađih od 20 godina Coxsackie infekcija je komplikovana miokarditisom. Coxsackie virusi su predstavljeni u dvije grupe: Coxsackie A grupa uključuje 23 serovarijante (A1-A22, 24); Coxsackie B grupa uključuje 6 serovarijanti (B1-B6).
Virusi Coxsackie A i B kod ljudi mogu, pored bolesti nalik poliomijelitisu, ponekad praćene paralizom, izazvati i razne druge bolesti sa posebnom klinikom: aseptični meningitis, epidemijsku mijalgiju (Bornholmova bolest), herpanginu, lakša bolest, gastroenteritis, akutni respiratorne bolesti, miokarditis
ECHO, što znači: E - enterički; C - citopatogena; H - ljudski; O - siroče - siroče. sadrži 32 serotipa.
Izvor Coxsackie- i ECHO-infekcija je osoba. Infekcija virusima Nastaje fekalno-oralnim putem.
Patogeneza bolesti uzrokovanih Coxsackie i ECHO virusima slična je patogenezi poliomijelitisa. Ulazna kapija su sluznica nosa, ždrijela, tanko crijevo, u čijim epitelnim ćelijama, kao i u limfoidnom tkivu, ovi virusi se razmnožavaju.
Afinitet za limfoidno tkivo je jedan od karakteristične karakteristike ovih virusa. Nakon razmnožavanja, virusi prodiru u limfu, a zatim u krv, uzrokujući viremiju i generalizaciju infekcije.
Jednom u krvotoku, virusi se hematogeno šire po cijelom tijelu, selektivno se naseljavajući u onim organima i tkivima za koje imaju tropizam.
Metode za dijagnosticiranje enterovirusnih bolesti. koristiti virusološka metoda i razne serološke reakcije. studija se mora provesti na cijeloj grupi enterovirusa. Za njihovu izolaciju koristi se crijevni sadržaj, ispiranje i razmaz iz grla, rjeđe likvor ili krv, a u slučaju smrti bolesnika komadići tkiva iz raznih organa. Ćelijske kulture (poliovirusi, ECHO, Coxsackie B i neki serovari Coxsackie A), kao i novorođeni miševi (Coxsackie A) su inficirani test materijalom.
Tipizacija izolovanih virusa se vrši u reakcijama neutralizacije, RTGA, RSK, precipitacijskim reakcijama, koristeći referentne smjese seruma različitih kombinacija. Za otkrivanje antitijela u ljudskim serumima enterovirusne infekcije koristiti iste serološke testove (RN, kolor testovi, RTGA, RSK, precipitacijske reakcije), ali je za ove svrhe potrebno imati uparene serume od svakog pacijenta (u akutnom periodu i nakon 2-3 sedmice od početka bolesti ). Reakcije se smatraju pozitivnim kada se titar antitijela poveća za najmanje 4 puta. Ove dvije metode također koriste IFM (za otkrivanje antitijela ili antigena).
Hepatitis B. Struktura i karakteristike glavnih svojstava viriona. Površinski antigen, njegovo značenje. Značajke interakcije virusa sa ćelijom. Načini infekcije. Metode laboratorijske dijagnostike. specifična profilaksa.
Virus hepatitisa B, HBV Virion sadrži tri glavna antigena
1. HBsAg - površinski (superficial), ili soluble (soluble), ili australijski antigen.
2. HBcAg - core antigen (cog-antigen).
3. HBeAg - antigen e, lokalizovan u jezgru viriona
Stvarni virion - čestica Dane - ima sferni oblik i prečnik od 42 nm. Superkapsid viriona sastoji se od tri proteina: glavnog (glavnog), velikog i srednjeg (slika 88.1). Genom je zatvoren u kapsidu i predstavljen je dvolančanom kružnom DNK sa m.m. od 1,6 MD. DNK se sastoji od približno 3200 nukleotida, ali njen "plus" lanac je 20-50% kraći od "minus" lanca.
Površinski antigen – HBsAg – postoji u obliku tri morfološki različite varijante: 1) predstavlja superkapsid celog viriona; 2) javlja se u velikim količinama u obliku čestica prečnika 20 nm, sfernog oblika; 3) u obliku niti dužine 230 nm. Hemijski su identični. HBsAg sadrži jedan zajednički antigen a i dva para međusobno isključivih tip-specifičnih determinanti: d/y i w/r, tako da postoje četiri glavna podtipa HBsAg (i, prema tome, HBV): adw, adr, ayw i ayr. Antigen a obezbeđuje formiranje opšte unakrsne imunosti na sve podtipove virusa.
Proteini koji formiraju površinski antigen postoje u glikozilovanim (gp) i neglikoziliranim oblicima. Gp27, gp33, gp36 i gp42 su glikozilirani (brojevi označavaju m.m. u CD-u). HBV superkapsid se sastoji od glavnog, ili glavnog, S-proteina (92%); srednji M-protein (4%) i veliki ili dugi L-protein (1%).
Glavni protein - p24/gp27, Veliki protein - p39/gp42, Srednji protein - gp33/gp36.
interakcija sa ćelijom.
1. Adsorpcija na ćeliji.
2. Penetracija u ćeliju pomoću mehanizma receptorom posredovane endocitoze (obložena jama -> obrubljena vezikula -> lizozom -> oslobađanje nukleokapsida i penetracija virusnog genoma u jezgro hepatocita).
3. Intracelularna reprodukcija.
Izvor infekcije virusom hepatitisa B je samo osoba. Infekcija se javlja ne samo parenteralnim putem, ali i seksualne i vertikalne (od majke do fetusa)
Trenutno, glavna metoda za dijagnosticiranje hepatitisa B je korištenje reverzne pasivne hemaglutinacije (RPHA) za otkrivanje virusa ili njegovog površinskog antigena, HBsAg. Kao što je već napomenuto, krv sadrži višestruko više površinskog antigena od samog virusa (100-1000 puta). Za ROPHA reakciju koriste se eritrociti senzibilizirani antitijelima protiv virusa hepatitisa B. U prisustvu antigena u krvi dolazi do reakcije hemaglutinacije. Za otkrivanje antitijela na virusni antigen HBsAg, različita imunološke metode(RSK, RPGA, IFM, RIM, itd.)
Specifična profilaksa
Vakcinacija protiv hepatitisa B je obavezna i treba je dati u prvoj godini života. Za vakcinaciju su predložene dvije vrste vakcina. Za pripremu jednog od njih, kao sirovina koristi se plazma nosača virusa, jer sadrži virusni antigen u količinama dovoljnim za pripremu vakcine. Glavni uslov za pripremu ove vrste vakcine je njihova potpuna bezbednost.Za proizvodnju druge vrste vakcine koriste se metode genetski inženjering Konkretno, da bi se dobio antigenski materijal, koristi se rekombinantni klon kvasca koji proizvodi površinski antigen virusa hepatitisa B.
U Rusiji su stvorene vakcine kako za odrasle tako i za novorođenčad i djecu rane godine. Kompletan kurs vakcinacije sastoji se od tri injekcije:
I doza - odmah nakon rođenja; II doza - nakon 1-2 mjeseca; III doza - do kraja 1. godine života.