У дома » човешка анатомия » Основните етапи на вирусологичното изследване. Насоки за изучаване на теоретичния материал в курса „Частна медицинска вирусология. Индиректни вирусологични методи на изследване

Основните етапи на вирусологичното изследване. Насоки за изучаване на теоретичния материал в курса „Частна медицинска вирусология. Индиректни вирусологични методи на изследване

Диагнозата на острите чревни инфекции се поставя въз основа на клинични и епидемиологични данни със задължително лабораторно потвърждение. Без лабораторно потвърждение диагнозата на остри чревни инфекции може да се постави само в случаите, когато има ясно установени епидемиологични данни (в огнищата на инфекцията и в лабораторни дешифрирани групови огнища на заболявания при повечето пациенти).

За окончателната диагноза се използват бактериологични, вирусологични и серологични методи на изследване.Копрологичният метод, както и резултатите от сигмоидоскопията (за шигелоза) са от второстепенно значение.

аз. Бактериологичен методе от най-голямо значение при AII, причинена от бактериална флора (инвазивна и секреторна диария). Най-добри резултати се получават чрез засяване на изпражненията директно до леглото на пациента, преди назначаването на антибиотична терапия и с доставянето му в бактериологичната лаборатория през първите два часа от момента на вземане на пробата. За изследването е необходимо да се изберат частици, съдържащи патологични примеси, но не и кръв. Биоматериалът се засява върху селективните среди на Ploskirev, Levin и др. Честотата на положителните резултати (инокулация на патогена и неговата идентификация), дори при наличие на типични клинични прояви на AII. Не надвишава 70-80%.

II. Серологични методи диагностиката, като правило, се използва в съмнителни случаи и с отрицателни резултати от бактериологичното изследване на изпражненията. При деца от първите месеци живот, това е неинформативно, но във всички случаи увеличението на титъра на антителата с 4 пъти или повече има значение. Те се провеждат в две посоки - определяне на титъра на специфични антитела в кръвния серум на пациента и антигена в изпражненията.

За определяне на титъра на специфични антитела обикновено се използва RNHA, по-рядко RPHA или RA. Като антигени се взема суспензия от дневна бактериална култура (RA) или еритроцитна диагностика. ( RPGA, RNGA). По-надеждно трябва да се счита за повишаване на титрите на антителата в динамиката на заболяването. Специфичните антитела в кръвта на пациент с AII се появяват на 3-5-ия ден от заболяването и нарастват до максимум в рамките на 2-3 седмици, след което постепенно намаляват. При малки деца, особено тези с променен преморбиден фон, специфичните антитела в кръвта не се откриват или имат ниски титри (1:50 - 1:100).

При наличие на типични клинични симптоми и откриване на диагностичен титър на специфични антитела (1: 200) и по-висок със съответния диагностикум) или повишаване на техния титър в динамиката на заболяването, клиничната диагноза на чревната инфекция трябва да бъде се считат за установени дори при липса на посяване на патогена от изпражненията на пациента.

III. Методи за експресна диагностикаЧревните инфекции се основават на откриването на антигена на патогена (бактерия или вирус) от изпражненията, за което се използва директният метод на луминесцентни антитела (PMLA) или методът на имуноадсорбция - реакция на агломерация на въглен (RCA). предварителен резултатможе да се получи за 2-3 часа, окончателното за един ден. Специфичността на метода е 82-94,6%.

AT последните годиниза бърза диагностика на диария се използват ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и латексна аглутинация (RLA).

Етиологичното декодиране на вирусна диария се извършва с помощта на вирусологични и бактериологични методи.

Оптималният период за откриване на вируси в изпражненията се счита от 1 до 4 дни от заболяването, въпреки че патогенът често продължава по-дълго.

Основният използван метод е методът на електронната микроскопия, който позволява морфологични особеностиидентифицират широк спектър от вирусни агенти, които причиняват гастроентерит.

Използва се и имуноелектронна микроскопия (въз основа на способността на вирусните частици в присъствието на хомоложни серуми или реконвалесцентни серуми да образуват агрегати от ротавирусни частици с имуноглобулини.

Сред методите за серодиагностика традиционните включват реакцията на неутрализация, инхибиране на хемаглутинацията, фиксиране на комплемента.Два до четирикратно увеличение на антителата в сдвоени серуми има ретроспективна стойност за диагностика ротавирусна инфекция. За откриване на ротавируси или техните антигени се използват ELISA, дифузна преципитация, латексна аглутинация, реакция на коаглутинация.

В практическата работа IFA заема най-широко място – изолиране на ротавирусни антигени в копрофилтри. По-добре е тези методи да се използват в динамика (първия ден от хоспитализацията и след клинично възстановяване).

За да се изключи бактериалната етиология на AII, се извършва и бактериологично изследване на изпражненията чрез инокулация върху хранителни среди.

сигмоидоскопияметодът рядко се използва при деца, главно за определяне на причината за продължителна бактериална екскреция и диагностика на продължителни и хронични форми на заболяването. Този метод на изследване позволява да се оцени само естеството на морфологичните промени в лигавиците. дисталенчерво, но не може да се използва за поставяне на етиологична диагноза на чревна инфекция.

Показания за инструментално изследване (ултразвук, рентгеново изследване на органи коремна кухина, FGS) с AII е необходимостта от диференциална диагноза с хирургични заболявания на коремните органи (инвагинация, апендицит), соматични заболявания (гастрит, пептична язва, холецистопанкреатит и др.) И функционални нарушения на стомашно-чревния тракт.

Определяне на клиничната форма на токсикоза (невротоксикоза, токсикоза с ексикоза, TSS), нейната степен (етап), вид дехидратация при инфекциозна диария при деца и спешна помощ

методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, как те проникват в клетката и характеристиките на репродукцията на вирусите, първичната структура на вируса нуклеинова киселинаи протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и кодираните от тях протеини с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусна инфекция.

Вирусологичните методи на изследване също се основават на имунологични процеси(взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект, образуването на вътреклетъчни включвания и др. .).

При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при приготвянето на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканната и клетъчната култура. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (по-често бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в т. нар. матраци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, вирусната суспензия се въвежда в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя свежа хранителна среда, обикновено без серум.

Клетките от повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани и се наричат вторични култури. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето откойто запазва оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. При серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат монослойни и суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдовес помощта на миксери. Има над 400 клетъчни линии, получени от 40 различни видовеживотни (включително от примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.

В изкуствени хранителни средипарчета могат да бъдат култивирани отделни телаи тъкани (органни култури). Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).

При заразени клетъчни културивирусите могат да бъдат открити чрез промяна в клетъчната морфология, цитопатично действие, което може да бъде специфично, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; определяне на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез откриване на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или клъстери от нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Изолирането на вируси е трудоемък и продължителен процес. Извършва се за определяне на типа или варианта на вируса, циркулиращ в популацията (например за идентифициране на сероварианта на грипния вирус, див или ваксинален щамполиомиелит и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за посочване на вируси в обекти околен свят. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вирус, получена от един вирион, се нарича вирусен клонинг, а процесът на получаването му се нарича клониране.

За изолиране на вируси се използва инфекция на податливи лабораторни животни, пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вируса обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация ( цитопатичен ефект), образуването на симпласти и синцитии, откриването на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит с помощта на имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (при хемаглутиниращи вируси) и др. Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.

За изолирането на редица вируси, като например грипните вируси, се използват пилешки ембриони, за изолирането на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси се използват новородени мишки. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични реакциии други методи.

При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на течността, съдържаща вируса, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на унищожени от вируса клетки на еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализинфекциозна активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна частица от вируса образува една плака. Плаките се идентифицират чрез оцветяване на културата с витални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират боята и затова се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици в 1 мл.

Пречистването и концентрирането на вирусите обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в градиенти на концентрация или плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.

Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременна диагностикавирусни инфекции се основава на експресни методи, които ви позволяват да получите отговор няколко часа след вземане на клиничен материал ранни датислед заболяването Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация, откриване на антитела от клас lgM и др.

Електронната микроскопия на отрицателно оцветени вируси позволява диференциране на вирусите и определяне на тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е достатъчно висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се прави разлика между вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този недостатък се елиминира чрез използване на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси, когато специфичен серум се добавя към вирусни частици, докато се получава едновременна концентрация на вирусни частици, което прави възможно тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За целите на експресната диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.

Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по отношение на чувствителността. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни вериги на ДНК или РНК (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта на молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.

Антителата от клас lgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антитела от клас lgM се откриват чрез имунофлуоресценция или използване ензимен имуноанализизползвайки анти-μ антисеруми (анти-lgM тежковерижни серуми).

Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методиизследване) : реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се подобряват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика, за да се определи увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема в първите дни след заболяването, вторият - след 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас lgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас lgC персистират няколко години, а понякога и цял живот.

За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел с последващ имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и дава възможност за идентифициране на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на ХИВ инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимен имуноанализ се дължат на наличието на антитела към клетъчни антигени, които са налице в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациенти срещу вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването, а при анализа на популациите - променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. страхотна ценаМетодът се състои във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличието на антигенни детерминанти.

20) Основен структурен компонентвириони(пълни вирусни частици) е нуклеокапсид, т.е. протеиновата обвивка (капсид), която обхваща вирусния геном (ДНК или РНК). Нуклеокапсидът на повечето вирусни семейства е заобиколен от липопротеинова обвивка. Между обвивката и нуклеокапсида при някои вируси (орто-, парамиксо-, рабдо-, фило- и ретровируси) има негликозилиран матричен протеин, който придава допълнителна твърдост на вирионите. Вирусите на повечето семейства имат обвивка, която играе важна роля в инфекциозността. Вирионите придобиват външния слой на обвивката, когато нуклеокапсидът проникне през клетъчната мембрана чрез пъпкуване. Протеините на обвивката се кодират от вируса, а липидите се заемат от клетъчната мембрана. Гликопротеините обикновено под формата на димери и тримери образуват пепломери (издатини) на повърхността на вирионите (орто-, парамиксовируси, рабдо-, фило-, корона-, буня-, арена-, ретровируси). Гликозилираните слети протеини са свързани с пепломери и играят ключова роля при навлизането на вируса в клетката. Капсидите и обвивките на вирионите се образуват от много копия на един или повече видове протеинови субединици в резултат на процес на самосглобяване. Взаимодействието в системата протеин-протеин поради слаб химически връзки, води до обединяването на симетрични капсиди. Разликите във вирусите във формата и размера на вирионите зависят от формата, размера и броя на структурните протеинови субединици и естеството на взаимодействието между тях. Капсидът се състои от много морфологично изразени субединици (капсомери), събрани от вирусни полипептиди по строго определен начин, в съответствие с относително прости геометрични принципи. Протеиновите субединици, свързващи се помежду си, образуват капсиди от два вида симетрия: изометрична и спирална. Структурата на нуклеокапсида на вирусите с обвивка е подобна на структурата на нуклеокапсида на вирусите без обвивка. На повърхността на обвивката на вирусите се разграничават морфологично изразени гликопротеинови структури - пепломери. Съставът на суперкапсидната мембрана включва липиди (до 20-35%) и въглехидрати (до 7-8%), които имат клетъчен произход. Състои се от двоен слой от клетъчни липиди и специфични за вируса протеини, разположени извън и вътре в липидния биослой. Външният слой на суперкапсидната обвивка е представен от пепломери (издатини) от един или повече видове, състоящи се от една или повече молекули гликопротеини. Нуклеокапсидът на вирусите с обвивка често се нарича ядро. централна частВирион, съдържащ нуклеинова киселина, се нарича нуклеоид. Капсомерите (пеплометри) се състоят от структурни звена изградени от една или повече хомоложни или хетероложни полипептидни вериги (протеинови субединици). класификация на вирусите Изометричните капсиди не са сфери, а правилни полиедри (икозаедри). Техните линейни размери са еднакви по осите на симетрия. Според Каспар и Клуг (1962), капсомерите в капсидите са подредени според икосаедрична симетрия. Такива капсиди се състоят от идентични субединици, образуващи икосаедър. Те имат 12 върха (ъгли), 30 лица и 20 повърхности под формата на равнобедрени триъгълници. В съответствие с това правило капсидът на вируса на полиомиелита и вируса на шапа се образува от 60 протеинови структурни единици, всяка от които се състои от четири полипептидни вериги. Икосаедърът оптимално решава проблема с опаковането на повтарящи се субединици в строга компактна структура с минимален обем. Само някои конфигурации на структурни субединици могат да образуват повърхностите, върховете и лицата на вирусния икосаедър. Например, структурните субединици на аденовируса образуват хексагонални капсомери (хексони) по повърхностите и лицата и петоъгълни капсомери (пептони) по върховете. При някои вируси и двата типа капсомери се образуват от едни и същи полипептиди, при други от различни полипептиди. Тъй като структурните субединици на различните вируси се различават една от друга, някои вируси изглеждат по-шестоъгълни, други по-сферични. Всички известни ДНК-съдържащи вируси на гръбначни животни, с изключение на вирусите на едра шарка, както и много РНК-съдържащи вируси (7 семейства) имат тип симетрия на кубичен капсид. Реовирусите, за разлика от другите гръбначни вируси, имат двоен капсид (външен и вътрешен), всеки от които се състои от морфологични единици. Вирусите със спирален тип симетрия имат формата на цилиндрична нишковидна структура, тяхната геномна РНК има формата на спирала и се намира вътре в капсида. Всички животински вируси със спирална симетрия са заобиколени от липопротеинова обвивка. Спиралните нуклеокапсиди се характеризират с дължина, диаметър, стъпка на спиралата и брой капсомери на завъртане на спиралата. И така, при вируса Сендай (парамиксовирус) нуклеокапсидът е спирала с дължина около 1 μm, диаметър 20 nm и стъпка на спиралата 5 nm. Капсидът се състои от приблизително 2400 структурни единици, всяка от които е протеин с молекулно тегло 60 kD. Има 11-13 субединици на завъртане на спиралата. При вируси със спирален тип нуклеокапсидна симетрия, нагъването на протеиновите молекули в спирала осигурява максимално взаимодействие между нуклеиновата киселина и протеиновите субединици. При икосаедричните вируси нуклеиновата киселина е навита вътре във вирионите и взаимодейства с един или повече полипептиди, разположени вътре в капсида.

Антирецептори (рецептори) Вирусни- повърхностни вирионни протеини, например хемаглутинин, които се свързват по комплементарен начин със съответния рецептор на чувствителна клетка.

21) Имунологични методи във вирусологичните изследвания.

Серологичните тестове се различават по способността си да откриват отделни класове антитела. Тестът за аглутинация, например, е добър за откриване на IgM антитела, но е по-малко чувствителен за откриване на IgG антитела. Тестовете за фиксиране на комплемента и хемолиза, които изискват комплемент, не откриват антитела, които не са свързани с комплемента, като IgA антитела и IgE антитела. Само антитела, насочени срещу антигенни детерминанти на повърхността на вириона, свързани с патогенността, участват в реакцията на неутрализация на вируса. Чувствителност I. m. и. превъзхожда всички други методи за изследване на антигени и антитела, по-специално радиоимуноанализът и ензимният имуноанализ позволяват да се установи наличието на протеин в количества, измерени в нанограми и дори в пикограми. С помощта на И. м. и. определяне на групата и проверка на безопасността на кръвта (хепатит В и HIV инфекция). При трансплантация на тъкани и органи на И. m. позволяват определяне на тъканна съвместимост и тестване на методи за потискане на несъвместимостта. В съдебната медицина реакцията на Кастелани се използва за определяне на видовата специфичност на протеина и реакцията на аглутинация за определяне на кръвната група.

Имунологичните методи се използват широко при лабораторна диагностикаинфекциозни заболявания. Етиологията на заболяването също се установява въз основа на увеличаването на антителата срещу патогена в кръвния серум на реконвалесцента в сравнение с пробата, взета в първите дни на заболяването. Въз основа на I. m. и. проучване на имунитета на населението по отношение на масови инфекции, като грип, и също така оценка на ефективността на превантивните ваксинации.

В зависимост от техния механизъм и отчитането на резултатите I. m. и. могат да бъдат разделени на реакции, основани на феномена на аглутинация; реакции, базирани на явлението утаяване; реакции, включващи комплемент; реакция на неутрализация; реакции, използващи химични и физични методи.

Реакции, основани на явлението аглутинация. Аглутинацията е залепването на клетки или отделни частици - носители на антиген с помощта на имунен серум към този антиген.

Тестът за бактериална аглутинация с помощта на подходящ антибактериален серум е един от най-простите серологични тестове. Суспензия от бактерии се добавя към различни разреждания на тествания кръвен серум и след определено време на контакт при t ° 37 ° се записва при кое най-високо разреждане на кръвния серум настъпва аглутинация. Реакцията на аглутинация на бактериите се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания: бруцелоза, туларемия, коремен тиф и паратиф, бациларна дизентерия и тиф.

Реакцията на пасивна или индиректна хемаглутинация (RPGA, RNGA). Използва еритроцити или неутрални синтетични материали (например латексови частици), върху повърхността на които са адсорбирани антигени (бактериални, вирусни, тъканни) или антитела. Тяхната аглутинация възниква, когато се добавят съответните серуми или антигени.

Тестът за пасивна хемаглутинация се използва за диагностициране на заболявания, причинени от бактерии ( Коремен тифи паратиф, дизентерия, бруцелоза, чума, холера и др.), протозои (малария) и вируси (грип, аденовирусни инфекции, вирусен хепатит B, морбили, енцефалит, пренасян от кърлежи, кримски хеморагична трескаи др.), както и за определяне на някои хормони, идентифициране свръхчувствителностболен да лекарстваи хормони като пеницилин и инсулин.

Тестът за инхибиране на хемаглутинацията (HITA) се основава на феномена на предотвратяване (инхибиране) на имунния серум на хемаглутинация на еритроцити от вируси и се използва за откриване и титриране на антивирусни антитела. Той служи като основен метод за серодиагностика на грип, морбили, рубеола, заушка, енцефалит, пренасян от кърлежи и други вирусни инфекции, чиито причинители имат хемаглутиниращи свойства. например, за серодиагностика на енцефалит, пренасян от кърлежи, двукратни разреждания на серума на пациента в алкален боратен буферен разтвор се изсипват в ямките на панела. След това се добавя определено количество, обикновено 8 AU (аглутиниращи единици), антиген на енцефалит, пренасян от кърлежи, и след 18 часа експозиция при t ° 4 ° се въвежда суспензия от гъши еритроцити, приготвена в кисел фосфатен буферен разтвор. Ако в кръвния серум на пациента има антитела срещу вируса на енцефалит, пренасян от кърлежи, тогава антигенът се неутрализира и аглутинацията на еритроцитите не настъпва.

Реакции, базирани на явлението утаяване. Преципитацията възниква в резултат на взаимодействието на антитела с разтворими антигени. Най-простият пример за реакция на утаяване е образуването на непрозрачна ивица на утаяване в епруветка на границата на наслояване на антиген върху антитяло. Широко използвани са различни видове реакции на утаяване в полутечен агар или агарозен гел (метод на двойна имунодифузия на Ouchterlon, метод на радиална имунодифузия, имуноелектрофореза), които са както качествени, така и количествени. В резултат на свободна дифузия в гела на антигени и антитела в зоната на тяхното оптимално съотношение се образуват специфични комплекси - преципитационни ленти, които се откриват визуално или чрез оцветяване. Характеристика на метода е, че всяка двойка антиген-антитяло образува индивидуална преципитационна лента и реакцията не зависи от наличието на други антигени и антитела в изследваната система.

Реакциите, включващи комплемента, който се използва като пресен серум на морско свинче, се основават на способността на субкомпонента на комплемента Clq и след това на други компоненти на комплемента да се прикрепят към имунните комплекси.

Реакцията на свързване на комплемента (CFR) позволява титруване на антигени или антитела според степента на фиксиране на комплемента от комплекса антиген-антитяло. Тази реакция се състои от две фази: взаимодействието на антигена с тестовия кръвен серум (тестова система) и взаимодействието на хемолитичния серум с еритроцитите на овен (индикаторна система). При положителна реакцияв изследваната система възниква фиксация на комплемента и след това, при добавяне на чувствителни към антитела еритроцити, не се наблюдава хемолиза. Реакцията се използва за серодиагностика на сифилис (реакция на Васерман), вирусни и бактериални инфекции.

Реакцията на неутрализация се основава на способността на антителата да неутрализират определени специфични функции на макромолекулни или разтворими антигени, като ензимна активност, бактериални токсини и патогенност на вируси. Реакцията на неутрализация на токсините може да се оцени чрез биологичния ефект, например се титруват антитетанични и антиботулинови серуми. Смес от токсин и антисерум, приложена на животни, не причинява тяхната смърт. Във вирусологията се използват различни варианти на реакцията на неутрализация. Когато вирусите се смесят с подходящ антисерум и тази смес се приложи на животни или клетъчни култури, патогенността на вирусите се неутрализира и животните не се разболяват, а клетките на културите не претърпяват разрушаване.

Реакции, използващи химични и физични етикети. Имунофлуоресценцията се състои в използването на белязани с флуорохром антитела, по-точно имуноглобулиновата фракция на IgG антителата. Антитяло, белязано с флуорохром, образува комплекс антиген-антитяло с антигена, който става достъпен за наблюдение под микроскоп в UV лъчи, които възбуждат луминесценцията на флуорохрома. Реакцията на директна имунофлуоресценция се използва за изследване на клетъчни антигени, откриване на вирус в заразени клетки и откриване на бактерии и рикетсии в цитонамазки.

По-широко се използва методът на индиректната имунофлуоресценция. се основава на откриването на комплекс антиген-антитяло с помощта на луминесцентни анти-lgG антитяло серуми и се използва за откриване не само на антигени, но и за титруване на антитела.

Имуноензимните или ензимните имунологични методи се основават на използването на антитела, конюгирани с ензими, главно пероксидаза от хрян или алкална фосфатаза. Подобно на имунофлуоресценцията, ензимният имуноанализ се използва за откриване на антигени в клетки или за титриране на антитела върху клетки, съдържащи антиген.

Радиоимунологичният метод се основава на използването на радиоизотопно маркиране на антигени или антитела. Това е най-чувствителният метод за определяне на антигени и антитела, използва се за определяне на хормони, лекарствени веществаи антибиотици, за диагностика на бактериални, вирусни, рикетсиални, протозойни заболявания, изследване на кръвни протеини, тъканни антигени.

Имуноблотингът се използва за откриване на антитела срещу отделни антигени или за "разпознаване" на антигени от известни серуми. Методът се състои от 3 етапа: разделяне на биологични макромолекули (например вирус) на отделни протеини чрез електрофореза в полиакриламиден гел; прехвърляне на отделените протеини от гела върху твърда подложка (блот) чрез нанасяне на полиакриламидна гелна плоча върху активирана хартия или нитроцелулоза (електроблот); откриване на желаните протеини върху субстрата чрез директен или индиректен ензимен имуноанализ. Като диагностичен метод, имуноблотингът се използва за HIV инфекция. Диагностичната стойност е откриването на антитела към един от протеините на външната обвивка на вируса.

22) Типове симетрия на вируси (кубични, спирални, смесени). Взаимодействие на протеини и нуклеинови киселини в опаковката на вирусни геноми.

В зависимост от взаимодействието на капсида с нуклеиновата киселина, вирусните частици могат да бъдат разделени на няколко вида симетрия:

1). Тип кубична симетрия.

Кубичните капсиди са икосидери с приблизително 20 триъгълни повърхности и 12 върха. Те образуват структура, наподобяваща сферична формация, но всъщност това е полиедър. В някои случаи към върховете на такива икосаедрични полиедри са прикрепени специални липопротеинови образувания, наречени шипове. Ролята на тези шипове вероятно се свежда до взаимодействието на вириони или вирусни частици със съответните области на клетките гостоприемници, които са чувствителни към тях. С кубична симетрия, вирусната нуклеинова киселина е опакована плътно (навита на топка), а протеиновите молекули я обграждат, образувайки полиедър (икозаедър). Икосаедърът е многостен с двадесет триъгълни лица, който има кубична симетрия и приблизително сферична форма. Икосаедричните вируси включват херпес симплекс вирус, реовируси и др.

2). Тип спирала на симетрия. Спиралните капсиди са малко по-прости. Тези. Капсомерите, които изграждат капсида, покриват спиралната NK и също така образуват доста стабилна протеинова обвивка на тези вируси. И когато се използват електронни микроскопи с висока разделителна способност и подходящи методи за подготовка, могат да се видят спирални структури върху вирусите. При спирална симетрия на капсида, вирусната нуклеинова киселина образува спирална (или спирална) фигура, куха отвътре, а протеиновите субединици (капсомери) също са подредени около нея в спирала (тръбен капсид). Пример за вирус със спирална симетрия на капсида е вирусът на тютюневата мозайка, който има пръчковидна форма и дължината му е 300 nm с диаметър 15 nm. Съставът на вирусна частица включва една РНК молекула с размер около 6000 нуклеотида. Капсидът е изграден от 2000 идентични протеинови субединици, подредени в спирала.

3). Смесени или сложен типсиметрия. По правило този тип симетрия се среща главно сред бактериалните вируси. И класически примери са тези фаги, E. coli или умерените фаги. Това са сложни образувания, които имат глава с вътрешно нуклеиново съдържание, различни видове придатъци, опашен процес, различни степенисложност на устройството. И всеки компонент на такива частици е надарен със специфична функция, която се реализира в процеса на взаимодействие между вируса и клетката. С други думи, сложен тип симетрия е комбинация от кубична симетрия, главата е икозиден полиедър и пръчковидни образувания са опашните процеси. Въпреки че сред бактериалните вируси има и доста просто организирани вириони, които са примитивни нуклеокапсиди, сферични или кубични. Бактериалните вируси са по-сложни от растителните и животинските вируси.

24) Взаимодействие на фаг с клетка. Вирулентни и умерени фаги.

Адсорбция.

Взаимодействието започва с прикрепването на вирусните частици към клетъчната повърхност. Процесът става възможен при наличие на подходящи рецептори на повърхността на клетката и антирецептори на повърхността на вирусната частица.

Вирусите използват клетъчни рецептори, предназначени да транспортират основни вещества: хранителни частици, хормони, растежни фактори и др.

Рецептори: протеини, въглехидратен компонент на протеини и липиди, липиди. Специфични рецептори определят по-нататъшната съдба на вирусната частица (транспорт, доставка до области на цитоплазмата или ядрото). Вирусът може да се прикрепи към неспецифични рецептори и дори да проникне в клетката. Този процес обаче не причинява инфекция.

Първоначално се образува единична връзка между антирецептора и рецептора. Тази връзка е крехка и може да се скъса. За образуването на необратима адсорбция е необходимо многовалентно прикрепване. Стабилното свързване възниква поради свободното движение на рецепторните молекули в мембраната. По време на взаимодействието на вируса с клетката се наблюдава повишаване на течливостта на липидите и образуването на рецепторни полета в зоната на взаимодействие между вируса и клетката. Рецепторите на редица вируси могат да присъстват само в ограничен набор от клетки гостоприемници. Това определя чувствителността на организма към този вирус. По този начин вирусната ДНК и РНК имат способността да инфектират по-широк кръг от клетки гостоприемници.

Антирецепторите могат да бъдат намерени в уникални вирусни органели: израстъчни структури в Т-бактериофагите, влакна в аденовирусите, шипове на повърхността на вирусните мембрани, корона в коронавирусите.

Проникване.

2 механизма - рецепторна ендоцитоза и мембранно сливане.

Рецепторна ендоцитоза:

Обичайният механизъм за навлизане на хранителни и регулаторни вещества в клетката. Среща се в специализирани зони - там, където има специални ями, покрити с клатрин, специфични рецептори са разположени на дъното на ямата. Ямките осигуряват бърза инвагинация и образуване на вакуоли, покрити с клатрин (от момента на адсорбция не минават повече от 10 минути, за една минута могат да се образуват до 2000 вакуоли). Вакуолите се сливат с по-големи цитоплазмени вакуоли, за да образуват рецепторозоми (вече не съдържащи клатрин), които на свой ред се сливат с лизозоми.

Сливане на вирусни и клетъчни мембрани:

При вирусите с обвивка сливането се дължи на точкови взаимодействиявирусен протеин с липиди на клетъчната мембрана, в резултат на което вирусната липопротеинова обвивка се интегрира с клетъчната мембрана. При вирусите без обвивка един от повърхностните протеини също взаимодейства с липидите. клетъчни мембраниа вътрешният компонент преминава през мембраната (при парамиксовирусите - F-протеин, при ортомиксовирусите - НА2 хемаглутинираща субединица). Конформацията на повърхностните протеини се влияе от pH.

Лента.

В този процес инфекциозната активност изчезва, често се появява чувствителност към нуклеази и възниква резистентност към антитела. Крайният продукт от събличането са нуклеинови киселини, свързани с вътрешен вирусен протеин. Етапът на събличане също ограничава възможността за инфекция (вирусите не могат да се съблекат във всяка клетка). Събличането се извършва в специализирани области на клетката: лизозоми, апарат на Голджи и перинуклеарно пространство.

Събличането става в резултат на поредица от реакции. Например при пикорнавирусите събличането протича с образуването на междинни субвирусни частици с размери от 156 до 12S. В аденовирусите в цитоплазмата и ядрените пори има най-малко 3 етапа:

Образуване на субвирусни частици с по-висока плътност от вирионите;

Образуване на ядра, в които липсват 3 вирусни протеина;

Образуване на ДНК-протеинов комплекс, в който ДНК е ковалентно свързана с краен протеин.

Характеризиране на вирулентни и умерени фаги.

Когато една бактерия е заразена с фаг, възниква така наречената литична инфекция, т.е. инфекция, която завършва с лизиране на клетката гостоприемник, но това е характерно само за така наречените вирулентни фаги, чието взаимодействие с клетката води до клетъчна смърт и образуване на фагово потомство.

В този случай се разграничават следните етапи според взаимодействията на фага с клетката: смесване на фага с клетъчната култура (множествеността на инфекцията е 1 фаг на 10 клетки), като концентрацията трябва да бъде достатъчно висока, така че фагите могат да контактуват с клетките. За да се избегне повторна инфекция - след заразяване за максимум 5 минути, когато фагите се адсорбират - тази смес от клетки с фаг се разрежда. Различава се латентен период, през който количеството на фага не се увеличава, а след това много кратък периодизход, когато броят на фаговите частици се увеличи рязко, когато клетката се лизира и фаговото потомство се освобождава и след това броят на фагите остава на същото ниво, тъй като не настъпва повторна инфекция. Въз основа на тази крива могат да се разграничат тези фази: вегетативният период на "растеж" (латентен период), изходният период и да се изчисли добивът на фаг на 1 заразена клетка. По време на латентния период в бактериите не може да се намери нищо подобно на фагови частици и не е възможно да се изолира инфекциозният принцип от такива клетки в латентния период. Само зрели фагови частици могат да заразят бактериите. По този начин вирулентните фаги винаги причиняват смъртта на бактериите и предизвикват инфекция, която се разкрива в производството на нови вирусни частици, способни да заразят следващите и други чувствителни клетки.

За разлика от вирулентните, инфекцията с умерени фаги не води до лизиране на бактериални клетки, но се осъществява образуването на специално състояние на съвместно съществуване на фаг с бактериална клетка. Това съвместно съществуване се изразява в това, че определено начало на фага присъства в бактериалната клетка без неблагоприятни условия за това и се запазва от поколение на поколение. На определени етапи от такова съвместно съществуване фагът се активира в клетката и влиза в състояние на литичен цикъл на развитие, причинявайки клетъчен лизис и освобождаване на фагово потомство. Такива фаги се наричат лизогенни или умерени фаги, а състоянието на умерено съществуване с фага е лизогения, а бактериите, които съдържат такъв латентен фаг, се наричат лизогенни бактерии. Терминът лизогенни бактерии идва от факта, че веднъж са открити култури, в които спонтанно се появява фаг, и този бактериофаг започва да се счита за замърсяване на културата, тоест бактериален вирус навлиза в културата и такива култури се наричат лизогенни, тоест, те генерират лизис.

Вирусологични методи на изследване- методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, как те проникват в клетката и характеристиките на възпроизвеждането на вируси, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и протеините, които те кодират, с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в е-вирусната инфекция.

Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект, образуване на вътреклетъчни включвания и др.) .

Клетките от повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани и се наричат вторични култури. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. При серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат монослойни и суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на бъркалки. Има над 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.

Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да се култивират в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).

В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промяна в клетъчната морфология, цитопатично действие, което може да бъде специфично, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; определяне на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез откриване на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или клъстери от нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Изолирането на вируси е трудоемък и продължителен процес. Провежда се, за да се определи вида или варианта на вируса, циркулиращ сред популацията (например, за идентифициране на сероварианта на вирус а, див или ваксинален щам на вирус а и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вирус, получена от един вирион, се нарича вирусен клонинг, а процесът на получаването му се нарича клониране.

образуването на симпласти и синцитии, откриването на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (при хемаглутиниращи вируси) и др. Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.

За изолирането на редица вируси, например вируси а, се използват пилешки ембриони, за изолирането на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси - новородени мишки. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични тестове и други методи.

При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на течността, съдържаща вируса, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на унищожени от вируса клетки на еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се идентифицират чрез оцветяване на културата с витални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират боята и затова се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици в 1 мл.

Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусни инфекции се основава на експресни методи, които ви позволяват да получите отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните етапи след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия,

както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация, откриване на антитела от клас lgM и др.

Антителата от клас lgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антитела от клас IgM се откриват чрез имунофлуоресценция или ензимен имуноанализ, като се използват анти-m антисеруми (анти-IgM тежковерижни серуми).

Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методи на изследване ): реакции на фиксиране на комплемента

инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се подобряват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика, за да се определи увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема в първите дни след заболяването, вторият - след 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас lgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас lgC персистират няколко години, а понякога и цял живот.

За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел с последващ имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и дава възможност за идентифициране на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на HIV инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимен имуноанализ се дължат на наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациенти срещу вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването, а при анализа на популациите - променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.

Библиография:Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методи, изд. Б. Мейхи, прев. от англ., М., 1988; Ръководство за микробиологични и вирусологични методи на изследване, изд. М.О. Биргер, М., 1982.

Вирусологичните изследвания са изследвания, предназначени за изолиране на вируси и изследване на техните свойства, както и за установяване на етиологичната връзка на вирусите с определени заболявания.

Материалът за изследването се взема в зависимост от местоположението на преобладаващите вируси в тялото на пациента и от начините, по които те се изолират по време на външна среда. Материалът се събира в стерилна чиния, доставя се в лабораторията възможно най-бързо и се съхранява до замразяване на изследването или върху лед. Преди употреба материалът за изолиране на вируса се обработва (и) за потискане на чуждата микрофлора и се подлага на отстраняване на големи частици.

Изолирането на вируси се извършва чрез заразяване на лабораторни животни, пилешки ембриони, тъканна култура с вируссъдържащ материал. Изборът на метод за изолиране зависи от предполагаемия причинител на заболяването. Така че тъканните култури (вижте) се използват при работа с вируси, които не са патогенни за лабораторни животни, или когато се откриват в тъканна култура по-рано, отколкото когато животните са заразени. Пилешките ембриони се заразяват, за да се изолират патогени, инфекциозен паротит (в амниотичната и алантоичната кухина), (в жълтъчна торбичка), едра шарка (върху хориоалантоисната мембрана).

От лабораторните животни най-често за изолиране на вируса се използват бели мишки, следвани от зайци, плъхове, морски свинчета, маймуни. За арбовирусите най-ефективното въвеждане на вируссъдържащ материал в главата или, за пневмотропните вируси - върху лигавицата респираторен тракт, за вируси на едра шарка, върху скарифицираната роговица.

Изолирането на вируси е най-ефективно в острия период на заболяването. Съществен момент при установяване на вирусния характер на заболяването са резултатите серологични изследваниясеруми, взети многократно от един и същ пациент в началото на заболяването и по време на възстановяване. Откриването на антитела срещу изолирани вируси във втория серум в титър 4 или повече пъти по-висок от първия показва етиологичната връзка на вирусите с това заболяване.

Рано и бърз методоткриването на вирусни антигени е метод на флуоресцентни антитела, базиран на специфичното фиксиране на антитела, маркирани с флуорохром върху повърхността на антигена. Антигенът лесно се открива при луминесцентна микроскопия (виж) благодарение на ярката флуоресценция на антителата, адсорбирани върху антигена. Използвайки метода на флуоресцентните антитела, се изследват намазки, взети от пациенти, хистологични срезове от засегнати тъкани, препарати от тъканна култура. Също така се прилага за откриване на елементарни тела (вириони) (виж). От другите морфологични методи се използват тези, които откриват вътреклетъчни вирусни включвания в участъци от засегнатите органи и тъкани. Откриването на включвания показва инфекция и в някои случаи допринася за диагнозата. вирусно заболяване. Използват се различни методи за откриване на вирусни антитела в кръвта на пациентите и за изследване на антигенната структура на вирусите. Реакцията на неутрализация се използва при почти всички вирусни инфекции. Основава се на способността на имунните антитела да неутрализират инфекциозните свойства на вирусите, когато сместа се въведе в тялото на възприемчиви животни или в тъканна култура. За да се определи индексът на неутрализация, постоянна доза серум се смесва с различни разреждания на вируси и за определяне на титъра на антителата - различни разрежданиясерум с постоянна доза вируси. Контролът е заразяване на животни (или тъканни култури) със смес от вируси с нормален серум или с физиологичен разтвор. Реакцията на неутрализация е настроена не само за откриване на антитела, но и за определяне на вида и вида на вирусите.

Реакцията на фиксиране на комплемента [например реакция на Borde - Zhangu (виж)] се използва за откриване както на вирусни антигени, така и на антитела. В първия случай известният имунен серум взаимодейства с материала, в който се предполага наличието на антигени: кръвен серум, назофарингеални тампони, тъканни екстракти от заразения организъм. Във втория случай, известен антиген (diagnosticum) и серум на пациента или реконвалесцента.

RSK се използва за диагностициране на заболявания, причинени от грип, едра шарка, аденовируси и арбовируси.

Вирусологичен методвключва два основни етапа: изолиране на вируси и тяхното идентифициране. Материали могат да бъдат кръв, други биологични и патологични течности, биопсии на органи и тъкани.

Често се извършва вирусологично кръвно изследване за диагностициране на арбовирусни инфекции. В слюнката могат да бъдат открити вируси на бяс, паротит и херпес симплекс. Назофарингеалните тампони се използват за изолиране на патогени на грип и други остри респираторни вирусни инфекции, морбили. В промивките от конюнктивата се откриват аденовируси. От изпражненията се изолират различни ентеро-, адено-, рео- и ротавируси.

За изолиране на вируси се използват клетъчни култури, пилешки ембриони и понякога лабораторни животни. Повечето патогенни вируси се отличават с наличието на тъканна и типова специфичност, "например полиовирусът се възпроизвежда само в клетки на примати, следователно се използва подходяща тъканна култура за изолиране на специфичен вирус. За да се изолира неизвестен патоген, препоръчително е едновременно инфектират 3-4 клетъчни култури, като се предполага, че една от тях може да бъде чувствителна. Наличието на вируса в заразените култури се определя от развитието на специфична клетъчна дегенерация, т.е. цитопатогенен ефект, откриване на вътреклетъчни включвания, както и въз основа на откриването на специфичен антиген чрез имунофлуоресценция, положителни реакции на хемадсорбция и хемаглутинация. Ембрионите на птиците с техните слабо диференцирани тъкани са подходящи за култивиране на много вируси. Най-често се използват пилешки ембриони. Когато се размножават в ембриони, вирусите могат да причинят тяхната смърт ( арбовируси), появата на промени в хорион-алантоисната мембрана (поксвируси) или в тялото на ембриона, натрупани т.е. в ембрионалните течности на хемаглутинини (грипни вируси, паротит) и вирусен антиген, фиксиращ комплемента.

Вирусите се идентифицират с помощта на имунологични методи: инхибиране на хемаглутинацията, фиксиране на комплемента, неутрализация, утаяване в гел, имунофлуоресценция.

3.4 Биологичен метод

биологичен методсе състои в заразяване на лабораторни животни с различен материал (клиничен, лабораторен), за да се посочи патогенът, както и да се определят определени свойства на микроорганизмите, които характеризират тяхната патогенност (токсигенност, токсичност, вирулентност). Като лабораторни животни се използват бели мишки, бели плъхове, морски свинчета, зайци и др.

Възпроизвеждането на болестта при животно е абсолютно доказателство за патогенността на изолирания микроорганизъм (при бяс, тетанус и др.). Следователно, биологичният тест върху животни е ценен и надежден диагностичен метод, особено за тези инфекции, чиито патогени се намират в ниски концентрации в изследваната биологична среда на човешкото тяло и растат слабо или бавно върху изкуствена среда.

3.5 Имунологичен метод

Имунологичен метод(серологичен) включва изследвания на кръвен серум, както и други биологични субстрати за откриване на специфични антитела и антигени. Класическата серодиагностика се основава на определянето на антитела срещу идентифициран или предполагаем патоген. Положителният резултат от реакцията показва наличието в тествания кръвен серум на антитела срещу антигените на патогена, отрицателният резултат показва липсата на такива. Откриването на антитела срещу причинителя на редица инфекциозни заболявания в изследвания кръвен серум не е достатъчно за поставяне на диагноза, тъй като може да отразява наличието на постинфекциозен или постваксинален имунитет, следователно „сдвоена“ кръв изследват се серуми, като първият се взема в първите дни на заболяването, а вторият - през интервал от 7-10 дни. В този случай се оценява динамиката на повишаване на нивото на антителата.

Диагностично значимо увеличение на титъра на антителата в изследвания кръвен серум е поне 4 пъти спрямо първоначалното ниво. Това явление се нарича сероконверсия. При редки инфекциозни заболявания, както и вирусен хепатит, HIV инфекция и някои други, наличието на антитела показва, че пациентът е заразен и има диагностична стойност.

В допълнение към определянето на титъра на антителата, серологичните изследвания могат да определят изотипа на антителата. Известно е, че при първата среща на човешкото тяло с патоген в острия период на заболяването се открива по-бързо нарастване на антителата, принадлежащи към IgM, чието ниво, достигайки максимална стойност, след това намалява. В по-късните стадии на заболяването се увеличава броят на IgG антителата, които се запазват по-дълго и се определят в периода на възстановяване. При повторна среща с патогена, поради имунологичната памет, реакциите на хуморалния имунитет се проявяват чрез по-бързо производство на IgG антитела и антитела от клас М се произвеждат в малки количества. Откриването на IgM антитела показва наличието на течение инфекциозен процес, а наличието на IgG антитела - за прекарана инфекция или следваксинален имунитет.

Като се имат предвид характеристиките на първичния и вторичния имунен отговор, анализът на съотношението на IgM- и IgG-антитела позволява в някои случаи да се разграничи етапът на инфекциозния процес (размах на заболяването, реконвалесценция, рецидив). Например, в случай на вирусен хепатит А (НА), надежден диагностичен метод е определянето на анти-HAV IgM антитела в кръвния серум. Откриването им показва текуща или скорошна HAV инфекция.

Серологично изследване за откриване на антитела в инфекциозни заболяванияе повече достъпен методлабораторна диагностика, отколкото изолирането на патогена. Понякога положителната серологична реакция е единственото доказателство за срещата и взаимодействието на организма с причинителя на съответното инфекциозно заболяване. В допълнение, редица заболявания с подобна клинична картина (например рикетсиоза, ентеровирусни инфекции) могат да бъдат диференцирани само серологично, което отразява значението на серологичните методи при диагностицирането на инфекциозни заболявания.

Дял: