ev » insan anatomisi » Virolojik araştırmanın ana aşamaları. “Özel tıbbi viroloji. Dolaylı virolojik araştırma yöntemleri

Virolojik araştırmanın ana aşamaları. “Özel tıbbi viroloji. Dolaylı virolojik araştırma yöntemleri

Akut barsak enfeksiyonlarının teşhisi, zorunlu laboratuvar onayı ile birlikte klinik ve epidemiyolojik verilere dayanılarak konur. Laboratuvar onayı olmadan, akut bağırsak enfeksiyonlarının teşhisi yalnızca açıkça belirlenmiş epidemiyolojik verilerin olduğu durumlarda yapılabilir (enfeksiyon odaklarında ve çoğu hastada laboratuvarda deşifre edilmiş grup hastalık salgınlarında).

Kesin tanı için bakteriyolojik, virolojik ve serolojik araştırma yöntemleri kullanılır, koprolojik yöntem ve sigmoidoskopi (shigellosis için) sonuçları ikincil öneme sahiptir.

ben. bakteriyolojik yöntem bakteriyel floranın neden olduğu AII'de (invaziv ve sekretuar diyare) büyük önem taşır. En iyi sonuçlar, antibiyotik tedavisinin atanmasından önce ve numune alma anından itibaren ilk iki saat içinde bakteriyolojik laboratuvara teslim edilmesiyle doğrudan hastanın yatağının yanına dışkı ekilerek elde edilir. Çalışma için, kan değil, patolojik safsızlıklar içeren parçacıkların seçilmesi gerekir. Biyomateryal, Ploskirev, Levin ve diğerlerinin seçici ortamlarına ekilir. AII'nin tipik klinik belirtilerinin varlığında bile pozitif sonuçların sıklığı (patojenin aşılanması ve tanımlanması). %70-80'i geçmez.

III. serolojik yöntemler teşhis, kural olarak, şüpheli durumlarda ve dışkı bakteriyolojik incelemesinin olumsuz sonuçlarıyla kullanılır. İlk aylardaki çocuklarda yaşam, bilgilendirici değildir, ancak her durumda, antikor titresindeki 4 kat veya daha fazla artış önemlidir. İki yönde gerçekleştirilirler - hastanın kan serumundaki spesifik antikorların titresinin ve dışkıdaki antijenin belirlenmesi.

Spesifik antikorların titresini belirlemek için genellikle RNHA, daha az sıklıkla RPHA veya RA kullanılır. Antijen olarak, günlük bir bakteri kültürünün (RA) veya bir eritrosit diagnostik süspansiyonu alınır. ( RPGA, RNGA). Hastalığın dinamiklerinde antikor titrelerindeki artışın daha güvenilir olduğu düşünülmelidir. AII'li bir hastanın kanında spesifik antikorlar hastalığın 3-5. gününde ortaya çıkar ve 2-3 hafta içinde maksimuma çıkar ve sonra yavaş yavaş azalır. Küçük çocuklarda, özellikle hastalık öncesi geçmişi değişmiş olanlarda, kanda spesifik antikorlar saptanmaz veya düşük titrelere sahiptir (1:50 - 1:100).

Tipik klinik semptomların varlığında ve spesifik antikorların (1:200) ve ilgili teşhis ile daha yüksek bir teşhis titresinin saptanması veya hastalığın dinamiklerinde titrelerinde bir artış olması durumunda, bağırsak enfeksiyonunun klinik teşhisi yapılmalıdır. patojenin hastanın dışkısından tohumlanmadığı durumlarda bile yerleşik olarak kabul edilmelidir.

III. Hızlı teşhis yöntemleri Bağırsak enfeksiyonları, doğrudan ışıldayan antikor yönteminin (PMLA) veya immünoadsorpsiyon yöntemi - kömür aglomerasyon reaksiyonunun (RCA) kullanıldığı dışkıdan patojen antijenin (bakteri veya virüs) saptanmasına dayanır. ön sonuç 2-3 saatte, sonuncusu ise bir günde alınabilir. Yöntemin özgüllüğü %82-94,6'dır.

AT son yıllar ishalin hızlı teşhisi için enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) ve lateks aglütinasyon (RLA) kullanılır.

Viral ishalin etiyolojik deşifresi, virolojik ve bakteriyolojik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.

Dışkıda virüslerin tespiti için en uygun süre, patojen genellikle daha uzun süre devam etmesine rağmen, 1 ila 4 günlük hastalık olarak kabul edilir.

Kullanılan ana yöntem, izin veren elektron mikroskobu yöntemidir. morfolojik özellikler Gastroenterite neden olan çok çeşitli viral ajanları tanımlar.

İmmünoelektron mikroskobu da kullanılır (viral parçacıkların homolog serumlar veya iyileşmiş serumlar varlığında immünoglobülinlerle rotavirüs parçacıkları kümeleri oluşturma yeteneğine dayanır.

Serodiyagnostik yöntemleri arasında geleneksel olanlar nötralizasyon reaksiyonunu, hemaglütinasyonun inhibisyonunu, kompleman fiksasyonunu içerir Eşleştirilmiş serumlarda antikorlarda iki ila dört kat artış, tanı için geriye dönük bir değere sahiptir. rotavirüs enfeksiyonu. ELISA, yaygın çökeltme, lateks aglütinasyon, pıhtılaşma reaksiyonu rotavirüsleri veya antijenlerini saptamak için kullanılır.

Pratik çalışmada, IFA en geniş yeri aldı – yardımcı filtrelerde rotavirüs antijenlerinin izolasyonu. Bu yöntemleri dinamik olarak (hastaneye yatışın ilk günü ve klinik iyileşmeden sonra) kullanmak daha iyidir.

AII'nin bakteriyel etiyolojisini dışlamak için, besin ortamına aşılama yoluyla dışkının bakteriyolojik bir çalışması da gerçekleştirilir.

sigmoidoskopi yöntem, çocuklarda nadiren, esas olarak uzun süreli bakteri atılımının nedenini belirlemek ve hastalığın uzun süreli ve kronik formlarının teşhisini belirlemek için kullanılır. Bu inceleme yöntemi, yalnızca mukoza zarlarındaki morfolojik değişikliklerin doğasını değerlendirmeye izin verir. uzak ancak bağırsak enfeksiyonunun etiyolojik tanısını yapmak için kullanılamaz.

Enstrümantal muayene endikasyonları (ultrason, organların röntgen muayenesi) karın boşluğu, FGS) AII ile karın organlarının cerrahi hastalıkları (invajinasyon, apandisit), somatik hastalıklar (gastrit, peptik ülser, kolesistopankreatit, vb.) ve gastrointestinal sistemin fonksiyonel bozuklukları ile ayırıcı tanı ihtiyacıdır.

Çocuklarda enfeksiyöz ishalde toksikozun klinik formunun (nörotoksikoz, ekzikozlu toksikoz, TSS), derecesinin (evresi), dehidratasyon tipinin ve acil bakımın belirlenmesi

virüslerin biyolojisini ve tanımlanmasını incelemek için yöntemler. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nasıl nüfuz ettiklerini ve virüslerin üreme özelliklerini, viralin birincil yapısını belirlemenin mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. nükleik asitler ve proteinler. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerin kurucu elementlerinin dizisini belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve bunlar tarafından kodlanan proteinlerin fonksiyonlarını nükleotit sekansı ile ilişkilendirmek ve viral bir enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.

Virolojik araştırma yöntemleri aynı zamanda immünolojik süreçler(antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özellikleri (hemaglütine olma yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özellikleri (sitopatik etkinin doğası, hücre içi inklüzyonların oluşumu vb.) .).

Viral enfeksiyonların tanısında, virüslerin kültürlenmesi, izolasyonu ve tanımlanmasında, ayrıca aşı preparasyonlarının hazırlanmasında doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, kararlı sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokunun proteolitik enzimlerle (tripsin, kollajenaz) dağıtılmasıyla elde edilir. Hücrelerin kaynağı, insan ve hayvan embriyolarının dokuları ve organları (çoğunlukla böbrekler) olabilir. Besleyici bir ortamdaki hücrelerin bir süspansiyonu, kabın yüzeyine bağlandıktan sonra hücrelerin çoğalmaya başladığı sözde yataklara, şişelere veya Petri kaplarına yerleştirilir. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek tabakası kullanılır. Besleyici sıvı boşaltılır, viral süspansiyon belirli dilüsyonlarda verilir ve hücrelerle temas ettikten sonra, genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.

Çoğu birincil kültürden alınan hücreler alt kültürlenebilir ve ikincil kültürler olarak anılır. Hücrelerin daha fazla pasajı ile, hızlı üreme yeteneğine sahip bir fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. çoğu orijinal kromozom setini koruyan. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri kültivasyonunda stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid bir kromozom seti ile hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre çizgileri, tek tabakalı ve süspansiyon olabilir. Tek tabakalı kültürler cam yüzey üzerinde sürekli bir tabaka şeklinde büyürken, süspansiyon kültürleri cam yüzeyinde süspansiyon şeklinde gelişir. çeşitli gemiler karıştırıcılar kullanarak. 40'tan türetilmiş 400'den fazla hücre dizisi vardır. Çeşitli türler hayvanlar (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlar.

yapay olarak besin ortamı parçalar yetiştirilebilir bireysel organlar ve dokular (organ kültürleri). Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde üremeyen virüslerin (örneğin koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

enfekte hücre kültürleri virüsler, hücre morfolojisindeki bir değişiklikle, spesifik olabilen sitopatik etkiyle, inklüzyonların görünümüyle, hücrede ve kültür sıvısında viral antijenlerin belirlenmesiyle saptanabilir; kültür sıvısında viral progeninin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültürü, civciv embriyoları veya hassas hayvanlarda virüslerin titrasyonu; moleküler hibridizasyon yoluyla hücrelerdeki bireysel viral nükleik asitleri veya floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle nükleik asit kümelerini saptayarak.

Virüslerin izolasyonu zahmetli ve uzun bir süreçtir. Popülasyonda dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek için yapılır (örneğin, influenza virüsünün serovaryanını, vahşi veya aşı suşuçocuk felci virüsü vb.); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya varyantları ortaya çıktığında; gerekirse ön teşhisi onaylayın; nesnelerdeki virüsleri belirtmek için çevre. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalıcı olma olasılıklarının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun meydana gelme olasılığı dikkate alınır. Tek bir viriondan elde edilen bir virüsün genetik olarak homojen bir popülasyonuna viral klon denir ve bunu elde etme işlemine klonlama denir.

Virüsleri izole etmek için, duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu, tavuk embriyoları kullanılır, ancak çoğunlukla doku kültürü kullanılır. Virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu ile belirlenir ( sitopatik etki), simplastların ve sinsitinin oluşumu, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorpsiyon, hemaglütinasyon (hemaglutinasyon yapan virüslerde) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen. Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebilir.

İnfluenza virüsleri gibi bir takım virüslerin izolasyonu için tavuk embriyoları, bazı Coxsackie virüslerinin ve bir takım arbovirüslerin izolasyonu için yeni doğmuş fareler kullanılmaktadır. İzole edilmiş virüslerin tanımlanması, kullanılarak gerçekleştirilir. serolojik reaksiyonlar ve diğer yöntemler.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle, doku dejenerasyonunun meydana geldiği, inklüzyonların ve virüse özgü antijenlerin oluştuğu virüs içeren sıvının en yüksek dilüsyonunu belirleyen doku kültüründe gerçekleştirilir. Plak yöntemi, bir dizi virüsü titre etmek için kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplama altında tek katmanlı bir doku kültürünün virüs tarafından yok edilmiş hücrelerinin odaklarıdır. Koloni sayımı sağlar kantitatif analiz virüsün enfeksiyöz bir partikülünün bir plak oluşturması temelinde virüslerin enfeksiyöz aktivitesi. Plaklar, kültürün hayati boyalarla, genellikle nötr kırmızıyla boyanmasıyla tanımlanır; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planına karşı hafif noktalar olarak görünür. Virüsün titresi, 1'deki plak oluşturan birimlerin sayısı olarak ifade edilir. ml.

Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlarında santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değiştirme kromatografisi, immünosorbentler vb.

Viral enfeksiyonların laboratuvar teşhisi, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin saptanmasını; bu malzemeden virüs izolasyonu; serodiagnoz. Her bir durumda laboratuvar teşhis yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Modern teşhis viral enfeksiyonlar, klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra yanıt almanızı sağlayan ekspres yöntemlere dayanmaktadır. erken tarihler hastalıktan sonra, Bunlar, elektron ve immün elektron mikroskobunun yanı sıra immünofloresan, moleküler hibridizasyon yöntemi, IgM sınıfı antikorların saptanması vb.

Negatif boyanan virüslerin elektron mikroskobu, virüslerin ayırt edilmesini ve konsantrasyonlarının belirlenmesini sağlar. Viral enfeksiyonların teşhisinde elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun yeterince yüksek olduğu (105'te 10) vakalarla sınırlıdır. ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı, aynı taksonomik gruba ait virüsleri ayırt edememesidir. Bu dezavantaj, immün elektron mikroskobu kullanılarak ortadan kaldırılır. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklendiğinde immün komplekslerin oluşumuna dayanırken, aynı anda viral partiküllerin konsantrasyonu meydana gelir ve bu da onları tanımlamayı mümkün kılar. Yöntem ayrıca antikorları tespit etmek için de kullanılır. Hızlı teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, vezikül sıvılarının ve nazofarenks sırlarının elektron mikroskobik incelemesi yapılır. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılır; yetenekleri, etiketli antikorların kullanımıyla genişletilir.

Virüse özgü nükleik asitlerin saptanmasına dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının saptanmasını mümkün kılar ve duyarlılık açısından eşi benzeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA sarmallarının (problar) hibridizasyonuna ve çift sarmallı yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob, klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncülerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı ümit vericidir. Birkaç moleküler hibridizasyon çeşidi vardır: nokta hibridizasyonu, blot hibridizasyonu, sandviç hibridizasyonu, yerinde hibridizasyonu, vb.

IgM sınıfı antikorlar, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, bu nedenle bunların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösterir. IgM sınıfının antikorları, immünofloresan veya enzim immunoassay anti-μ antisera (anti-lgM ağır zincir serumu) kullanarak.

Virolojideki serolojik yöntemler, klasik immünolojik reaksiyonlara dayanmaktadır (bkz. immünolojik yöntemler Araştırma) : kompleman fiksasyon reaksiyonları, hemaglütinasyon inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, dolaylı hemaglütinasyon, radyal hemoliz, immünofloresan, enzim immünoassay, radyoimmunoassay. Birçok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiştir ve teknikleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve birinciye kıyasla ikinci serumdaki antikor artışını belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde alınır, ikincisi - sonra alınır). 2-3 hafta). İkinci serumda antikorlarda dört kat artıştan daha az tanı değeri yoktur. IgM sınıfı antikorların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösteriyorsa, o zaman IgC sınıfı antikorlar birkaç yıl ve bazen ömür boyu devam eder.

Virüslerin bireysel antijenlerini ve bunlara karşı antikorları önceden protein saflaştırması olmadan karmaşık karışımlarda tanımlamak için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu enzim immünoassay ile proteinlerin müteakip immünolojik testi ile birleştirir. Proteinlerin ayrılması, antijenin kimyasal saflığı için gereksinimleri azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, HIV enfeksiyonunun serodiagnozunda, yanlış pozitif enzim immunoassay reaksiyonlarının antikorların varlığından kaynaklandığı durumlarda geçerlidir. hücre antijenleri, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak bulunur. Hasta serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonların analizinde - viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonunda immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. büyük bir değer Yöntem, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenleri analiz etme, boyutlarını ve antijenik determinantların varlığını belirleme olasılığından oluşur.

20)Temel yapısal bileşen viryonlar(tam viral partiküller) bir nükleokapsiddir, yani viral genomu (DNA veya RNA) çevreleyen protein kılıfı (kapsid). Çoğu virüs ailesinin nükleokapsidi, bir lipoprotein zarfı ile çevrilidir. Bazı virüslerde (orto-, paramikso-, rabdo-, filo- ve retrovirüsler) zarf ile nükleokapsid arasında, virionlara ilave sertlik kazandıran glikosile edilmemiş bir matris proteini vardır. Çoğu ailenin virüsleri, bulaşıcılıkta önemli bir rol oynayan bir zarfa sahiptir. Nükleokapsit tomurcuklanarak hücre zarına girdiğinde viryonlar zarfın dış katmanını kazanır. Zarf proteinleri virüs tarafından kodlanır ve lipitler hücre zarından ödünç alınır. Genellikle dimerler ve trimerler formundaki glikoproteinler, viryonların (orto-, paramiksovirüsler, rabdo-, filo-, korona-, bunya-, arena-, retrovirüsler) yüzeyinde peplomerler (çıkıntılar) oluşturur. Glikosile füzyon proteinleri, peplomerlerle ilişkilidir ve virüsün hücreye girişinde anahtar rol oynar. Kapsidler ve virionların zarfları, kendi kendine bir araya gelme sürecinin bir sonucu olarak bir veya daha fazla tipte protein alt biriminin birçok kopyasından oluşur. Zayıf nedeniyle protein-protein sistemindeki etkileşim Kimyasal bağlar, simetrik kapsidlerin birleşmesine yol açar. Virionların şekli ve boyutundaki virüslerdeki farklılıklar, yapısal protein alt birimlerinin şekline, boyutuna ve sayısına ve bunlar arasındaki etkileşimin doğasına bağlıdır. Kapsid, nispeten basit geometrik prensiplere uygun olarak kesin olarak tanımlanmış bir şekilde viral polipeptitlerden bir araya getirilmiş birçok morfolojik olarak ifade edilen alt birimden (kapsomerler) oluşur. Birbirleriyle bağlanan protein alt birimleri, iki tür simetrinin kapsidlerini oluşturur: izometrik ve sarmal. Zarflı virüslerin nükleokapsidinin yapısı, zarfsız virüslerin nükleokapsidinin yapısına benzer. Virüs zarfının yüzeyinde morfolojik olarak ifade edilen glikoprotein yapıları - peplomerler ayırt edilir. Süperkapsid zarın bileşimi, hücresel kökenli lipitleri (%20-35'e kadar) ve karbonhidratları (%7-8'e kadar) içerir. Lipid biyotabakasının dışında ve içinde yer alan çift katlı hücresel lipidler ve virüse özgü proteinlerden oluşur. Süperkapsid kabuğunun dış tabakası, bir veya daha fazla glikoprotein molekülünden oluşan bir veya daha fazla türden peplomerler (çıkıntılar) ile temsil edilir. Zarflı virüslerin nükleokapsidi genellikle çekirdek olarak adlandırılır. Merkezi kısmı Bir nükleik asit içeren bir virion, bir nükleoid olarak adlandırılır. Kapsomerler (peplometreler) şunlardan oluşur: yapısal birimler bir veya daha fazla homolog veya heterolog polipeptit zincirinden (protein alt birimleri) yapılmıştır. virüslerin sınıflandırılması İzometrik kapsitler küreler değil, düzenli çokyüzlülerdir (ikosahedronlar). Doğrusal boyutları, simetri eksenleri boyunca aynıdır. Kaspar ve Klug'a (1962) göre, kapsidlerdeki kapsomerler ikosahedral simetriye göre düzenlenir. Bu tür kapsitler, bir ikosahedron oluşturan özdeş alt birimlerden oluşur. İkizkenar üçgenler şeklinde 12 köşeleri (köşeleri), 30 yüzleri ve 20 yüzeyleri vardır. Bu kurala göre, çocuk felci virüsünün ve şap virüsünün kapsidi, her biri dört polipeptit zincirinden oluşan 60 protein yapısal biriminden oluşur. İkosahedron, tekrar eden alt birimleri minimum hacimle sıkı bir kompakt yapı halinde paketleme sorununu en iyi şekilde çözer. Yapısal alt birimlerin yalnızca bazı konfigürasyonları, viral ikosahedronun yüzeylerini, köşelerini ve yüzlerini oluşturabilir. Örneğin, adenovirüsün yapısal alt birimleri, yüzeylerde ve yüzlerde altıgen kapsomerler (heksonlar) ve tepelerde beşgen kapsomerler (peptonlar) oluşturur. Bazı virüslerde, her iki kapsomer türü de aynı polipeptitler tarafından, diğerlerinde farklı polipeptitler tarafından oluşturulur. Farklı virüslerin yapısal alt birimleri birbirinden farklı olduğu için bazı virüsler daha altıgen, bazıları daha küresel gibi görünür. Çiçek hastalığı virüsleri dışında bilinen tüm DNA içeren omurgalı virüslerin yanı sıra birçok RNA içeren virüs (7 aile) kübik kapsid simetri tipine sahiptir. Reovirüsler, diğer omurgalı virüslerinden farklı olarak, her biri morfolojik birimlerden oluşan çift kapsid (dış ve iç) içerir. Sarmal tipte simetriye sahip virüsler, silindirik filamentli bir yapıya sahiptir, genomik RNA'ları spiral şeklindedir ve kapsidin içinde bulunur. Sarmal simetriye sahip tüm hayvan virüsleri, bir lipoprotein zarfı ile çevrilidir. Sarmal nükleokapsidler, uzunluk, çap, sarmal aralığı ve sarmalın dönüşü başına kapsomer sayısı ile karakterize edilir. Bu nedenle, Sendai virüsünde (paramiksovirüs), nükleokapsid, yaklaşık 1 μm uzunluğunda, 20 nm çapında ve 5 nm'lik bir sarmal hatveli bir sarmaldır. Kapsid, her biri 60 kD moleküler ağırlığa sahip bir protein olan yaklaşık 2400 yapısal birimden oluşur. Sarmalın her turunda 11-13 alt birim vardır. Sarmal tipte nükleokapsid simetrisine sahip virüslerde, protein moleküllerinin bir sarmal şeklinde katlanması, nükleik asit ve protein alt birimleri arasında maksimum etkileşimi sağlar. İkosahedral virüslerde, nükleik asit viryonların içinde kıvrılır ve kapsid içinde yer alan bir veya daha fazla polipeptit ile etkileşime girer.

Antireseptörler (reseptörler) Viral- hassas bir hücrenin karşılık gelen reseptörüne tamamlayıcı bir şekilde bağlanan hemaglutinin gibi yüzey virion proteinleri.

21) Virolojik araştırmalarda immünolojik yöntemler.

Serolojik testler, bireysel antikor sınıflarını tespit etme yeteneklerine göre değişir. Örneğin aglütinasyon testi, IgM antikorlarını saptamada iyidir, ancak IgG antikorlarını saptamada daha az hassastır. Kompleman gerektiren kompleman fiksasyonu ve hemoliz testleri, IgA antikorları ve IgE antikorları gibi komplemana bağlanmayan antikorları saptamaz. Yalnızca patojenite ile ilişkili virion yüzeyinin antijenik determinantlarına yönelik antikorlar, virüs nötralizasyon reaksiyonuna katılır. Hassasiyet I. m. ve. antijenlerin ve antikorların incelenmesine yönelik diğer tüm yöntemleri geride bırakır, özellikle radyoimmünoassay ve enzim immünoassay, nanogramlar ve hatta pikogramlar cinsinden ölçülen miktarlarda protein varlığının yakalanmasına izin verir. I. m.'nin yardımıyla ve. grubu belirleyin ve kanın güvenliğini kontrol edin (hepatit B ve HIV enfeksiyonu). Kumaş ve organların naklinde Ve m. doku uyumluluğunun belirlenmesine ve uyumsuzluk bastırma yöntemlerinin test edilmesine izin verir. Adli tıpta, bir proteinin tür özgüllüğünü belirlemek için Castellani reaksiyonu ve kan grubunu belirlemek için aglütinasyon reaksiyonu kullanılır.

immünolojik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır. laboratuvar teşhisi bulaşıcı hastalıklar. Hastalığın etiyolojisi, hastalığın ilk günlerinde alınan örnekle karşılaştırıldığında iyileşen kişinin kan serumundaki patojene karşı antikorların artması temelinde de belirlenir. I. m. ve. grip gibi toplu enfeksiyonlara karşı nüfusun bağışıklığını incelemek ve ayrıca koruyucu aşıların etkinliğini değerlendirmek.

Mekanizmalarına ve sonuçların hesabına bağlı olarak I. m. ve. aglütinasyon olgusuna göre reaksiyonlara ayrılabilir; çökelme fenomenine dayalı reaksiyonlar; tamamlayıcı içeren reaksiyonlar; Nötrleştirme reaksiyonu; Kimyasal ve fiziksel yöntemler kullanılarak reaksiyonlar.

Aglütinasyon fenomenine dayalı reaksiyonlar. Aglütinasyon, hücrelerin veya tek tek parçacıkların - bir antijenin taşıyıcıları - bu antijene bağışıklık serumu yardımıyla yapıştırılmasıdır.

Uygun bir antibakteriyel serum kullanılarak yapılan bakteriyel aglütinasyon testi, en basit serolojik testlerden biridir. Test edilen kan serumunun çeşitli dilüsyonlarına bir bakteri süspansiyonu eklenir ve t ° 37 ° 'de belirli bir temas süresinden sonra kan serumu aglütinasyonunun en yüksek seyreltilmesinin meydana geldiği kaydedilir. Bakterilerin aglütinasyon reaksiyonu birçok bulaşıcı hastalığı teşhis etmek için kullanılır: bruselloz, tularemi, tifo ve paratifo ateşi, basilli dizanteri ve tifüs.

Pasif veya dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonu (RPGA, RNGA). Yüzeyinde antijenlerin (bakteriyel, viral, doku) veya antikorların adsorbe edildiği eritrositler veya nötr sentetik malzemeler (örneğin lateks parçacıkları) kullanır. Aglütinasyonları, uygun serum veya antijenler eklendiğinde meydana gelir.

Pasif hemaglütinasyon testi, bakterilerin neden olduğu hastalıkları teşhis etmek için kullanılır ( Tifo ve paratifoid, dizanteri, bruselloz, veba, kolera vb.), protozoa (sıtma) ve virüsler (grip, adenovirüs enfeksiyonları, viral hepatit B, kızamık, kene kaynaklı ensefalit, Kırım Hemorajik ateş vb.) yanı sıra bazı hormonları belirlemek, tanımlamak aşırı duyarlılık hasta ilaçlar ve penisilin ve insülin gibi hormonlar.

Hemaglutinasyon inhibisyon testi (HITA), eritrositlerin hemaglutinasyonunun immün serumunun virüsler tarafından önlenmesi (inhibisyonu) olgusuna dayanır ve antiviral antikorları saptamak ve titre etmek için kullanılır. İnfluenza, kızamık, kızamıkçık serodiyagnozunun ana yöntemi olarak hizmet eder. kabakulak, kene kaynaklı ensefalit ve nedensel ajanları hemaglutinasyon özelliklerine sahip olan diğer viral enfeksiyonlar. örneğin, kene kaynaklı ensefalitin serodiyagnozu için, bir alkalin borat tampon çözeltisi içinde hasta serumunun iki kat seyreltileri panelin oyuklarına dökülür. Daha sonra belirli bir miktarda, genellikle 8 AU (aglütinasyon ünitesi), kene kaynaklı ensefalit antijeni eklenir ve t ° 4 ° 'de 18 saat maruz kaldıktan sonra, asidik bir fosfat tampon çözeltisi içinde hazırlanmış bir kaz eritrosit süspansiyonu verilir. Hastanın kan serumunda kene kaynaklı ensefalit virüsüne karşı antikorlar varsa, antijen nötralize edilir ve eritrosit aglütinasyonu meydana gelmez.

Yağış fenomenine dayalı reaksiyonlar. Çökelme, antikorların çözünür antijenlerle etkileşiminin bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bir çökeltme reaksiyonunun en basit örneği, bir test tüpünde bir antikor üzerinde antijen tabakasının sınırında opak bir çökelme bandının oluşmasıdır. Yarı sıvı agar veya agaroz jellerde hem kalitatif hem de kantitatif olan çeşitli çökeltme reaksiyonları yaygın olarak kullanılmaktadır (Ouchterlon çift immünodifüzyon yöntemi, radyal immünodifüzyon yöntemi, immünoelektroforez). Antijenlerin ve antikorların jeldeki serbest difüzyonunun bir sonucu olarak, optimal oranlarının bulunduğu bölgede, spesifik kompleksler oluşur - görsel olarak veya boyama ile tespit edilen çökeltme bantları. Yöntemin bir özelliği, her bir antijen-antikor çiftinin ayrı bir çökeltme bandı oluşturması ve reaksiyonun, çalışılan sistemdeki diğer antijenlerin ve antikorların varlığına bağlı olmamasıdır.

Taze kobay serumu olarak kullanılan kompleman içeren reaksiyonlar, Clq kompleman alt bileşeninin ve daha sonra diğer kompleman bileşenlerinin immün komplekslere bağlanma kabiliyetine dayanır.

Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR), antijen-antikor kompleksi tarafından komplement fiksasyon derecesine göre antijenlerin veya antikorların titrasyonuna izin verir. Bu reaksiyon iki aşamadan oluşur: antijenin test kan serumu ile etkileşimi (test sistemi) ve hemolitik serumun koç eritrositleri ile etkileşimi (gösterge sistemi). -de olumlu tepki incelenen sistemde kompleman fiksasyonu meydana gelir ve ardından antikora duyarlı eritrositler eklenirken hemoliz gözlenmez. Reaksiyon, sifiliz (Wassermann reaksiyonu), viral ve bakteriyel enfeksiyonların serodiyagnozunda kullanılır.

Nötralizasyon reaksiyonu, antikorların enzim aktivitesi, bakteriyel toksinler ve virüslerin patojenitesi gibi makromoleküler veya çözünür antijenlerin belirli spesifik fonksiyonlarını nötralize etme kabiliyetine dayanır. Toksinlerin nötralizasyon reaksiyonu biyolojik etki ile değerlendirilebilir, örneğin anti-tetanoz ve anti-botulinum serumları titre edilir. Hayvanlara verilen toksin ve antiserum karışımı ölümlerine neden olmaz. Nötralizasyon reaksiyonunun çeşitli varyantları virolojide kullanılmaktadır. Virüsler uygun bir antiserum ile karıştırılıp bu karışım hayvanlara veya hücre kültürlerine verildiğinde virüslerin patojenitesi nötralize edilir ve hayvanlar hastalanmaz, kültürlerin hücreleri de yıkıma uğramaz.

Kimyasal ve fiziksel etiketler kullanılarak reaksiyonlar. İmmünofloresans, florokrom etiketli antikorların, daha doğrusu IgG antikorlarının immünoglobulin fraksiyonunun kullanılmasından oluşur. Bir florokrom ile işaretlenmiş bir antikor, florokromun lüminesansını uyaran UV ışınlarında mikroskop altında gözlem için uygun hale gelen antijen ile bir antijen-antikor kompleksi oluşturur. Doğrudan immünofloresan reaksiyonu, hücresel antijenleri incelemek, enfekte hücrelerde virüsü tespit etmek ve yaymalarda bakteri ve riketsiyayı tespit etmek için kullanılır.

Dolaylı immünofloresan yöntemi daha yaygın olarak kullanılmaktadır. ışıldayan bir anti-lgG antikor serumu kullanılarak bir antijen-antikor kompleksinin saptanmasına dayanır ve yalnızca antijenleri değil, aynı zamanda antikor titrasyonunu da saptamak için kullanılır.

İmmünoenzim veya enzim immünolojik yöntemleri, başta yaban turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz olmak üzere enzimlerle konjüge edilmiş antikorların kullanımına dayanır. İmmünofloresans gibi, enzim immün testi de hücrelerdeki antijenleri tespit etmek veya antijen içeren hücreler üzerindeki antikorları titre etmek için kullanılır.

Radyoimmünolojik yöntem, antijenlerin veya antikorların bir radyoizotop etiketinin kullanımına dayanır. Antijen ve antikor tayininde en hassas yöntemdir, hormon tayininde kullanılır, tıbbi maddeler ve antibiyotikler, bakteriyel, viral, riketsiyal, protozoal hastalıkların teşhisi için, kan proteinlerinin incelenmesi, doku antijenleri.

İmmunoblotlama, tek tek antijenlere karşı antikorları saptamak veya bilinen serumlardan antijenleri "tanımak" için kullanılır. Yöntem 3 aşamadan oluşur: biyolojik makromoleküllerin (örneğin bir virüs) poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak ayrı ayrı proteinlere ayrılması; aktifleştirilmiş kağıt veya nitroselüloza bir poliakrilamid jel plakası uygulanarak (elektro lekeleme) jelden ayrılan proteinlerin katı bir destek (leke) üzerine aktarılması; doğrudan veya dolaylı enzim immunoassay kullanılarak substrat üzerinde istenen proteinlerin saptanması. Teşhis yöntemi olarak, HIV enfeksiyonu için immünoblotlama kullanılır. Teşhis değeri, virüsün dış kabuğunun proteinlerinden birine karşı antikorların saptanmasıdır.

22) Simetri virüs türleri (kübik, sarmal, karışık). Virüs genomlarının paketlenmesinde proteinlerin ve nükleik asitlerin etkileşimi.

Kapsidin nükleik asit ile etkileşimine bağlı olarak, virüs parçacıkları birkaç simetri türüne ayrılabilir:

1). Kübik simetri tipi.

Kübik kapsidler, yaklaşık 20 üçgen yüzeyi ve 12 köşesi olan ikosiderlerdir. Küresel bir oluşumu andıran bir yapı oluştururlar, ancak aslında bir polihedrondur. Bazı durumlarda, sivri uçlar adı verilen özel lipoprotein oluşumları, bu tür ikosahedral çokyüzlülerin köşelerine bağlanır. Bu sivri uçların rolü, muhtemelen, virionların veya viral partiküllerin, onlara duyarlı konakçı hücrelerin karşılık gelen alanlarıyla etkileşimine indirgenmiştir. Kübik simetri ile viral nükleik asit sıkıca paketlenir (bir top haline getirilir) ve protein molekülleri onu çevreleyerek bir polihedron (ikosahedron) oluşturur. Bir icosahedron, kübik simetriye ve yaklaşık olarak küresel bir şekle sahip yirmi üçgen yüze sahip bir çokyüzlüdür. İkosahedral virüsler arasında herpes simpleks virüsü, reovirüsler vb.

2). Spiral simetri tipi. Spiral kapsidler biraz daha basittir. Şunlar. Kapsidi oluşturan kapsomerler, sarmal NK'yı kaplar ve ayrıca bu virüslerin oldukça kararlı bir protein kabuğunu oluşturur. Ve yüksek çözünürlüklü elektron mikroskopları ve uygun hazırlama yöntemleri kullanıldığında, virüsler üzerinde sarmal yapılar görülebilir. Kapsidin sarmal simetrisi ile viral nükleik asit, içi boş bir sarmal (veya sarmal) şekil oluşturur ve protein alt birimleri (kapsomerler) de bir spiral (tübüler kapsid) içinde istiflenir. Kapsidin sarmal simetrisine sahip bir virüs örneği, çubuk şeklinde olan ve uzunluğu 300 nm ve çapı 15 nm olan tütün mozaik virüsüdür. Bir viral parçacığın bileşimi, yaklaşık 6000 nükleotid büyüklüğünde bir RNA molekülü içerir. Kapsid, bir sarmal halinde düzenlenmiş 2000 özdeş protein alt biriminden oluşur.

3). Karışık veya karmaşık tip simetri. Kural olarak, bu tür bir simetri esas olarak bakteriyel virüsler arasında bulunur. Ve klasik örnekler, bu fajlar, E. coli veya ılıman fajlardır. Bunlar, iç nükleik içeriğe sahip bir kafaya, çeşitli uzantılara, bir kuyruk sürecine sahip karmaşık oluşumlardır. değişen dereceler cihaz karmaşıklığı. Ve bu tür parçacıkların her bir bileşeni, virüs ile hücre arasındaki etkileşim sürecinde gerçekleşen belirli bir işlevle donatılmıştır. Başka bir deyişle, karmaşık bir simetri türü, kübik simetrinin bir kombinasyonudur, baş, bir icosider polihedrondur ve çubuk şeklindeki oluşumlar, kuyruk işlemleridir. Her ne kadar bakteriyel virüsler arasında, küresel veya kübik şekilli ilkel nükleokapsitler olan oldukça basit bir şekilde organize edilmiş virionlar da olsa. Bakteriyel virüsler, bitki ve hayvan virüslerinden daha karmaşıktır.

24) Bir fajın bir hücre ile etkileşimi. Öldürücü ve ılıman fajlar.

Adsorpsiyon.

Etkileşim, viral partiküllerin hücre yüzeyine bağlanmasıyla başlar. Hücre yüzeyinde uygun reseptörlerin ve viral partikülün yüzeyinde anti-reseptörlerin varlığında işlem mümkün hale gelir.

Virüsler, temel maddeleri taşımak için tasarlanmış hücre reseptörlerini kullanır: besin parçacıkları, hormonlar, büyüme faktörleri vb.

Reseptörler: proteinler, proteinlerin karbonhidrat bileşeni ve lipidler, lipidler. Spesifik reseptörler, viral parçacığın sonraki kaderini belirler (taşıma, sitoplazma veya çekirdek bölgelerine teslim). Virüs, spesifik olmayan reseptörlere bağlanabilir ve hatta hücreye nüfuz edebilir. Ancak bu işlem enfeksiyona neden olmaz.

Başlangıçta, antireseptör ile reseptör arasında tek bir bağ oluşur. Bu bağ kırılgandır ve kırılabilir. Geri dönüşümsüz adsorpsiyon oluşumu için çok değerlikli bağlanma gereklidir. Kararlı bağlanma, zardaki reseptör moleküllerinin serbest hareketi nedeniyle oluşur. Virüsün hücre ile etkileşimi sırasında lipitlerin akışkanlığında artış ve virüs ile hücre arasındaki etkileşim alanında reseptör alanlarının oluşumu gözlenir. Bazı virüslerin reseptörleri, yalnızca sınırlı sayıda konak hücrede bulunabilir. Bu, organizmanın bu virüse duyarlılığını belirler. Böylece, viral DNA ve RNA, daha geniş bir konak hücre yelpazesini enfekte etme kabiliyetine sahiptir.

Antireseptörler benzersiz viral organellerde bulunabilir: T-bakteriyofajlardaki aşırı büyüme yapıları, adenovirüslerdeki lifler, viral zarların yüzeyindeki sivri uçlar, koronavirüslerdeki korona.

penetrasyon

2 mekanizma - reseptör endositozu ve membran füzyonu.

Reseptör endositozu:

Besinlerin ve düzenleyici maddelerin hücreye girişi için olağan mekanizma. Klatrin ile kaplı özel çukurların olduğu özel alanlarda meydana gelir, çukurun dibinde spesifik reseptörler bulunur. Çukurlar, hızlı invaginasyon ve klatrin ile kaplı vakuol oluşumunu sağlar (adsorpsiyon anından itibaren 10 dakikadan fazla geçmez, bir dakikada 2000'e kadar vakuol oluşabilir). Vakuoller daha büyük sitoplazmik vakuollerle birleşerek reseptörozomlar (artık klatrin içermez) oluştururlar ve bu da lizozomlarla birleşir.

Viral ve hücre zarlarının füzyonu:

Zarflı virüslerde, füzyon nedeniyle nokta etkileşimleri hücre zarı lipitleri ile viral protein, bunun sonucunda viral lipoprotein zarfı hücre zarı ile bütünleşir. Zarfsız virüslerde, yüzey proteinlerinden biri de lipidlerle etkileşime girer. hücre zarları ve iç bileşen zardan geçer (paramiksovirüslerde - F-proteini, ortomiksovirüslerde - HA2 hemaglutinasyon alt birimi). Yüzey proteinlerinin yapısı pH'tan etkilenir.

şerit.

Bu süreçte enfeksiyöz aktivite kaybolur, sıklıkla nükleazlara duyarlılık ortaya çıkar ve antikorlara karşı direnç ortaya çıkar. Soymanın son ürünü, dahili bir viral proteine bağlı nükleik asitlerdir. Soyunma aşaması da enfeksiyon olasılığını sınırlar (virüsler her hücrede soyunamaz). Soyunma, hücrenin özel alanlarında gerçekleşir: lizozomlar, Golgi aygıtı ve perinükleer boşluk.

Soyunma bir dizi tepkime sonucunda gerçekleşir. Örneğin picornavirüslerde soyunma, boyutları 156 ila 12S arasında olan ara subviral parçacıkların oluşumuyla ilerler. Adenovirüslerde sitoplazma ve nükleer gözeneklerde bulunur ve en az 3 aşaması vardır:

Virionlardan daha yüksek yoğunluğa sahip subviral parçacıkların oluşumu;

3 viral proteinin eksik olduğu çekirdeklerin oluşumu;

DNA'nın bir uç proteine kovalent olarak bağlandığı bir DNA-protein kompleksinin oluşumu.

Virülent ve ılıman fajların karakterizasyonu.

Bir bakteri bir faj ile enfekte olduğunda, sözde bir litik enfeksiyon meydana gelir, yani, konakçı hücrenin parçalanmasıyla sonuçlanan bir enfeksiyon, ancak bu yalnızca virülent fajların karakteristiğidir ve bunların hücre ile etkileşimi hücre ölümüne ve faj soyunun oluşumuna yol açar.

Bu durumda fajın hücre ile etkileşimine göre şu aşamalar ayırt edilir: fajın hücre kültürü ile karıştırılması (enfeksiyonun çokluğu 10 hücrede 1 fajdır) ve konsantrasyonun yeterince yüksek olması gerekir ki fajlar hücrelerle temas edebilir. Yeniden enfeksiyondan kaçınmak için - enfeksiyondan sonra maksimum 5 dakika, fajlar emildiğinde - bu hücre karışımı fajla seyreltilir. Faj miktarının artmadığı, ardından çok fazla artmadığı gizli bir dönem ayırt edilir. kısa süreçıkış, faj partiküllerinin sayısı keskin bir şekilde arttığında, hücre parçalandığında ve faj soyu salındığında ve ardından faj sayısı aynı seviyede kaldığında, yeniden enfeksiyon meydana gelmez. Bu eğriye dayanarak, bu fazlar ayırt edilebilir: vejetatif "büyüme" dönemi (gizli dönem), çıkış dönemi ve 1 enfekte hücre başına faj verimini hesaplayın. Latent dönemde bakterilerde faj partiküllerine benzer hiçbir şey bulunmaz ve latent dönemde bu tür hücrelerden enfeksiyon prensibini izole etmek mümkün değildir. Yalnızca olgun faj parçacıkları bakterileri enfekte edebilir. Böylece, öldürücü fajlar her zaman bakterilerin ölümüne neden olur ve sonraki ve diğer hassas hücreleri enfekte edebilen yeni viral partiküllerin üretiminde ortaya çıkan enfeksiyon üretir.

Virülan olanların aksine, ılıman fajlarla enfeksiyon, bakteri hücrelerinin parçalanmasına yol açmaz, ancak bir fajın bir bakteri hücresi ile özel bir arada bulunma durumunun oluşumu gerçekleşir. Bu birliktelik, fajın belirli bir başlangıcının bakteri hücresinde kendisi için herhangi bir olumsuz koşul olmaksızın mevcut olması ve nesilden nesile korunması ile ifade edilir. Bu tür bir arada yaşamanın belirli aşamalarında, faj hücrede aktive olur ve litik gelişim döngüsü durumuna girerek hücre parçalanmasına ve faj soyunun salınmasına neden olur. Bu tür fajlara lizojenik veya ılıman fajlar denir ve fajla orta düzeyde var olma durumuna lizojeni ve böyle gizli bir faj içeren bakterilere lizojenik bakteri denir. Lizojenik bakteri terimi, bir zamanlar bir fajın kendiliğinden ortaya çıktığı kültürlerin keşfedilmesinden geldi ve bu bakteriyofaj, kültürün kontaminasyonu olarak kabul edilmeye başlandı, yani kültüre bir bakteri virüsü giriyor ve bu tür kültürlere lizojenik deniyordu. yani lizis oluştururlar.

Virolojik araştırma yöntemleri- virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını incelemek için yöntemler. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nasıl nüfuz ettiklerini ve virüslerin üreme özelliklerini, viral nükleik asitlerin birincil yapısını belirlemenin mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. ve proteinler. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerin kurucu elementlerinin dizisini belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve kodladıkları proteinlerin fonksiyonlarını nükleotit dizisi ile ilişkilendirmek ve e-virüs enfeksiyonunda önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini tespit etmek mümkün hale geliyor.

Virolojik araştırma yöntemleri ayrıca immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglütine olma yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (sitopatik etkisi, hücre içi kapanımların oluşumu vb.) .

Çoğu birincil kültürden alınan hücreler alt kültürlenebilir ve ikincil kültürler olarak anılır. Hücrelerin daha fazla geçişi ile, çoğu orijinal kromozom setini koruyan, hızlı üreme yeteneğine sahip bir fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri kültivasyonunda stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid bir kromozom seti ile hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre çizgileri, tek tabakalı ve süspansiyon olabilir. Tek tabakalı kültürler cam yüzey üzerinde sürekli bir tabaka halinde, süspansiyon kültürleri ise karıştırıcılar kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyon şeklinde büyütülür. 40 farklı hayvan türünden (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlardan türetilen 400'den fazla hücre dizisi vardır.

Bireysel organ ve doku parçaları (organ kültürleri) yapay besleyici ortamlarda yetiştirilebilir. Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde üremeyen virüslerin (örneğin koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki bir değişiklikle, spesifik olabilen sitopatik etkiyle, inklüzyonların görünümüyle, hücrede ve kültür sıvısında viral antijenleri belirleyerek saptanabilir; kültür sıvısında viral progeninin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültürü, civciv embriyoları veya hassas hayvanlarda virüslerin titrasyonu; moleküler hibridizasyon yoluyla hücrelerdeki bireysel viral nükleik asitleri veya floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle nükleik asit kümelerini saptayarak.

Virüslerin izolasyonu zahmetli ve uzun bir süreçtir. Popülasyon içinde dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek için yapılır (örneğin, a virüsünün serovaryanını, virüs a'nın vahşi veya aşı suşunu, vb. belirlemek için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya varyantları ortaya çıktığında; gerekirse ön teşhisi onaylayın; çevresel nesnelerdeki virüslerin göstergesi için. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalıcı olma olasılıklarının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun meydana gelme olasılığı dikkate alınır. Tek bir viriondan elde edilen bir virüsün genetik olarak homojen bir popülasyonuna viral klon denir ve bunu elde etme işlemine klonlama denir.

semplastların ve sinsitinin oluşumu, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorpsiyon, hemaglutinasyon (hemaglutinasyon yapan virüslerde) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen. Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebilir.

Bazı virüslerin izolasyonu için, örneğin virüs a, tavuk embriyoları, bazı Coxsackie virüslerinin ve bir dizi arbovirüsün - yeni doğmuş farelerin izolasyonu için kullanılır. İzole edilmiş virüslerin tanımlanması, serolojik testler ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle, doku dejenerasyonunun meydana geldiği, inklüzyonların ve virüse özgü antijenlerin oluştuğu virüs içeren sıvının en yüksek dilüsyonunu belirleyen doku kültüründe gerçekleştirilir. Plak yöntemi, bir dizi virüsü titre etmek için kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplama altında tek katmanlı bir doku kültürünün virüs tarafından yok edilmiş hücrelerinin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir enfeksiyöz virüs partikülünün bir plak oluşturduğu temelinde virüslerin enfeksiyöz aktivitesinin kantitatif bir analizine izin verir. Plaklar, kültürün hayati boyalarla, genellikle nötr kırmızıyla boyanmasıyla tanımlanır; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planına karşı hafif noktalar olarak görünür. Virüsün titresi, 1'deki plak oluşturan birimlerin sayısı olarak ifade edilir. ml.

Viral enfeksiyonların laboratuvar teşhisi, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin saptanmasını; bu malzemeden virüs izolasyonu; serodiagnoz. Her bir durumda laboratuvar teşhis yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Viral enfeksiyonların modern teşhisi, hastalığın erken evrelerinde klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra yanıt almanızı sağlayan ekspres yöntemlere dayanmaktadır.Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu,

yanı sıra immünofloresan, moleküler hibridizasyon yöntemi, IgM sınıfı antikorların tespiti vb.

IgM sınıfı antikorlar, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, bu nedenle bunların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösterir. IgM sınıfının antikorları, anti-m antisera (anti-IgM ağır zincir serumu) kullanılarak immünofloresan veya enzim immün testi ile tespit edilir.

Virolojideki serolojik yöntemler, klasik immünolojik reaksiyonlara dayanmaktadır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri ): tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonları

hemaglütinasyonun inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, indirekt hemaglutinasyon, radyal hemoliz, immünofloresans, enzim immünoassay, radyoimmunoassay. Birçok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiştir ve teknikleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve birinciye kıyasla ikinci serumdaki antikor artışını belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde alınır, ikincisi - sonra alınır). 2-3 hafta). İkinci serumda antikorlarda dört kat artıştan daha az tanı değeri yoktur. IgM sınıfı antikorların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösteriyorsa, o zaman IgC sınıfı antikorlar birkaç yıl ve bazen ömür boyu devam eder.

Virüslerin bireysel antijenlerini ve bunlara karşı antikorları önceden protein saflaştırması olmadan karmaşık karışımlarda tanımlamak için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu enzim immünoassay ile proteinlerin müteakip immünolojik testi ile birleştirir. Proteinlerin ayrılması, antijenin kimyasal saflığı için gereksinimleri azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücre antijenlerine karşı antikorların varlığından kaynaklanan yanlış pozitif enzim immünoanaliz reaksiyonlarının olduğu HIV enfeksiyonunun serodiyagnozu ile ilgilidir. Hasta serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonların analizinde - viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonunda immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenleri analiz etme, boyutlarını ve antijenik determinantların varlığını belirleme olasılığında yatmaktadır.

Kaynakça: Bukrinskaya A.G. Viroloji, M., 1986; Viroloji, Yöntemler, ed. B. Meikhi, çev. İngilizceden, M., 1988; Mikrobiyolojik ve virolojik araştırma yöntemleri el kitabı, ed. MO Birger, M., 1982.

Virolojik çalışmalar, virüsleri izole etmek ve özelliklerini incelemek ve ayrıca virüslerin belirli hastalıklarla etiyolojik ilişkisini kurmak için tasarlanmış çalışmalardır.

Çalışma için materyal, hastanın vücudundaki baskın virüslerin konumuna ve sırasında izole edilme yollarına bağlı olarak alınır. dış ortam. Materyal steril bir kapta toplanır, mümkün olan en kısa sürede laboratuvara gönderilir ve çalışma donana veya buz üzerinde saklanana kadar saklanır. Kullanımdan önce, virüs izolasyon malzemesi işlenir (ve) yabancı mikroflorayı bastırmak ve büyük parçacıkların uzaklaştırılmasına tabi tutulur.

Virüslerin izolasyonu, laboratuvar hayvanlarına, tavuk embriyolarına, doku kültürüne virüs içeren materyal bulaştırılarak gerçekleştirilir. İzolasyon yönteminin seçimi, hastalığa neden olduğu iddia edilen ajana bağlıdır. Bu nedenle, laboratuvar hayvanları için patojenik olmayan virüslerle çalışırken veya doku kültüründe hayvanlara bulaştıklarından daha erken tespit edildiğinde doku kültürleri (bkz.) kullanılır. Tavuk embriyoları, patojenleri, enfeksiyöz parotiti (amniyotik ve allantoik boşluklarda), (içinde) izole etmek için enfekte edilir. yumurta sarısı kesesi), çiçek hastalığı (koriyoallantoik zarda).

Laboratuvar hayvanlarından virüs izolasyonu için en sık beyaz fareler kullanılır, bunu tavşanlar, sıçanlar, fareler takip eder. kobaylar, maymunlar. Arbovirüsler için, virüs içeren malzemenin kafaya veya pnömotropik virüsler için - mukoza zarına en etkili şekilde sokulması solunum sistemi, çiçek hastalığı virüsleri için, yaralı korneada.

Virüslerin izolasyonu en çok hastalığın akut döneminde etkilidir. Hastalığın viral doğasını belirlemede önemli bir nokta sonuçlardır. serolojik çalışmalar aynı hastadan hastalığın başlangıcında ve nekahat döneminde tekrar tekrar alınan serumlar. İkinci serumda izole edilmiş virüslere karşı antikorların birinciden 4 kat veya daha fazla titrede saptanması, virüslerin bu hastalıkla etiyolojik ilişkisini gösterir.

Erken ve hızlı yöntem viral antijenlerin saptanması, florokrom ile işaretlenmiş antikorların antijenin yüzeyinde spesifik olarak sabitlenmesine dayanan bir floresan antikor yöntemidir. Antijen üzerine adsorbe edilen antikorların parlak floresansı sayesinde antijen, lüminesan mikroskopide (bkz.) kolayca ortaya çıkar. Floresan antikor yöntemi kullanılarak hastalardan alınan yaymalar, etkilenen dokuların histolojik kesitleri, doku kültüründen alınan preparatlar incelenir. Ayrıca temel cisimlerin (viryonlar) tespiti için de geçerlidir (bkz.). Diğer morfolojik yöntemlerden, etkilenen organ ve dokuların kesitlerinde hücre içi viral inklüzyonları saptayanlar kullanılır. İnklüzyonların saptanması enfeksiyonu gösterir ve bazı durumlarda tanıya katkıda bulunur. viral hastalık. Hastaların kanındaki viral antikorları saptamak ve virüslerin antijenik yapısını incelemek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Nötralizasyon reaksiyonu hemen hemen tüm viral enfeksiyonlarda kullanılır. Karışım, duyarlı hayvanların vücuduna veya doku kültürüne verildiğinde, bağışıklık antikorlarının virüslerin bulaşıcı özelliklerini nötralize etme kabiliyetine dayanır. Nötralizasyon indeksini belirlemek için, çeşitli virüs dilüsyonları ile sabit bir serum dozu karıştırılır ve antikor titresini belirlemek için - çeşitli dilüsyonlar sabit dozda virüs içeren serum. Kontrol, hayvanların (veya doku kültürlerinin) normal serum veya tuzlu su. Nötralizasyon reaksiyonu sadece antikorları tespit etmek için değil, aynı zamanda virüslerin tipini ve tipini belirlemek için de ayarlanmıştır.

Tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonu [örneğin, Borde - Zhangu reaksiyonu (bkz.)] hem viral antijenleri hem de antikorları saptamak için kullanılır. İlk durumda, bilinen bağışıklık serumu, içinde antijenlerin var olduğu varsayılan malzeme ile etkileşime girer: kan serumu, nazofaringeal sürüntüler, enfekte organizmanın doku özleri. İkinci durumda, bilinen bir antijen (diagnosticum) ve hastanın veya iyileşen kişinin serumu.

RSK, grip, çiçek hastalığı, adenovirüsler ve arbovirüslerin neden olduğu hastalıkları teşhis etmek için kullanılır.

Virolojik yöntem iki ana aşama içerir: virüslerin izolasyonu ve tanımlanması. Materyaller kan, diğer biyolojik ve patolojik sıvılar, organ ve doku biyopsileri olabilir.

Arbovirüs enfeksiyonlarını teşhis etmek için genellikle virolojik kan testi yapılır. Tükürükte kuduz, kabakulak ve herpes simpleks virüsleri saptanabilir. Nazofaringeal sürüntüler, grip ve diğer akut solunum yolu viral enfeksiyonları, kızamık patojenlerini izole etmek için kullanılır. Konjonktivadan yapılan yıkamalarda adenovirüsler bulunur. Dışkıdan çeşitli entero-, adeno-, reo- ve rotavirüsler izole edilir.

Virüsleri izole etmek için hücre kültürleri, tavuk embriyoları ve bazen laboratuvar hayvanları kullanılır. Çoğu patojenik virüs, doku varlığı ve tip özgüllüğü ile ayırt edilir, "örneğin, çocuk felci virüsü yalnızca primat hücrelerde çoğalır, bu nedenle, belirli bir virüsü izole etmek için uygun bir doku kültürü kullanılır. Bilinmeyen bir patojeni izole etmek için, eş zamanlı olarak tavsiye edilir. birinin duyarlı olabileceğini varsayarak 3-4 hücre kültürünü enfekte edin.Enfekte kültürlerde virüsün varlığı, spesifik hücre dejenerasyonunun gelişimi, yani sitopatojenik etki, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca bazında belirlenir. immünofloresans, pozitif hemadsorpsiyon ve hemaglütinasyon reaksiyonları ile spesifik bir antijenin saptanması.Kuşların embriyoları, zayıf farklılaşmış dokuları ile çok sayıda virüsün kültürlenmesi için uygundur.Çoğunlukla, tavuk embriyoları kullanılır.Embriyolarda çoğalırken, virüsler ölümlerine neden olabilir ( arbovirüsler), koryon-allantoik zarda (poksvirüsler) veya embriyonun vücudunda birikmiş değişikliklerin görünümü yani hemaglutininlerin (influenza virüsleri, kabakulak) embriyonik sıvılarında ve kompleman sabitleyici viral antijende.

Virüsler, immünolojik yöntemler kullanılarak tanımlanır: hemaglutinasyon inhibisyonu, kompleman fiksasyonu, nötralizasyon, jel çökelmesi, immünofloresan.

3.4 Biyolojik yöntem

biyolojik yöntem patojeni belirtmek için laboratuvar hayvanlarına çeşitli materyaller (klinik, laboratuvar) bulaştırmanın yanı sıra patojenitelerini (toksijenite, toksisite, virülans) karakterize eden mikroorganizmaların belirli özelliklerini belirlemekten oluşur. Laboratuvar hayvanları olarak beyaz fareler, beyaz fareler, kobaylar, tavşanlar vb.

Bir hayvanda hastalığın üremesi, izole edilen mikroorganizmanın (kuduz, tetanoz vb. durumunda) patojenitesinin kesin bir kanıtıdır. Bu nedenle, hayvanlar üzerinde biyolojik bir test, özellikle patojenleri insan vücudunun incelenen biyolojik ortamında düşük konsantrasyonlarda bulunan ve yapay ortamlarda zayıf veya yavaş gelişen enfeksiyonlar için değerli ve güvenilir bir tanı yöntemidir.

3.5 İmmünolojik yöntem

immünolojik yöntem(serolojik), spesifik antikorların ve antijenlerin saptanması için kan serumunun yanı sıra diğer biyolojik substratlarla ilgili çalışmaları içerir. Klasik serodiagnoz, tanımlanmış veya şüphelenilen bir patojene karşı antikorların belirlenmesine dayanır. Reaksiyonun pozitif bir sonucu, test kan serumunda patojenin antijenlerine karşı antikorların varlığını gösterir, negatif bir sonuç ise bunların olmadığını gösterir. İncelenen kan serumunda bir dizi bulaşıcı hastalığa neden olan ajana karşı antikorların tespiti, enfeksiyon sonrası veya aşılama sonrası bağışıklığın, dolayısıyla "eşleştirilmiş" kanın varlığını yansıtabileceğinden tanı koymak için yeterli değildir. ilki hastalığın ilk günlerinde, ikincisi 7-10 gün arayla alınan serumlar incelenir. Bu durumda, antikor seviyesindeki artışın dinamikleri değerlendirilir.

Çalışılan kan serumundaki antikor titresinde teşhis açısından anlamlı bir artış, başlangıç düzeyine göre en az 4 kattır. Bu fenomene serokonversiyon denir. Nadir bulaşıcı hastalıklarda, ayrıca viral hepatit, HIV enfeksiyonu ve diğer bazılarında, antikorların varlığı, hastanın enfekte olduğunu ve tanısal değeri olduğunu gösterir.

Antikor titresini belirlemeye ek olarak, serolojik çalışmalar antikorların izotipini belirleyebilir. Hastalığın akut döneminde insan vücudunun bir patojenle ilk karşılaşmasında, IgM'ye ait antikorlarda daha hızlı bir artış tespit edildiği, seviyesi maksimum değere ulaşıp ardından azaldığı bilinmektedir. Hastalığın ileri evrelerinde, daha uzun süre devam eden ve iyileşme döneminde belirlenen IgG antikorlarının sayısı artar. Patojen ile yeniden karşılaşıldığında, immünolojik hafıza nedeniyle hümoral bağışıklık reaksiyonları, IgG antikorlarının daha hızlı üretilmesiyle kendini gösterir ve küçük miktarlarda M sınıfı antikorlar üretilir. IgM antikorlarının tespiti, bir akımın varlığını gösterir. bulaşıcı süreç ve IgG antikorlarının varlığı - geçmiş enfeksiyon veya aşılama sonrası bağışıklık hakkında.

Birincil ve ikincil bağışıklık yanıtının özellikleri göz önüne alındığında, IgM- ve IgG-antikorlarının oranının analizi, bazı durumlarda bulaşıcı sürecin aşamasını (hastalığın yüksekliği, iyileşme, nüksetme) ayırt etmeyi sağlar. Örneğin, viral hepatit A (HA) durumunda, güvenilir bir teşhis yöntemi, kan serumunda anti-HAV IgM antikorlarının belirlenmesidir. Tespitleri, mevcut veya yeni bir HAV enfeksiyonunu gösterir.

antikorları saptamak için serolojik testler bulaşıcı hastalıklar Daha fazla olan erişilebilir yöntem Patojenin izolasyonundan daha laboratuvar teşhisi. Bazen pozitif bir serolojik reaksiyon, organizmanın karşılık gelen bulaşıcı hastalığa neden olan ajanla buluşmasının ve etkileşiminin tek kanıtıdır. Ek olarak, benzer klinik tabloya sahip bazı hastalıklar (örneğin, riketsioz, enterovirüs enfeksiyonları) sadece serolojik olarak ayırt edilebilir, bu da bulaşıcı hastalıkların tanısında serolojik yöntemlerin önemini yansıtır.

Paylaşmak: